一种罗氏沼虾微胞子虫可视化快速检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于靶基因片断的快速检测领域，具体地说，涉及一种罗氏沼虾微胞子虫可视化快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

罗氏沼虾微胞子虫(macrobrachiumrosenbergiimicrosporidium，mrmsp)是一种严重影响罗氏沼虾幼体、成虾肠道营养吸收的致病性寄生虫。其可寄生于虾的肠道和肝脏组织，可引起肠道上皮组织损伤，进而造成罗氏沼虾营养吸收不良，影响虾体健康和生长。该病原可间接导致罗氏沼虾因营养吸收受损而个体偏小，养殖产量低。罗氏沼虾微胞子虫是新近发现并在罗氏沼虾苗种中流行的新病原，该病原已在我国罗氏沼虾育苗企业大面积蔓延，根据流行病学调查，2017年罗氏沼虾微胞子虫携带率接近50％。而现阶段又缺乏针对罗氏沼虾微胞子虫的高灵敏检测试剂盒，这已不能满足该病原引起疾病的检疫和预防工作。因此该罗氏沼虾微胞子虫检测试剂盒的开发和检测技术的应用具有潜在巨大的经济效益和社会效益。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种罗氏沼虾微胞子虫可视化快速检测试剂盒，本发明的试剂盒特异性强，敏感性高；本发明罗氏沼虾微胞子虫快速检测方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于检测罗氏沼虾微胞子虫扩增用核酸引物组，该引物组包含引物mrmsp-f3、引物mrmsp-b3、引物mrmsp-fip、引物mrmsp-bip、引物mrmsp-lpf和引物mrmsp-lpb；

所述的引物mrmsp-f3的核苷酸序列如seqidno：1所示；

所述的引物mrmsp-b3的核苷酸序列如seqidno：2所示；

所述的引物mrmsp-fip的核苷酸序列如seqidno：3所示；

所述的引物mrmsp-bip的核苷酸序列如seqidno：4所示；

所述的引物mrmsp-lpf的核苷酸序列如seqidno：5所示；

所述的引物mrmsp-lpb的核苷酸序列如seqidno：6所示。

本发明还公开了一种罗氏沼虾微胞子虫可视化快速检测试剂盒，包括微胞子虫dna提取试剂和反应试剂，所述的反应试剂中含有上述的用于检测罗氏沼虾微胞子虫扩增用核酸引物组。

进一步地，反应试剂具体包括以下组分：

a)预反应液：20mmph为8.8的tris-hc1、8mm硫酸镁、15mm氯化钾、10mm硫酸按、0.l2％tween-20、1.4mmdntp、0.4m甜菜碱、0.2μm引物mrmsp-f3、0.2μm引物mrmsp-b3、1.6μm引物mrmsp-fip、1.6μm引物mrmsp-bip、0.8μm引物mrmsp-lpf和0.8μm引物mrmsp-lpb；

b)反应酶：每微升含8个活性单位的bst2.0dna聚合酶；

c)反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成；

d)反应显色液：含有10％sybrgreeni的荧光染料。

进一步地，微胞子虫dna提取试剂：成分为60mmtris、800mmnacl、0.5％sds、1％np-40的ph8.0的裂解液。

本发明还公开了一种利用上述的罗氏沼虾微胞子虫的快速检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：

1)dna抽提：取罗氏沼虾幼体或苗或鳃丝或肝脏组织30-80mg于2ml离心管中，采用权利要求4所述的微胞子虫dna提取试剂进行dna提取；

2)对罗氏沼虾微胞子虫基因进行扩增；

3)对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测。

进一步地，步骤1)中的dna抽提具体为：向含有组织的2ml离心管加入权利要求4所述的微胞子虫dna提取试剂200μl，研磨均匀后，95℃以上加热10分钟左右，10000rpm离心10分钟后，上清即为提取的待检dna模板。

进一步地，步骤2)中的对罗氏沼虾微胞子虫基因进行扩增具体为：

2.1)根据待检测样品的数目，设置所需反应管数n，n＝样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；

2.2)吸取所述的预反应液的体积为n×22μl，加入一洁净的1.5ml离心管中，然后加入nμl反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；

2.3)向设定的n个反应管中分别加入23μl步骤6.2)得到的混合液，得到n个pcr反应管，向上述n个pcr反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检dna模板和阳性对照各2μl；

2.4)在上述步骤2.3)得到的反应管中再分别加入30μl反应封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；

2.5)在65℃下恒温反应50分钟。

进一步地，所述阳性对照为含有罗氏沼虾微胞子虫基因的质粒，所述阴性对照为无核酸去离子水。

进一步地，所述步骤3)中的显色检测具体为：取出经步骤2)处理的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入lμl反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，绿色判断为阳性，浅黄色为阴性，观察结束后将反应管装入密封袋，丢弃至特定区域。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明根据靶基因序列设计了罗氏沼虾微胞子虫检测用引物组，能特异性识别靶序列上的六个独立区域，在bst2.0dna聚合酶的作用下启动循环链置换反应，并且只有在4条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大增强了罗氏沼虾微胞子虫检测的特异性；

2)采用本发明的引物组对罗氏沼虾微胞子虫进行检测，因为特异性高，所以可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；

3)本发明的快速诊断试剂盒是利用等温扩增技术快速检测罗氏沼虾微胞子虫，检测灵敏度高，扩增模板仅需22拷贝；

4)本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和，且所需仪器简单，也不需要特殊试剂，克服了传统pcr固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点；

5)本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1h即可完成扩增，且产率高；

6)本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dntp析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；

7)本发明的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；

8)本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的等温扩增反应体系，不但使得罗氏沼虾微胞子虫定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒是检测罗氏沼虾微胞子虫的第一个试剂盒，填补了罗氏沼虾微胞子虫无检测方法的缺口，具有很高的科研和经济价值。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明引物特异性测试图；其中，1：罗氏沼虾微胞子虫；2：罗氏沼虾双顺反子病毒；3：罗氏沼虾野田村病毒；4：罗氏沼虾纽缔病毒；5：对虾白斑综合征病毒；6：产气肠杆菌；7：嗜水气单胞菌；8：健康罗氏沼虾dna阴性对照；9：罗氏沼虾微胞子虫基因阳性质粒对照；

图2是本发明灵敏性检测图；其中，1.2.2×10⁵copies；2.2.2×10⁴copies；3.2.2×10³copies；4.2.2×10²copies；5.2.2×10copies；6.2.2copies；7.健康罗氏沼虾dna阴性对照。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1罗氏沼虾微胞子虫可视化快速检测试剂盒

罗氏沼虾微胞子虫可视化快速检测试剂盒包括微胞子虫dna提取试剂和反应试剂，该试剂盒仅需常规离心机和水浴锅就可以完成核酸提取和检测，并且整个检测过程仅需2小时以内，检测产物封闭观察，不会污染环境，此外，检测结果可以通过肉眼观察颜色变化，就可以判断结果，实用强。

其中，微胞子虫dna提取试剂为成分为60mmtris、800mmnacl、0.5％质量百分比的sds、1％体积百分比np-40的ph8.0的裂解液。

反应试剂包括以下组分：

a)预反应液：20mmph为8.8的tris-hc1、8mm硫酸镁、15mm氯化钾、10mm硫酸按、0.l2％tween-20、1.4mmdntp、0.4m甜菜碱、0.2μm引物mrmsp-f3、0.2μm引物mrmsp-b3、1.6μm引物mrmsp-fip、1.6μm引物mrmsp-bip、0.8μm引物mrmsp-lpf和0.8μm引物mrmsp-lpb；

b)反应酶：每微升含8个活性单位的bst2.0dna聚合酶；

c)反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成；

d)反应显色液：含有10％sybrgreeni的荧光染料。

实施例2利用实施例1所述的罗氏沼虾微胞子虫的快速检测试剂盒进行检测的方法

(1)dna抽提：

取罗氏沼虾幼体或苗或鳃丝或肝脏组织30-80mg于1.5ml离心管中，并向离心管加入上述微胞子虫dna提取试剂裂解液200μl，于冰上用研磨棒研磨，研磨均匀后，95℃以上加热10分钟左右，10000rpm离心10分钟后，上清即为待检dna模板，-80℃保存备用。

(2)罗氏沼虾微胞子虫基因的快速扩增：

根据待检测样品的数目，设置所需快速反应管数n，n＝样品数+2，其中l管为阳性对照(含有罗氏沼虾微胞子虫基因的质粒)，l管为阴性对照(无核酸去离子水)；吸取预反应液的体积为n×22μl，加入一洁净的1.5ml离心管中，然后加入nμl反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，向设定的n个反应管中分别加入23μl混合液，并向n个pcr反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检dna模板和阳性对照各2μl；然后在每个反应管中再分别加入30μl封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；在65℃下恒温反应50分钟。

(3)显色检测：

取出经步骤(2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入lμl显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，若显示绿色，说明样品中含有罗氏沼虾微胞子虫核酸，显示为浅黄色则无罗氏沼虾微胞子虫核酸。

上述预反应液含有：20mmph为8.8的tris-hc1、8mm硫酸镁、15mm氯化钾、10mm硫酸按、0.l2％tween-20、1.4mmdntp、0.4m甜菜碱、0.2μm引物mrmsp-f3、0.2μm引物mrmsp-b3、1.6μm引物mrmsp-fip、1.6μm引物mrmsp-bip、0.8μm引物mrmsp-lpf和0.8μm引物mrmsp-lpb，其中所述的引物mrmsp-f3序列如seqidno：1所示；所述的引物mrmsp-b3序列如seqidno：2所示；所述的引物mrmsp-fip序列如seqidno：3所示；所述的引物mrmsp-bip序列如seqidno：4所示；所述的引物mrmsp-lpf的核苷酸序列如seqidno：5所示；所述的引物mrmsp-lpb的核苷酸序列如seqidno：6所示。

实施例3试剂盒特异性检测

(1)dna抽提：

取罗氏沼虾微胞子虫阳性组织样本30-80mg于1.5ml离心管中，并向各个离心管加入dna提取试剂裂解液200μl，于冰上用研磨棒研磨，研磨均匀后，95℃以上加热10分钟左右，10000rpm离心10分钟后，上清即为待检dna模板，-80℃保存备用。

(2)罗氏沼虾微胞子虫基因的快速扩增：

设置9个快速反应管数；吸取预反应液的体积为9×22μl，加入一洁净的1.5ml离心管中，然后加入9μl反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，向设定的9个反应管中分别加入23μl混合液，并向9个pcr反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、罗氏沼虾微胞子虫dna模板、罗氏沼虾双顺反子病毒核酸、罗氏沼虾野田村病毒核酸、罗氏沼虾纽缔病毒核酸、对虾白斑综合征病毒核酸、产气肠杆菌核酸、嗜水气单胞菌核酸和阳性对照各2μl；然后在每个反应管中再分别加入30μl封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；在65℃下恒温反应50分钟。

(3)显色检测：

取出经步骤(2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入lμl显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，若显示绿色，说明样品中含有罗氏沼虾微胞子虫核酸，显示为浅黄色则无罗氏沼虾微胞子虫核酸，结果见图1，仅罗氏沼虾微胞子虫和罗氏沼虾微胞子虫基因模版扩增后显色为阳性绿色，其它病毒或细菌显色都为阴性浅黄色，表明对其它病毒无交叉扩增性。

实施例4试剂盒灵敏度检测

(1)dna模板设置：

取已被定量的罗氏沼虾微胞子虫dna样品进行梯度稀释，设置微胞子虫核酸拷贝数浓度分别为：1.1×10⁵copies/μl、1.1×10⁴copies/μl、1.1×10³copies/μl、1.1×10²copies/μl、1.1×10copies/μl和1.1copies/μl；-80℃保存备用。

(2)罗氏沼虾微胞子虫基因的快速扩增：

设置7个快速反应管数，其中l管为阴性对照(无核酸去离子水)；吸取预反应液的体积为7×22μl，加入一洁净的1.5ml离心管中，然后加入7μl反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，向设定的7个反应管中分别加入23μl混合液，并向7个pcr反应管内按顺序依次分别加入阴性对照和待检6个稀释度的微胞子虫dna模板各2μl；然后在每个反应管中再分别加入30μl封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；在65℃下恒温反应50分钟。

(3)显色检测：

取出经步骤(2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入lμl显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，若显示绿色，说明样品中含有罗氏沼虾微胞子虫核酸，显示为浅黄色则无罗氏沼虾微胞子虫核酸，结果见图2，经real-timepcr定量后的罗氏沼虾微胞子虫dna系列稀释的扩增显色图，当反应体系中加入22个微胞子虫基因拷贝的dna，扩增显色结果就为阳性。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

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<110>浙江省淡水水产研究所

<120>一种罗氏沼虾微胞子虫可视化快速检测试剂盒及其检测方法

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