本发明涉及一种干孢粉的收集方法，具体是白僵菌、绿僵菌等昆虫病原真菌干孢粉的收集方法。
背景技术：
：1834年，意大利生物学家agostinobassi通过实验证明白僵菌寄生在家蚕体内使家蚕发生白僵病，其后又证明白僵菌能够使除家蚕外的其他昆虫(如食心虫、松毛虫、玉米螟)致病；绿僵菌广泛寄生于白蚁、蝗虫等昆虫体内，也能够使寄主致病至死。这种寄生在金龟子、蜘蛛、白蚁、蝗虫等昆虫体内，且能够使昆虫发病致死的白僵菌、绿僵菌等真菌统称为昆虫病原真菌(白僵菌和绿僵菌是最具有代表性的昆虫病原真菌)。昆虫病原真菌在繁殖过程中会产生繁殖体(也称之为产孢)，其中，直接由昆虫病原真菌的菌丝分化产生的繁殖体称之为昆虫病原真菌分生孢子，干燥后的分生孢子称之为干孢粉。昆虫病原真菌致病原理是其分生孢子萌发后侵入昆虫体内，通过在昆虫体内不断生长和繁殖来消耗昆虫的营养，并释放毒素，进而使昆虫发病至死。由于这种方式致病性强，致病机理复杂，且能够有针对性的杀死目标昆虫，因此，常用昆虫病原真菌干孢粉来制备虫生真菌杀虫剂。目前，主要采用分筛法或旋风收集法收集昆虫病原真菌干孢粉，其缺点是容易导致昆虫病原真菌分生孢子四处飞散，进而影响操作区域空气质量，甚至危害人员健康。此外，采用分筛法收集干孢粉，收集效率较低；采用旋风收集法收集干孢粉，所用设备(旋风收孢机)复杂。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种昆虫病原真菌干孢粉的收集方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种昆虫病原真菌干孢粉的收集方法，包括昆虫病原真菌分生孢子培养和收集步骤；所述昆虫病原真菌分生孢子培养为：将昆虫病原真菌菌种接种于萨氏液体培养基上培养后得到昆虫病原真菌液体菌种；再将所得液体菌种接种于灭菌后的大米培养基或麦麸培养基上发酵至产孢成熟；所述昆虫病原真菌分生孢子收集为：将含有成熟产孢的培养基与含非离子表面活性剂的无菌水按照重量比＝1:1-1:5混合后，在3-10℃的工艺温度中搅拌均匀，得到分散体系；将所得分散体系置于筛网上过滤后收集分生孢子，再经低温干燥后收取干孢粉。上述技术方案将含有非离子表面活性剂的无菌水与含成熟产孢的培养基混合，在特定的温度(3-10℃)下搅拌后结合筛选工艺收集分生孢子，解决了分生孢子在收集过程在容易飞散的问题，极大程度的避免了分生孢子污染操作区域的空气和危害操作人员健康，在昆虫病原真菌杀虫剂的工业生产中具有极大的应用价值。优选地，所述非离子表面活性剂为无菌水的0.001-0.01％(重量百分比)。优选地，所述非离子表面活性剂选用蔗糖酯、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60或十二酸山梨醇酯。为进一步解决昆虫病原真菌分生孢子在收集过程中易飞散的问题，在大米培养基或麦麸培养基与含聚山梨酯-80的无菌水混合后的搅拌过程中，工艺温度控制为3-7℃；更优选地，在大米培养基与含聚山梨酯-80的无菌水混合后的搅拌过程中，工艺温度控制为5-7℃。优选地，将大米培养基或麦麸培养基与含聚山梨酯-80的无菌水混合后，采用三叶浆式搅拌器或螺旋式搅拌器进行搅拌；其中，搅拌速度控制为5-30rpm(转/分钟)，搅拌时间控制为5-10分钟。为更进一步解决昆虫病原真菌分生孢子在收集过程中易飞散的问题，将昆虫病原真菌菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在25-27℃条件下培养3-4天，得到昆虫病原真菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的大米培养基上，并置于25-27℃条件下发酵13-15天，至产孢成熟；将含有成熟产孢的大米培养基与含聚山梨酯-80的无菌水按照重量比＝1：2.5-1：4混合后，在5-7℃的工艺温度下搅拌均匀，得到分散体系；将前述分散体系置于120-150um的筛网上过滤，并将所得滤液用1-5um的筛网再次过滤后或者经离心筛选后收集分生孢子，再经低温干燥后收取干孢粉。本发明昆虫病原真菌干孢粉收集方法，将含有非离子表面活性剂的无菌水与含成熟昆虫病原真菌分生孢子的培养基按照特定比例混合，在特定的温度(3-10℃)下搅拌后结合筛选工艺收集分生孢子，解决了分生孢子在收集过程在容易飞散的情况，极大的程度的避免了分生孢子污染操作区域的空气和危害操作人员的健康，在昆虫病原真菌杀虫剂的工业生产中具有极大的应用价值。相比于现有技术，采用本发明收集的昆虫病原真菌干孢粉的活孢率非常高，且回收率明显提高；经测试，本发明收集的干孢粉的活孢率可达99.5％，回收率可达99％。此外，本发明收集的昆虫病原真菌干孢粉的活性好，能够增强昆虫病原真菌杀虫剂的杀虫效果。本发明昆虫病原真菌干孢粉的收集方法，所用设备简单，生产工艺简单，工序少，在常压下即可完成干孢粉的收集，节约能源和成本。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，在此指出以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域普通技术人员根据本发明的内容作出一些非本质的改进和调整，均在本发明保护范围内。本发明中所述分数均为重量份，所述百分比均为重量百分比；本发明中所述非离子表面活性剂是指脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯-80(别名吐温80)、聚山梨酯-60、十二酸山梨醇酯(别名司班20)和三乙醇胺皂中的一种物质；本发明中所述原料均是本领域普通技术人员知晓的市售产品，其中，萨氏液体培养基为上海冠导生物工程有限公司生产的1/4sday培养基(1/4指的是培养基的强度)，本发明所用菌种由重庆大学基因工程中心提供；本发明中所述分筛法采用的设备为卓美机械zm600-1800型振荡分筛机，筛网可按孔径要求替换；本发明中所述旋风收孢机为流能lnc-180a型旋风收孢机，収孢温度可按要求控制。实施例1：绿僵菌分生孢子培养，将金龟子绿僵菌cqma421菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在26℃条件下培养3天，得到金龟子绿僵菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的大米培养基(将大米在26℃的自来水中浸泡4小时后沥干，将其灭菌后冷却至室温制得大米培养基)上，将大米培养基置于26℃条件下发酵15天，至产孢成熟。绿僵菌分生孢子收集，将含有成熟产孢的大米培养基与含聚山梨酯-80的无菌水按照重量比＝1：2.5混合后(成熟产孢大米培养基重量为100kg，无菌水的重量为250kg，无菌水中聚山梨酯-80的含量为0.0125kg)，在5℃的工艺温度下，以20rpm的转速搅拌10分钟得到分散体系；将前述分散体系置于120um的筛网中过滤，并将所得滤液用卧式螺旋离心机离心后收集分生孢子，经低温干燥后得到含水量为4％的干孢粉。实施例2：绿僵菌分生孢子培养，将金龟子绿僵菌cqma102菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在27℃条件下培养4天，得到金龟子绿僵菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的大米培养基(将大米在27℃的自来水中浸泡4小时后沥干，将其灭菌后冷却至室温制得大米培养基)上，将大米培养基置于27℃条件下发酵15天，至产孢成熟。绿僵菌分生孢子收集，将含有成熟产孢的大米培养基与含聚山梨酯-60的无菌水按照重量比＝1：4混合后(成熟产孢大米培养基重量为100kg，无菌水重量为400kg，无菌水中聚山梨酯-60含量为0.024kg)，在7℃的工艺温度下，以20rpm的转速搅拌10分钟得到分散体系；将前述分散体系置于150um的筛网中过滤，并将所得滤液用卧式螺旋离心机离心后收集分生孢子，经低温干燥后得到含水量为5％的干孢粉。实施例3：白僵菌分生孢子培养，将球孢白僵菌cqbb101菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在25℃条件下培养3天，得到金龟子绿僵菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的麦麸培养基(将麦麸与自来水按照重量比＝2:1混合后拌匀，再经灭菌后冷却至室温制得麦麸培养基)上，将麦麸培养基置于25℃条件下发酵15天，至产孢成熟。白僵菌分生孢子收集，将含有成熟产孢的麦麸培养基与含十二酸山梨醇酯的无菌水按照重量比＝1：5混合后(成熟产孢大米培养基重量为100kg，无菌水重量为500kg，无菌水中十二酸山梨醇酯含量为0.0015kg)，在3℃的工艺温度下，以5rpm的转速搅拌10分钟得到分散体系；将前述分散体系置于120um的筛网中过滤，并将所得滤液用5um的微孔筛网过滤，收集微孔筛网上的分生孢子经低温干燥后得到含水量为4％的干孢粉。实施例4：白僵菌分生孢子培养，将球孢白僵菌cqbb223菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在27℃条件下培养4天，得到金龟子绿僵菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的麦麸培养基(将麦麸与自来水按照重量比＝2:1混合后拌匀，再经灭菌后冷却至室温制得麦麸培养基)上，将麦麸培养基置于27℃条件下发酵20天，至产孢成熟。白僵菌分生孢子收集，将含有成熟产孢的麦麸培养基与含蔗糖酯的无菌水按照重量比＝1：3混合后(成熟产孢大米培养基重量为100kg，无菌水重量为300kg，无菌水中蔗糖酯含量为0.003kg)，在10℃的工艺温度下，以30rpm的转速搅拌5分钟得到分散体系；将前述分散体系置于150um的筛网中过滤，并将所得滤液用1um的微孔筛网过滤，收集微孔筛网上的分生孢子经低温干燥后得到含水量为5％的干孢粉。实施例5：绿僵菌分生孢子培养，将金龟子绿僵菌cqma421菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在25℃条件下培养3天，得到金龟子绿僵菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的大米培养基(将大米在25℃的自来水中浸泡4小时后沥干，将其灭菌后冷却至室温制得大米培养基)上，将大米培养基置于25℃条件下发酵10天，至产孢成熟。绿僵菌分生孢子收集，将含有成熟产孢的大米培养基与含聚山梨酯-80的无菌水按照重量比＝1：1混合后(成熟产孢大米培养基重量为100kg，无菌水重量为100kg，无菌水中聚山梨酯-80含量为0.01kg)，在3℃的工艺温度下，以5rpm的转速搅拌5分钟得到分散体系；将前述分散体系置于120um的筛网中过滤，并将所得滤液用卧式螺旋离心机离心后收集分生孢子，收集的分生孢子经低温干燥后得到含水量为4％的干孢粉。实施例6：绿僵菌分生孢子培养，将金龟子绿僵菌cqma421菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在27℃条件下培养4天，得到金龟子绿僵菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的大米培养基(将大米在27℃的自来水中浸泡4小时后沥干，将其灭菌后冷却至室温制得大米培养基)上，将大米培养基置于27℃条件下发酵20天，至产孢成熟。绿僵菌分生孢子收集，将含有成熟产孢的大米培养基与含蔗糖酯的无菌水按照重量比＝1：4混合后(成熟产孢大米培养基重量为100kg，无菌水重量为400kg，无菌水中蔗糖酯含量为0.02kg)，在7℃的工艺温度下，以30rpm的转速搅拌10分钟得到分散体系；将前述分散体系置于150um的筛网中过滤，并将所得滤液用5um的微孔筛网过滤，收集微孔筛网上的分生孢子经低温干燥后得到含水量为5％的干孢粉。对比实施例1：采用分筛法收集孢子粉，参照实施例1中绿僵菌分生孢子培养步骤，收集成熟产孢，将含有成熟产孢的培养基置于干燥室(温度30℃，湿度≤30％)内干燥2天后，先用120目的振荡筛收集孢子粉，再用震荡分筛机(卓美机械zm600-1800型分筛机，筛网规格为5μm)收集分生孢子，经低温干燥后得到含水量为4％的干孢粉。对比实施例2：采用旋风收集法收集孢子粉，参照实施例1中绿僵菌分生孢子培养步骤，收集成熟产孢，将含有成熟产孢的培养基置于干燥室(温度30℃，湿度≤30％)干燥2天后，用旋风收孢机(流能lnc-180a型旋风收孢机，収孢温度设为40-50℃)收集分生孢子，经低温干燥后得到含水量为4％的干孢粉。对比实施例3：参照实施例2中白僵菌分生孢子培养步骤，收集成熟产孢，先用150目的振荡筛收集孢子粉，再用震荡分筛机(卓美机械zm600-1800型分筛机，筛网规格为5μm)收集分生孢子，经低温干燥后得到含水量为5％的干孢粉。对比实施例4：参照实施例2中绿僵菌分生孢子培养步骤，收集成熟产孢，将含有成熟产孢的培养基置于旋风收集器(旋风收集法)中收集分生孢子，经低温干燥后得到含水量为5％的干孢粉。对比实施例5：参照实施例3中白僵菌分生孢子培养步骤，收集成熟产孢，先用120目的振荡筛收集孢子粉，再用震荡分筛机(卓美机械zm600-1800型分筛机，筛网规格为5μm)收集分生孢子，经低温干燥后得到含水量为4％的干孢粉。对比实施例6：参照实施例3中白僵菌分生孢子培养步骤，收集成熟产孢，将含有成熟产孢的培养基置于旋风收集器(旋风收集法)中收集分生孢子，经低温干燥后得到含水量为4％的干孢粉。对比实施例7：参照实施例4中白僵菌分生孢子培养步骤，收集成熟产孢，先用150目的振荡筛收集孢子粉，再用震荡分筛机(卓美机械zm600-1800型分筛机，筛网规格为5μm)收集分生孢子，经低温干燥后得到含水量为4％的干孢粉。对比实施例8：参照实施例4中白僵菌分生孢子培养步骤，收集成熟产孢，将含有成熟产孢的培养基置于旋风收集器(旋风收集法)中收集分生孢子，经低温干燥后得到含水量为5％的干孢粉。孢子飞散情况测试：选择3m*3m*2m的密闭实验空间，用除尘器清理干净实验空间内的灰尘后在实验空间内均匀放置4台lzj-01d型粒子计数器。将实施例1中含有成熟产孢的大米培养基置于该实验空间中收集分生孢子，待收集完毕后的第30分钟读取粒子计数器上的数据(该数据反应分生孢子的飞散情况，数值越大说明分生孢子越容易飞散)，其数据分别为9、10、15、12，平均值为11.5。参照上述方法，在同样的环境条件下分别测量实施例2-6，对比实施例1-8中分生孢子的飞散情况，结果见表1；表1昆虫病原真菌分生孢子飞散情况由表1可知，在本发明实施例1-6收集干孢粉的过程中，粒子计数器上的平均值为11.5-18.8，而对比实施例1-8收集干孢粉的过程中，粒子计数器上的平均值为5184-5824.8，显著高于本发明的平均值，充分说明采用本发明收集昆虫病原菌干孢粉，收集过程中分生孢子飞散量非常小。纯度与活孢率测试：称取实施例1中收集到的干孢粉1g，置于200ml烧杯中，然后加入重量占比为0.1％的聚山梨酯-80溶液60ml后振荡至孢子分散，得到悬浮液，再吸取4ml悬浮液至100ml容量瓶中定容，采用血球计数板在显微镜下测定孢子数，并根据实施例1中收集到的干孢粉总重量计算含孢量，结果见表2。将实施例1中收集到的干孢粉，加入重量占比为0.1％聚山梨酯-80的无菌水中，配置成含孢量为106个/ml的悬浮液，将悬浮液置于26℃条件下震荡培养5h后均匀接种在萨氏培养基上，置于26℃条件下保湿培养28小时，在显微镜下统计萌发的孢子数与未萌发的孢子数，计算萌发率(即活孢率)，结果见表2。参照上述含孢量与活孢率的测试方法，分别测定实施例2-4，对比实施例1-8中收集到的干孢粉的含孢量与活孢率，结果见表2；表2昆虫病原真菌干孢粉的含孢量与活孢率实施例含孢量106/g活孢宰/％实施例145599.2实施例256099.1实施例3111099.4实施例4121099.5对比实施例138498.1对比实施例245092.7对比实施例350698.2对比实施例454090.2对比实施例598099对比实施例6110092.1对比实施例7102098.3对比实施例8112091.8从表2可以看出：采用本发明收集的干孢粉的含孢量明显高于采用分筛法(对比实施例1、3、5、7)收集干孢粉的含孢量(含孢量用来表征干孢粉的纯度，含孢量越高表明其纯度较高)；采用本发明收集的干孢粉的活孢率为99.1-99.5％，明显高于采用旋风收集法(对比实施例2、4、6、8)收集的干孢粉的活孢率(90.2-92.7％)。回收率测试：测试依据，昆虫病原真菌干孢粉的回收率＝(干孢粉重量×干孢粉的含孢量)/(干孢粉收集前培养基重量×干孢粉收集前的含孢量)×100％；分别测量实施例1-4和对比实施例1-8中干孢粉收集前培养基的重量和含孢量，干孢粉重量，干孢粉含孢量，按照上述公式计算回收率，结果见表3；表3昆虫病原真菌干孢粉的回收率从表3可以看出，采用本发明收集的昆虫病原真菌的分生孢子的回收率在98.2-99％以上，明显高于分筛法和旋风收集法的回收率(87.2-91％)，表明其回收率非常高。当前第1页12