一种检测牛流行热病毒的引物及检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种用于检测牛流行热病毒的引物，以及由这些引物构成的可检测检测牛流行热病毒试剂盒。
背景技术：
：牛流行热(bovineephemeralfever，bef)是由牛流行热病毒(bovineephemeralfevervirus，befv)引起的黄牛、奶牛、肉牛及水牛的一种急性非接触性传染病。befv由媒介昆虫蚊子和库蠓传播，其流行具有明显的季节性，常发生在夏末秋初，有一定的周期性。bef传播迅速，流行面广，在埃及、赞比亚、肯尼亚，澳大利亚、印度、印度尼西亚、巴勒斯坦、日本和我国多个省份多次发生。该病的临床症状包括发热、食欲减退、流眼泪和鼻涕、肌肉收缩僵硬、暂时性的跛足、唾液分泌物增多、抑郁、关节肿胀等症状，严重时则会发生黏膜化脓、颤抖、瘫痪及死亡。befv为弹状病毒科、暂时热病毒属成员，只有一个血清型，但根据毒株的差异而将其分为4个不同基因型。其中i型包括日本1988年和1989年的分离株以及我国大陆和台湾1984年分离株，ii型主要包括日本2001-2004年的分离株以及我国台湾1996-2004年的分离株，iii型为日本1996年的分离株，iv型由澳大利亚分离株组成。befv可随动物移动和媒介迁飞呈跳跃式蔓延传播，对养牛业造成重大经济损失，因此建立快速、灵敏、准确、简便的病毒诊断方法，用于疑似感染动物的确诊以及易感媒介的带毒状况监控尤为重要。目前，牛流行热病的实验室诊断主要有(1)病毒分离，如乳鼠脑内接种、vero、bhk-21等敏感细胞传代，进而与标准免疫血清进行中和试验鉴定；(2)血清学检测，如补体结合试验、免疫荧光试验、g1-el1sa、阻断elisa方法和中和试验；(3)分子检测技术，如常规rt-pcr检测技术和lamp方法等。病毒分离是确诊befv感染的可靠方法，但该方法依赖于细胞培养，耗时较长；血清学检测方法适用于通过检测病毒抗体进行流行病学调查或疫苗免疫效果的评价。分子检测技术由于快速简便、灵敏性较高，在befv检测中发挥着重要的作用。目前，分子生物学方法已经用于befv的检测和基因序列分析(katoetal.,2009；zhengetal.,2012)，尤其荧光定量rt-pcr更具敏感、特异的优点，避免了电泳等繁琐的步骤，更适合befv的快速诊断。2005年，以色列研究人员stram等建立了针对befv抗原基因g的taqman-mgb荧光定量rt-pcr用于检测befv检测，对当地分离株yaqum-00和澳大利亚参考毒株bb7721可有效检出，但是由于不同毒株的g基因存在较大的变异，难以保证探针与中国befv毒株的绝对匹配性，中国发明专利申请201210219927.5公开了用于我国befv毒株的taqman-mgb荧光定量rt-pcr方法，为解决匹配性在探针中引入了两个简并碱基，该专利申请在普通探针基础上mgb修饰的探针，它的杂交能力更强，更稳定，但需要专业的公司来制备，增加了检测的成本。技术实现要素：本发明提供一种可克服现有技术不足，可以与已经报道的牛流行热病毒g基因有更好的匹配的用于检测牛流行热病毒引物，以及由这些引物构成的检测试剂盒。本发明的一种检测牛流行热病毒引物为：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4。本发明的一种检测牛流行热病毒的试剂盒内包括seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4。为方便使用，本发明的可用于检测牛流性热病毒的试剂盒还包括如下成分：befvrna标准品、阴性质控标准品，荧光定量rt-pcr反应液和荧光定量校正液roxreferencedyeii。本发明的引物可以与已经报道的牛流行热病毒g基因有较好的匹配，本发明的检测试剂盒可更有利于用于检测牛流行热病毒。本发明实际上是一种利用牛流行热g基因进行病毒检测同时以牛gapdh基因为内参的实时荧光相对定量rt-pcr方法。实时荧光定量pcr技术由美国appliedbiosystems公司于1996年推出，该技术不仅实现了从定性到定量的飞跃，且与常规pcr相比具有特异性强、敏感性高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭等优点，因而在基因表达研究、转基因研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域受到广泛应用。本发明在深入分析国内外牛流行热病毒序列的基础上，选择基因信息最为丰富的g基因为检测靶标，设计了特异性的保守引物，同时以表达稳定的gapdh基因为内参对样品rna含量进行校正，制备了牛流行热病毒实时荧光相对定量rt-pcr试剂盒。本发明中，通过反应条件的优化，使实时定量rt-pcr试剂盒具有良好的敏感性、特异性、重复性，其敏感性比常规rt-pcr高100倍，可以用于牛流行热病毒的相对定量检测，而且该试剂盒通过增加简并碱基，所用引物与4个基因型牛流行热病毒的g基因能较好匹配，减少了漏检的可能。附图说明图1牛流行热病毒检测引物的匹配性。图2实时荧光定量rt-pcr动力学曲线。图3实时荧光定量rt-pcr标准曲线。图4实时荧光定量rt-pcr灵敏度实验。图5普通rt-pcr检测方法电泳图。其中m为dna分子量标准dl2000；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别为1011-102拷贝/μlrna标准品；10为空白对照。图6实时荧光定量rt-pcr特异性试验曲线。图7实时荧光定量rt-pcr广谱性试验曲线。图8实时荧光定量rt-pcr批内重复性试验曲线。图9实时荧光定量rt-pcr批间重复性试验曲线。图10人工感染牛第3天至第7天血液中befv核酸的相对水平。具体实施方式本发明的检测牛流行热病毒的引物为seqidno.15’-tagtcacmacvtatgcdatytac-3’(正向引物)、seqidno.25’-gtttactyccacyyttgatgct-3’(反向引物)，目的片段大小为201bp；seqidno.3：5’-gctctctgctcctgcccg-3’(牛gapdh正向引物)、seqidno.45’-cgacgatgtccactttgcca-3’(牛gapdh反向引物)，目的片段大小为159bp。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。在具体应用时还需有：荧光定量pcr反应液、标准阳性rna、阴性质控标准品。在本实施例中荧光定量pcr反应液由premixextaqtm(2×)12.5μl，10μm的正向引物seqno.1和10μm的反向引物seqno.2各0.5μl，荧光校正液roxreferencedyeii(50×)0.5μl，depc水10μl。本发明试剂盒应用实例标准阳性rna制备：根据牛流行热病毒g基因序列，设计引物gf1(正向引物)：5’-tgtggagaacttcatcctgta-3’seqno.5，gr1(反向引物)：5’-agaatctatcatcaccgattgg-3’seqno.6，进行rt-pcr扩增获得牛流行热病毒jt02株g基因片段，长度为1786bp，回收目的片段，与pgem-teasy(promega公司)进行连接，转化jm109感受态细胞，以载体负向引物m13r5’-caggaaacagctatgac-3’seqno.7和gr1引物进行菌落pcr鉴定、碱裂解法提取阳性重组质粒pgem-befv-g，序列测定后用noti内切酶将质粒酶切线性化，用transcriptaidtmt7highyieldtranscriptionkit进行体外转录，进而利用dnasei消化去除转录物中的模板dna，之后经酚氯仿抽提，制备获得与牛流行热病毒基因组负链rna方向一致的g基因rna区段，利用nanodrop2000(thermofisherscientific)超微量分光光度测定浓度，并换算成拷贝/μl，以此作为标准阳性rna。荧光定量rt-pcr反应性：将制备的rna标准品，系列稀释至终浓度为1.0×109-1.0×100拷贝/μl，进行定量rt-pcr扩增，反应体系为25μl：premixextaqtm(2×)12.5μl，10μm的正向引物seqno1和10μm的反向引物seqno2各0.5μl，荧光校正液roxreferencedyeii(50×)0.5μl，depc水10μl，rna模板1μl。反应条件为42℃10min反转录，95℃预变性30s，然后95℃5s、60℃30min，40个循环，最后增加一个熔解曲线。在每个循环的结束时进行荧光信号实时检测，每个模板浓度做3个重复，取平均值计算变异系数，实验均设阴性对照。所建立的实时定量rt-pcr动力学曲线和标准曲线参见图2和图3，模板量与对应的ct值呈线性相关，相关系数为0.999，扩增效率为92.6％，标准曲线方程为y＝-3.513×logx+40.66。荧光定量rt-pcr敏感性：取浓度为1.0×109-1.0×100拷贝/μl的rna标准品进行灵敏度试验，结果显示该方法的最低检出限为101拷贝/μl(图4)，而普通rt-pcr的检出限为103拷贝/μl(图5)，比普通rt-pcr方法灵敏度高100倍。荧光定量rt-pcr特异性：利用建立的实时荧光定量rt-pcr方法分别检测了牛流行热病毒、狂犬病病毒、水泡性口炎病毒、蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、日本乙型脑炎病毒等病原的核酸，结果只有牛流行热病毒呈阳性反应，其它病原均呈阴性(图6)。荧光定量rt-pcr广谱性：利用建立的实时荧光定量rt-pcr方法分别检测了我国牛流行热病毒毒株ls11(1.0×108拷贝/μl)、henan02(1.0×108拷贝/μl)、jb76h(1.0×107拷贝/μl)、lyc11(1.0×107拷贝/μl)、jt02(1.0×106拷贝/μl)的g基因质粒标准，结果均可检出，并且线性良好，说明本发明的广谱性(图7)。荧光定量rt-pcr稳定性：取浓度1.0×106-1.0×101拷贝/μl6个浓度的rna标准品进行稳定性分析。先进行批内重复性实验(图8)，对同一批次稀释的标准品，每个浓度重复检测3次，分析ct值变异系数在0.08-0.89％间，小于5％，参见表1。然后进行批间重复性实验(图9)，对3个不同批次稀释的标准品进行检测，经分析ct辨析说系数在0.23-1.02％之间，小于10％，参见表2，由此说明本发明具有较好的稳定性。表1批内重复性实验结果标准品浓度(拷贝/μl)1.0×1011.0×1021.0×1031.0×1041.0×1051.0×106ct137.6035.2931.1327.7624.5520.86ct237.5435.0530.7427.7224.7521.09ct337.7135.4230.6027.7624.3221.02c.v％0.230.530.890.080.880.56表2批间重复性实验结果标准品浓度(拷贝/μl)1.0×1011.0×1021.0×1031.0×1041.0×1051.0×106ct137.5135.1930.8127.9224.3120.97ct237.6234.8430.9327.6824.5121.09ct338.0234.4830.827.7224.320.87c.v％0.711.020.230.460.490.53检测临床样本检测：对befvjt02毒株人工感染牛第3天(pid3)至第7(pid7)天血液中的病毒核酸进行相对定量检测。取抗凝血300μl，加入800μltrizol剧烈震荡之后加入200μl氯仿，室温静置5min。4℃，12000rpm离心15min，吸取上清加入等体积的异丙醇，混匀并于室温静置10min。4℃，12000rpm离心10min，弃上清，于沉淀中加入1ml75％乙醇洗剂，之后4℃，12000rpm离心10min，室温干燥沉淀，加入30μldepc水溶解。分别以seqno1和seqno2、seqno3和seqno4进行25μl体系反应，采用相对定量的2－δδct进行数据分析，计算不同感染时间牛血液中befv的核酸水平差异。在感染的第3天至第7天，牛血液中均有befv核酸检出，第4天为最高峰，第7天降至最低(图10)。以上实施例是本发明的一个具体的实施例，但本发明的保护范围不限于上述实施例。<110>中国农业科学院兰州兽医研究所<120>一种检测牛流行热病毒的引物及检测试剂盒<160>4<210>1<211>23<212>dna<213>牛流行热病毒的正向引物<400>tagtcacmacvtatgcdatytac23<210>2<211>22<212>dna<213>牛流行热病毒的反向引物<400>gtttactyccacyyttgatgct22<210>3<211>18<212>dna<213>牛gapdh正向引物<400>gctctctgctcctgcccg18<210>4<211>20<212>dna<213>牛gapdh反向引物<400>cgacgatgtccactttgcca20<210>5<211>21<212>dna<213>标准阳性rna正向引物<400>tgtggagaacttcatcctgta21<210>6<211>22<212>dna<213>标准阳性rna反向引物<400>agaatctatcatcaccgattgg22<210>7<211>17<212>dna<213>载体负向引物<400>caggaaacagctatgac17当前第1页12