肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变检测文库的构建方法与流程

本发明涉及一种用于高通量测序检测的肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变文库的构建方法。

背景技术：

随着多学科综合治疗的发展及早期筛查的推广，近30年来癌症死亡率呈现持续下降，然而，系统治疗相关的脏器损伤发生率持续升高。随着肿瘤患者生存期延长，心血管疾病俨然已成为第二大致死病因。心血管事件可能对肿瘤患者生存及生活质量构成重大风险。早期乳腺癌的5年生存率已经从79％提高到88％。据报道，心血管死亡率可能成为乳腺癌患者10年后的主要死因。许多研究显示，大约75％诊断乳腺癌且存活10年的患者，治疗心脏疾病有利于延长患者的总生存。传统化疗药物以及肿瘤靶向药物，常常可引起包括左室功能减退、心力衰竭、高血压、血管痉挛、血栓相关性心肌缺血、qt间期延长等心血管事件。严重的qt间期延长又可以导致室性心律失常的发生。心脏毒性具有不同的临床表现：接受蒽环类药物所致心脏毒性表现为持续的和不可逆的心肌损伤，接受曲妥珠单抗治疗所致心脏毒性表现为可逆性心脏功能受损。因此，肿瘤系统治疗面临的挑战不仅仅是选择最优的方案，同时还需兼顾降低治疗过程中对重要靶器官(譬如心脏)的损伤。

蒽环类相关心脏毒性呈剂量依赖性，通过诱发活性氧介导的铁依赖性化学反应即心肌氧化应激，导致心肌细胞损伤和进行性肌细胞丢失，导致左心室壁变薄，增加后负荷，减少收缩。心肌抑制作用还可能与拓扑异构酶有关，特别是拓扑异构酶iiβ(top2β)，top2β在心肌细胞中表达，介导蒽环类药物诱导的心肌病，通过各种途径引发细胞死亡。急性心脏毒性为心电图变化和/或心律失常。慢性心脏毒性主要表现为左心室射血分数降低，蒽环类药物所致心力衰竭发生率为3-30％，死亡率高达72％。这类药物仍然是癌症治疗后心血管发病率和死亡率的主要原因。乳腺癌治疗的众多靶向药物中，目前曲妥珠单抗对心脏功能的影响研究较为明确，25％乳腺癌患者过表达her-2基因，曲妥珠单抗治疗使乳腺癌复发率降低50％、死亡率降低30％，但同时也提高了3.9％的心衰事件发生率。心脏收缩功能下降是主要心脏毒性，心力衰竭和心血管死亡事件发生率<1％和<0.5％。其影响心脏功能的作用机制可能与直接抑制心肌细胞表面的erbb2相关。不同于蒽环类药物，曲妥珠单抗引起的心脏功能障碍多数是可逆的。

临床中观察到有些患者可耐受较高剂量的蒽环类药物而未表现出心脏毒性，而有些患者耐受剂量不足阈值的一半即表现严重心脏毒副反应，为什么一些个体对蒽环类药物的心脏毒性特别敏感，以及如何识别哪些患者更容易受到药物诱导的氧化损伤和细胞凋亡尚不清楚。超声心动图用于监测左心射血分数及心肌应变率，左室射血分数<50％或者比基础值低10％以上，可能提示患者发生心脏毒性的风险明显增高。心脏相关标记物尤其是肌钙蛋白用于监测、评估肿瘤治疗过程中心肌损伤的情况。但在临床实践当中，尚缺乏有效的预测因子判断患者对蒽环类药物的耐受性和药物反应性。如何筛选更敏感且能够耐受其毒性的患者接受治疗，是目前临床实践的一大挑战。药物不良效应的出现也是癌症治疗失败的主要原因。表观遗传和基因组的多态性与肿瘤治疗疗效相关联，单核苷酸多态性(snp)是最常见的引起肿瘤特异性的表现形式，大多数患者疗效间的差异和毒性差异产生于snp的遗传变异，其影响抗癌药物代谢通路和化疗药物代谢酶的靶基因。随着全基因组的研究进展，越来越多与药物代谢酶活性相关的基因位点多态性在不同的人群中得以证实。因此，研究药物代谢酶基因的多态性，探讨其在疗效预测及毒性反应的价值，也是个体化治疗的重要探索方向。基因库的建立有助于更密切的监测，帮助建立基因组评分改善药物有效性预测系统，鉴定高风险患者从而提供更安全的治疗方案。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种用于高通量测序检测的肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变检测文库的构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变检测文库的构建方法，覆盖人类基因ugt1a6、fancd2、abcc5、pik3r1、slc22a7、vegf、gsta1、slc22a16、abcb1、cyp3a5、cyp3a4、slc28a3、esr2、akr1c3、cyp2c8、abcc2、cat、gstp1、slco1b3、rarg、slc22a17、tcl1a、mrp1、abcc1、nqo1、cyba、her2、raptor、cyp2b6、cbr1、ncf4、rac2、cyp2d6、cbr3、nos3、esr1、celf4和dpd上的总共56种遗传性变异位点，具体包括如下步骤：

(1)针对目的基因ugt1a6、fancd2、abcc5、pik3r1、slc22a7、vegf、gsta1、slc22a16、abcb1、cyp3a5、cyp3a4、slc28a3、esr2、akr1c3、cyp2c8、abcc2、cat、gstp1、slco1b3、rarg、slc22a17、tcl1a、mrp1、abcc1、nqo1、cyba、her2、raptor、cyp2b6、cbr1、ncf4、rac2、cyp2d6、cbr3、nos3、esr1、celf4和dpd设计基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个t，且该2～5个t的靠近3’端的第一个t具有pna修饰，同时该基本扩增引物组的tm值相差不超过1℃；

(2)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有ringcap-taq酶的pcr反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将扩增产物、多对第一不对称连接探针、通用引物和上述ringcap-taq酶混合进行pcr，纯化后获得文库产物；

(3)将文库产物组成所述用于高通量测序的肿瘤基因变异文库；

上述ringcap-taq酶由taq酶、dna连接酶和dna末端修饰酶组成。

作为本发明的一种优选方案，所述基本扩增引物组包括zq-xz-ugt1a6-1-f、zq-xz-ugt1a6-1-r、zq-xz-fancd2-2-f、zq-xz-fancd2-2-r、zq-xz-fancd2-1-f、zq-xz-fancd2-1-r、zq-xz-abcc5-1-f、zq-xz-abcc5-1-r、zq-xz-abcc5-2-f、zq-xz-abcc5-2-r、zq-xz-pik3r1-1-f、zq-xz-pik3r1-1-r、zq-xz-slc22a7-1-f、zq-xz-slc22a7-1-r、zq-xz-vegf-1-f、zq-xz-vegf-1-r、zq-xz-gsta1-1-f、zq-xz-gsta1-1-r、zq-xz-slc22a16-1-f、zq-xz-slc22a16-1-r、zq-xz-abcb1-2-f、zq-xz-abcb1-2-r、zq-xz-abcb1-3-f、zq-xz-abcb1-3-r、zq-xz-abcb1-4-f、zq-xz-abcb1-4-r、zq-xz-abcb1-1-f、zq-xz-abcb1-1-r、zq-xz-cyp3a5-1-f、zq-xz-cyp3a5-1-r、zq-xz-cyp3a5-2-f、zq-xz-cyp3a5-2-r、zq-xz-cyp3a4-1-f、zq-xz-cyp3a4-1-r、zq-xz-cyp3a4-2-f、zq-xz-cyp3a4-2-r、zq-xz-slc28a3-1-f、zq-xz-slc28a3-1-r、zq-xz-esr2-1-f、zq-xz-esr2-1-r、zq-xz-akr1c3-1-f、zq-xz-akr1c3-1-r、zq-xz-cyp2c8-2-f、zq-xz-cyp2c8-2-r、zq-xz-cyp2c8-1-f、zq-xz-cyp2c8-1-r、zq-xz-abcc2-1-f、zq-xz-abcc2-1-r、zq-xz-abcc2-2-f、zq-xz-abcc2-2-r、zq-xz-cat-1-f、zq-xz-cat-1-r、zq-xz-gstp1-1-f、zq-xz-gstp1-1-r、zq-xz-slco1b3-1-f、zq-xz-slco1b3-1-r、zq-xz-rarg-1-f、zq-xz-rarg-1-r、zq-xz-slc22a17-1-f、zq-xz-slc22a17-1-r、zq-xz-tcl1a-3-f、zq-xz-tcl1a-3-r、zq-xz-tcl1a-4-f、zq-xz-tcl1a-4-r、zq-xz-tcl1a-1-f、zq-xz-tcl1a-1-r、zq-xz-tcl1a-2-f、zq-xz-tcl1a-2-r、zq-xz-mrp1-1-f、zq-xz-mrp1-1-r、zq-xz-mrp1-2-f、zq-xz-mrp1-2-r、zq-xz-abcc1-3-f、zq-xz-abcc1-3-r、zq-xz-abcc1-1-f、zq-xz-abcc1-1-r、zq-xz-abcc1-2-f、zq-xz-abcc1-2-r、zq-xz-nqo1-1-f、zq-xz-nqo1-1-r、zq-xz-cyba-1-f、zq-xz-cyba-1-r、zq-xz-her2-2-f、zq-xz-her2-2-r、zq-xz-her2-1-f、zq-xz-her2-1-r、zq-xz-raptor-1-f、zq-xz-raptor-1-r、zq-xz-cyp2b6-1-f、zq-xz-cyp2b6-1-r、zq-xz-cbr1-1-f、zq-xz-cbr1-1-r、zq-xz-ncf4-1-f、zq-xz-ncf4-1-r、zq-xz-rac2-1-f、zq-xz-rac2-1-r、zq-xz-cyp2d6-1-f、zq-xz-cyp2d6-1-r、zq-xz-cbr3-1-f、zq-xz-cbr3-1-r、zq-xz-nos3-1-f、zq-xz-nos3-1-r、zq-xz-esr1-1-f、zq-xz-esr1-1-r、zq-xz-celf4-1-f、zq-xz-celf4-1-r、zq-xz-dpd-1-f、zq-xz-dpd-1-r、zq-xz-dpd-2-f、zq-xz-dpd-2-r、zq-xz-dpd-3-f和zq-xz-dpd-3-r，其序列依次如seqid01～seqid112所示。

作为本发明的一种优选方案，jer-2基因引物名称：zq-xz-her2-1-f，序列信息ttttgggtcaccttctcttgaccttt；zq-xz-her2-1-r，序列信息ttttaaaggcaaaaacgtctttgacga；zq-xz-her2-2-f，序列信息tttttccgaatgccaaacaccttca；zq-xz-her2-2-r，序列信息ttttgatgaggatcccaaa；

cyp3a5基因引物名称：zq-xz-cyp3a5-1-f，序列信息ttttatgtcaagaaagcagttatttttaa；zq-xz-cyp3a5-1-r，序列信息ttttttactggcacatca；

abcb1基因引物名称：zq-xz-abcb1-1-f，序列信息tttttctgcatcagctggactgttg；zq-xz-abcb1-1-r，序列信息ttttacctagtgaacagtcag；

cyp2c8基因引物名称：zq-xz-cyp2c8-1-f，序列信息ttttggtcaatgacgcagagtagagtc；zq-xz-cyp2c8-1-r，序列信息ttttatttccagcaatggaaagagatg；

cyba基因引物名称：zq-xz-cyba-1-f，序列信息ttttgcccgaacatagtaattcctggt；zq-xz-cyba-1-r，序列信息ttttgtggtcagcag；

vegf基因引物名称：zq-xz-vegf-1-f，序列信息ttttcccaaatcactgtggattttgga；zq-xz-vegf-1-r，序列信息ttttccaaaagcaggtcactcactt；

rac2基因引物名称：zq-xz-rac2-1-f，序列信息ttttgaccatgttttcatctagtgcct；zq-xz-rac2-1-r，序列信息tttttggtctctgggttccttgaatg；

nqo1基因引物名称：zq-xz-nqo1-1-f，序列信息ttttggctgcttggagcaaaatacag；zq-xz-nqo1-1-r，序列信息tttttgtatcctcagagtggcattctg；

gstp1基因引物名称：zq-xz-gstp1-1-f，序列信息ttttagtgactgtgtgttgatcaggc；zq-xz-gstp1-1-r，序列信息ttttagatgctcacatagttggtgtagatg；

cyp2d6基因引物名称：zq-xz-cyp2d6-1-f，序列信息ttttctcacggctttgtccaagaga；zq-xz-cyp2d6-1-r，序列信息ttttgtgatgggcagaagggcacaaag；

cyp3a5基因引物名称：zq-xz-cyp3a5-2-f，序列信息ttttcacagcaaccttaggttctagttca；zq-xz-cyp3a5-2-r，序列信息ttttgaatgctctactgtcatttctaaccat；

cyp3a4基因引物名称：zq-xz-cyp3a4-1-f，序列信息tttttatgcatgcaacaggaaacccaca；zq-xz-cyp3a4-1-r，序列信息ttttaggtaggtctaattcagttcagtgtct；

cyp2c8基因引物名称：zq-xz-cyp2c8-2-f，序列信息ttttaaatggaaacgagtttctattacctgc；zq-xz-cyp2c8-2-r，序列信息tttttacttccagggcacaaccataatg；

cyp3a4基因引物名称：zq-xz-cyp3a4-2-f，序列信息ttttggagccattggcataaaatctattaaat；zq-xz-cyp3a4-2-r，序列信息ttttgtttggaaggatgtgtaggagtctt；

mrp1基因引物名称：zq-xz-mrp1-1-f，序列信息ttttccttccctgaagggtgacattc；zq-xz-mrp1-1-r，序列信息ttttgcatccaccttggaactctctttc；

cbr1基因引物名称：zq-xz-cbr1-1-f，序列信息ttttcagctggacatcgacgatct；zq-xz-cbr1-1-r，序列信息ttttccagtgcatcggttcttctt；

abcc2基因引物名称：zq-xz-abcc2-1-f，序列信息tttttctcacttcagcgagaccgtat；zq-xz-abcc2-1-r，序列信息ttttcaaagtacacacatgggtaaataccc；

slc28a3基因引物名称：zq-xz-slc28a3-1-f，序列信息ttttctgtgggtagtcaaacatgtttcc；zq-xz-slc28a3-1-r，序列信息tttttgctatttcttgataaagtgattcagg；

abcc1基因引物名称：zq-xz-abcc1-1-f，序列信息ttttcaggtgtgttgtgtcgtttcag；zq-xz-abcc1-1-r，序列信息ttttgctggtcctcatcctaccttgatag；zq-xz-abcc1-2-f，序列信息ttttagctgttgtctcgttgatcagatc；zq-xz-abcc1-2-r，序列信息tttttatcacggacctgtaatatggttcct；

fancd2基因引物名称：zq-xz-fancd2-1-f，序列信息tttttactgcgttgatgttattagtgtctt；zq-xz-fancd2-1-r，序列信息ttttacatgctaaatatgaacagtgacta；

abcc1基因引物名称：zq-xz-abcc1-3-f，序列信息ttttgccctggtgatcaccaattcag；zq-xz-abcc1-3-r，序列信息ttttacaggaggtagagagcaaggatg；

abcc2基因引物名称：zq-xz-abcc2-2-f，序列信息ttttgcctggctgctatttagctttc；zq-xz-abcc2-2-r，序列信息ttttaaaaagaatgctacaacattgtctgac；

mrp1基因引物名称：zq-xz-mrp1-2-f，序列信息ttttcttgaacaactcactttgcctttctaa；zq-xz-mrp1-2-r，序列信息ttttaatctcctgtattgtctaagtctagc；

ncf4基因引物名称：zq-xz-ncf4-1-f，序列信息ttttgaaaatggaggccagcattctag；zq-xz-ncf4-1-r，序列信息tttttcagttgggtatcagaagcctt；

slc22a16基因引物名称：zq-xz-slc22a16-1-f，序列信息tttttgcaactgcaccgtaacataatct；zq-xz-slc22a16-1-r，序列信息ttttttgtggtattcactacttggcttct；

ugt1a6基因引物名称：zq-xz-ugt1a6-1-f，序列信息ttttgctacacaaagttttcagaccacatg；zq-xz-ugt1a6-1-r，序列信息ttttaaacagagaccttctgatataaggtg；

abcb1基因引物名称：zq-xz-abcb1-2-f，序列信息ttttacatgctcccaggctgtttatt；zq-xz-abcb1-2-r，序列信息ttttattgctgagaacattgcctatgga；zq-xz-abcb1-3-f，序列信息ttttcaatgctgcagtcaaacaggatg；zq-xz-abcb1-3-r，序列信息tttttgatgttaattgtgctacattcaaagtgtg；zq-xz-abcb1-4-f，序列信息ttttccaaactagggaaccacagttagt；zq-xz-abcb1-4-r，序列信息ttttgccttggaaatgtcttcaaatgattca；

akr1c3基因引物名称：zq-xz-akr1c3-1-f，序列信息ttttttcagaaactttacaagagtagctttggt；zq-xz-akr1c3-1-r，序列信息ttttaggcagcaagagtaagaatttctatctc；

cat基因引物名称：zq-xz-cat-1-f，序列信息ttttgcccgaaggtccgtttagaaag；zq-xz-cat-1-r，序列信息ttttctgcttcggcgaatgtaaaag；

slco1b3基因引物名称：zq-xz-slco1b3-1-f，序列信息tttttctgctgcttctactttctttgt；zq-xz-slco1b3-1-r，序列信息tttttccagggcaatcgtccaatattc；

slc22a7基因引物名称：zq-xz-slc22a7-1-f，序列信息ttttaccttaggattcagacaggaaactatat；zq-xz-slc22a7-1-r，序列信息ttttatacacatcttcctgaacaaccttatg；

tcl1a基因引物名称：zq-xz-tcl1a-1-f，序列信息ttttactaccagagattaaaggagaagatgg；zq-xz-tcl1a-1-r，序列信息ttttggcatttctctcaactaagttcaga；zq-xz-tcl1a-2-f，序列信息ttttgtcttgagaagggagcaagaggaca；zq-xz-tcl1a-2-r，序列信息ttttgtccttgcacagataacttctatc；

rarg基因引物名称：zq-xz-rarg-1-f，序列信息ttttctcatcctcgctagaggcattg；zq-xz-rarg-1-r，序列信息ttttctctctctttctctctccattgtagg；

abcc5基因引物名称：zq-xz-abcc5-1-f，序列信息ttttccctgtattttgatcagctgtca；zq-xz-abcc5-1-r，序列信息ttttagtcttcaggcaccagactct；

cyp2b6基因引物名称：zq-xz-cyp2b6-1-f，序列信息ttttggcacttcagtctgtgtcctt；zq-xz-cyp2b6-1-r，序列信息ttttaaaagtctggtagaacaagttcagca；

tcl1a基因引物名称：zq-xz-tcl1a-3-f，序列信息ttttgataggctaaatatgtgtgagtctct；zq-xz-tcl1a-3-r，序列信息ttttgctcactaagcaaggacagcaa；zq-xz-tcl1a-4-f，序列信息ttttttcattgaactagctcaagttaactc；zq-xz-tcl1a-4-r，序列信息tttttcagcatcttgccctgaatcttatt；

slc22a17基因引物名称：zq-xz-slc22a17-1-f，序列信息ttttgggtagtttaagagacacttaggata；zq-xz-slc22a17-1-r，序列信息tttttggaaggtggcagcagaaaact；

raptor基因引物名称：zq-xz-raptor-1-f，序列信息tttttgtgtggccaccctattgaatg；zq-xz-raptor-1-r，序列信息ttttaagaagtacaaaatggc；

fancd2基因引物名称：zq-xz-fancd2-2-f，序列信息ttttagggagaagagtaaattttaaacttg；zq-xz-fancd2-2-r，序列信息tttttgagactcaatgatctgaa；

abcc5基因引物名称：zq-xz-abcc5-2-f，序列信息ttttttgccatattaaaagatggcataaatt；zq-xz-abcc5-2-r，序列信息ttttaagtttcctattctgtgagctgtct；

pik3r1基因引物名称：zq-xz-pik3r1-1-f，序列信息ttttgcttaatgaagaaagagctggaaatcc；zq-xz-pik3r1-1-r，序列信息tttttcattccagagtcttatcaacacaatc；

gsta1基因引物名称：zq-xz-gsta1-1-f，序列信息ttttataagatcagtacttactttgttaaa；zq-xz-gsta1-1-r，序列信息ttttgagtggcttttccctaacttgact；

esr2基因引物名称：zq-xz-esr2-1-f，序列信息tttttgctacaactcaacttcctacacaac；zq-xz-esr2-1-r，序列信息ttttttaagcaattgcatgggtagtgtt；

esr1基因引物名称：zq-xz-esr1-1-f，序列信息ttttgggaagggaggtatcaacattg；zq-xz-esr1-1-r，序列信息ttttacctctcttgcattgctcaac；

celf4基因引物名称：zq-xz-celf4-1-f，序列信息ttttcaatcattgctgactctcaaggag；zq-xz-celf4-1-r，序列信息tttttgataagttggcttcatttctctctt；

cbr3基因引物名称：zq-xz-cbr3-1-f，序列信息ttttctttaagactcgcagcactgga；zq-xz-cbr3-1-r，序列信息ttttagagaactgtcggcacagt；

nos3基因引物名称：zq-xz-nos3-1-f，序列信息ttttctggagatgaaggcaggagacag；zq-xz-nos3-1-r，序列信息ttttagtcaatccctttggtgctc；

dpd基因引物名称：zq-xz-dpd-1-f，序列信息ttttagagaaagttttggtgagggca；zq-xz-dpd-1-r，序列信息ttttcctcttttacactcctattgatctg；zq-xz-dpd-2-f，序列信息ttttcaacagaaaatgctttctgccgta；zq-xz-dpd-2-r，序列信息ttttgaattgagcaacgt；zq-xz-dpd-3-f，序列信息ttttgcaaagcaactggcagattctt；zq-xz-dpd-3-r，序列信息ttttttggtgtcaaagtgt。

作为本发明的又一种优选方案，在步骤(2)中，多重富集pcr的反应体系为：

1×pcr缓冲液

作为本发明的进一步改进方案，该构建方法的试剂盒，包括

一dna富集反应组件，由第一扩增引物组组成；

一ringcap-taq酶，由taq酶、dna连接酶和dna末端修饰酶组成；

一管阳性质控品；

和一管阴性质控品。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明的构建方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要45分钟即可，结合高通量测序平台可以十分有效的解决目前对于临床上预测患者接受肿瘤药物治疗是否发生较严重心脏毒性，而需要对多基因、多靶点检测这一难点，且成本低廉。

2、本发明的构建方法所制备的文库序列可被目前高通量测序系统识别并进行检测，从而实现文库构建进行核酸序列的检测的应用，该核酸检测可应用于目前多种高通量测序平台、基因芯片平台、杂交检测平台，见图1。

3、本发明的构建方法适用于来自外周血样品所获得的dna，见图2、图3。

附图说明

图1为本发明的实施例构建的核酸文库进行高通量测序总数据图；

图2为本发明的实施例检测肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变的检测均一性结果图；

图3为本发明的实施例检测肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变的检测突变结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。

肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变文库的构建方法，覆盖人类基因kras、jak3、akt1、crebbp、pten、rb1、tp53、ctnnb1、tsc2、tsc1、erbb2、pik3ca、sf3b1、jak2、cdh1、smad4、gata3、map2k4、map3k1和esr1上的总共56种遗传性变异位点。

具体包括如下步骤：

(1)针对目的基因ugt1a6、fancd2、abcc5、pik3r1、slc22a7、vegf、gsta1、slc22a16、abcb1、cyp3a5、cyp3a4、slc28a3、esr2、akr1c3、cyp2c8、abcc2、cat、gstp1、slco1b3、rarg、slc22a17、tcl1a、mrp1、abcc1、nqo1、cyba、her2、raptor、cyp2b6、cbr1、ncf4、rac2、cyp2d6、cbr3、nos3、esr1、celf4和dpd设计基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个t，且该2～5个t的靠近3’端的第一个t具有pna修饰，同时该基本扩增引物组的tm值相差不超过1℃；所述扩增引物组包括zq-xz-ugt1a6-1-f、zq-xz-ugt1a6-1-r、zq-xz-fancd2-2-f、zq-xz-fancd2-2-r、zq-xz-fancd2-1-f、zq-xz-fancd2-1-r、zq-xz-abcc5-1-f、zq-xz-abcc5-1-r、zq-xz-abcc5-2-f、zq-xz-abcc5-2-r、zq-xz-pik3r1-1-f、zq-xz-pik3r1-1-r、zq-xz-slc22a7-1-f、zq-xz-slc22a7-1-r、zq-xz-vegf-1-f、zq-xz-vegf-1-r、zq-xz-gsta1-1-f、zq-xz-gsta1-1-r、zq-xz-slc22a16-1-f、zq-xz-slc22a16-1-r、zq-xz-abcb1-2-f、zq-xz-abcb1-2-r、zq-xz-abcb1-3-f、zq-xz-abcb1-3-r、zq-xz-abcb1-4-f、zq-xz-abcb1-4-r、zq-xz-abcb1-1-f、zq-xz-abcb1-1-r、zq-xz-cyp3a5-1-f、zq-xz-cyp3a5-1-r、zq-xz-cyp3a5-2-f、zq-xz-cyp3a5-2-r、zq-xz-cyp3a4-1-f、zq-xz-cyp3a4-1-r、zq-xz-cyp3a4-2-f、zq-xz-cyp3a4-2-r、zq-xz-slc28a3-1-f、zq-xz-slc28a3-1-r、zq-xz-esr2-1-f、zq-xz-esr2-1-r、zq-xz-akr1c3-1-f、zq-xz-akr1c3-1-r、zq-xz-cyp2c8-2-f、zq-xz-cyp2c8-2-r、zq-xz-cyp2c8-1-f、zq-xz-cyp2c8-1-r、zq-xz-abcc2-1-f、zq-xz-abcc2-1-r、zq-xz-abcc2-2-f、zq-xz-abcc2-2-r、zq-xz-cat-1-f、zq-xz-cat-1-r、zq-xz-gstp1-1-f、zq-xz-gstp1-1-r、zq-xz-slco1b3-1-f、zq-xz-slco1b3-1-r、zq-xz-rarg-1-f、zq-xz-rarg-1-r、zq-xz-slc22a17-1-f、zq-xz-slc22a17-1-r、zq-xz-tcl1a-3-f、zq-xz-tcl1a-3-r、zq-xz-tcl1a-4-f、zq-xz-tcl1a-4-r、zq-xz-tcl1a-1-f、zq-xz-tcl1a-1-r、zq-xz-tcl1a-2-f、zq-xz-tcl1a-2-r、zq-xz-mrp1-1-f、zq-xz-mrp1-1-r、zq-xz-mrp1-2-f、zq-xz-mrp1-2-r、zq-xz-abcc1-3-f、zq-xz-abcc1-3-r、zq-xz-abcc1-1-f、zq-xz-abcc1-1-r、zq-xz-abcc1-2-f、zq-xz-abcc1-2-r、zq-xz-nqo1-1-f、zq-xz-nqo1-1-r、zq-xz-cyba-1-f、zq-xz-cyba-1-r、zq-xz-her2-2-f、zq-xz-her2-2-r、zq-xz-her2-1-f、zq-xz-her2-1-r、zq-xz-raptor-1-f、zq-xz-raptor-1-r、zq-xz-cyp2b6-1-f、zq-xz-cyp2b6-1-r、zq-xz-cbr1-1-f、zq-xz-cbr1-1-r、zq-xz-ncf4-1-f、zq-xz-ncf4-1-r、zq-xz-rac2-1-f、zq-xz-rac2-1-r、zq-xz-cyp2d6-1-f、zq-xz-cyp2d6-1-r、zq-xz-cbr3-1-f、zq-xz-cbr3-1-r、zq-xz-nos3-1-f、zq-xz-nos3-1-r、zq-xz-esr1-1-f、zq-xz-esr1-1-r、zq-xz-celf4-1-f、zq-xz-celf4-1-r、zq-xz-dpd-1-f、zq-xz-dpd-1-r、zq-xz-dpd-2-f、zq-xz-dpd-2-r、zq-xz-dpd-3-f和zq-xz-dpd-3-r，其序列依次如seqid01～seqid112所示；

(2)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有ringcap-taq酶的pcr反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将扩增产物、多对第一不对称连接探针、通用引物和上述ringcap-taq酶混合进行pcr，纯化后获得文库产物；

(3)将文库产物组成所述用于高通量测序的肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变文库；

(4)通过iontorrentpgm高通量测序仪进行文库上机检测，获得目标序列信息，通过vc软件进行数据信息比对分析，得到样本突变状态。

上述模板所来自的样品适用范围包括外周血标本。

外周血样品，使用qiagen公司外周血dna提取试剂盒提取基因组dna，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取外周血不少于1000μl。所提dna溶于tris-hcl(10mmol/l,ph8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用tris-hcl溶液(10mmol/l,ph8.0)调整dna浓度到2ng/μl作为pcr扩增的模板。

基于上述构建方法的试剂盒包括：

一dna富集反应组件，由扩增引物组组成，每人份的dna富集反应组件的配方如下表所示：

一ringcap-taq酶，由taq酶、dna连接酶和dna末端修饰酶组成，比例为0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2，优选比例1:1:1；

一阴性质控品，具体为无核酸水；

和一阳性质控品，具体由10个阳性突变质粒序列野生型基因组dna混合而成，浓度为2ng/μl。

将上述试剂盒用前述的构建方法进行实验，来分析本发明的检测肿瘤治疗心脏毒性基因突变的方法。分别用20份临床乳腺癌治疗过程无严重心脏毒性的全血样品、20份临床乳腺癌治疗过程存在严重心脏毒性的全血样本：

所述pcr反应体系的模板量(待测样品、阳性质控品和阴性质控品)为5ul，其余组分如下表所示：

pcr扩增程序设置如下表：

上述pcr反应体系所得的扩增产物的纯化具体如下：

取出agencourtampurexp试剂置于室温，同时要打散磁珠，同时配制新鲜的70％的乙醇(230μl无水乙醇+100μl无核酸酶水)，必须是新鲜配制的。

第一轮纯化步骤

(1)向每个样品反应管25μl产物中分别加入12.5μl(0.5x样本体积)的agencourtampurexp试剂，上下吸取吹打5次，完全混匀重悬dna；

(2)室温孵育5分钟；

(3)放置在磁力架上面，孵育5分钟，一直到溶液澄清；

(4)小心地吸取上清液置于新的离心管，不要扰动磁珠；注意：上清液中含有扩增产物不要丢弃。

第二轮纯化步骤

(1)向上述吸取的上清液25μl中加入30μl(1.2x样本体积)的agencourtampurexp试剂，上下吸取吹打5次，完全混匀重悬dna；

(2)室温孵育5分钟；

(3)放置在磁力架上面，孵育3分钟，一直到溶液澄清，小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠；注意：磁珠上含有扩增文库不要丢弃。

(4)加入150μl新鲜配制的70％乙醇，没过磁珠样品即可，离心管正反方向移动5次，然后磁力架上孵育2分钟，去除上清液；

(5)重复上述步骤4，进行第二次洗涤；

(6)确保乙醇液滴已全部从孔中吸走，将板放置于磁力架上，室温空气干燥5分钟，注意不要过度干燥。

(7)将样品管从磁力架上拿开，在每孔中加入25μlte(ph8.0)缓冲液充分浸润磁珠。充分振荡混匀，快速离心将液体收集到管底。(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)；注意：上清液含有扩增文库不要丢弃。

将样品管置于磁力架上2分钟。上清液中含有扩增产物。取出20μl上清。

上述纯化所得的扩增产物制备文库产物的pcr反应的模板量为5ul，其余组分如下表所示：

pcr扩增程序设置如下表：

pcr产物分别按纯化扩增产物方法进行纯化，制得文库产物。

上述文库产物的检测具体如下：

采用iontorrentpgm半导体测序仪(thermofisher公司)一次可以检测96份样品(包括阴阳性对照)。

前述40份全血样品以及阳性质粒经本发明的体系检测，只有阳性质粒和临床接受肿瘤治疗具有严重心脏毒性的有检测到突变序列，而临床接受肿瘤治疗无严重心脏毒性样品无突变序列，进一步证明了该方法的特异性，具体结果如图1至图3所示。

重复性试验：每个反应分别加入突变细胞系dna10ng、1ng和100pg，重复10次进行高通量测序检测，10次结果一致，符合率100％。

以上可知本发明肿瘤多基因文库构建反应就可以同时检测肿瘤治疗心脏毒性基因56个遗传性变异位点，文库构建时间仅需3小时，因此本发明省时省力，准确性高，可满足突变的快速诊断。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。