进行ADD1基因rs4961位点多态性的分型检测方法与流程

本发明涉及基因检测技术领域，具体是进行add1基因rs4961位点多态性的分型检测方法。

背景技术：

高血压以收缩或舒张压持续增高为主要表现，是最常见的心血管疾病，同时也是其他心脑血管疾病的主要危险因素。高血压可分为原发性高血压和继发性高血压，其中病因不明的高血压被称之为原发性高血压，占总高血压的95%以上。长期的高血压会使心脏和血管结构及功能发生改变，是引起心肌梗死、心力衰竭、慢性肾脏病及脑卒等疾病的重要因素，给家庭和社会造成沉重的负担。

高血压是一种由遗传和环境因素共同作用的多基因遗传疾病，研究证实高血压有明显的遗传倾向，人群中个体间20%-60%的血压水平变异归因于遗传因素。随着单核苷酸多态性研究的深入，科研工作者发现了多个与高血压易感性密切相关的单核苷酸多态性位点。人体内水钠代谢平衡在血压调控和高血压发病及防治中发挥着重要的作用，其中，α-内收蛋白（α-adducin，add1）基因是一种细胞骨架蛋白，含有多个与膜蛋白相互作用的位点，add1蛋白能参与细胞信号的转导，同时其与钠钾泵atp酶α2亚基之间也相互作用，共同参与细胞膜离子转运。

add1有关位点的多态可引起盐离子的代谢紊乱，其中，位点rs4961的多态性与钠离子浓度变化具有显著相关性，且与人体血压调节密切相关。研究发现rs4961位点等位基因t的携带者在相同的环境中具有更高的易感性。因此，建立简单、快捷的高血压易感基因add1多态性位点的检测方法，通过对单核苷酸多态性进行基因分型，筛选与高血压相关的单核苷酸多态性，从遗传学水平为高血压危险因素的预测和防治提供思路，使人们可以通过对健康人群或早期出现高血压危险因素群体的基因多态性分型，及时预测和评价高血压疾病风险，为高血压疾病的早期预防和及时治疗提供理论的指导。

目前，基因多态性检测最常用的方法为测序法，测序法优势是可以同时进行高通量多位点的检测，但其操作复杂耗时长且灵敏度低，容易出现样本间交叉污染且不能实现样本的快速检测；高分辨率溶解曲线法快速、简便、经济实用，但是它对仪器要求高，其使用的分析仪器即需要安装高分辨率软件且需对温度高度敏感，临床推广存在困难。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供重复性好、灵敏度高的进行add1基因rs4961位点多态性的分型检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

进行add1基因rs4961位点多态性的分型检测方法，采用add1基因特异性的引物seq1和seq2扩增add1基因片段，同时在add1基因特异性的引物界定的扩增区域内设计add1基因特异性taqman探针seq3-fam-t和seq4-vic-g；若位点为t，则add1基因特异性taqman探针seq3-fam-t释放fam荧光信号而被定量pcr仪器检测确认位点为t；若位点为g，则add1基因特异性taqman探针seq4-vic-g释放vic荧光信号而被定量pcr仪器检测确认位点为g，最终通过fam/vic信号的比值来判断位点基因型；

所述add1基因特异性的引物seq1的核苷酸序列号如下：

5´-cccactcagacacagtttt-3´；

所述add1基因特异性的引物seq2的核苷酸序列号如下：

5´-acaccttagtcttcgacttg-3´；

所述add1基因特异性taqman探针seq3-fam-t的核苷酸序列号如下：

fam-5´-ctgcttccattctgccattc-3´-mgb；

所述add1基因特异性taqman探针seq4-vic-g的核苷酸序列号如下：

vic-5´-tgcttccattctgcccttc-3´-mgb。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明是基于基因特异性pcr结合taqman探针判断基因snp位点分型靠的方法，本发明采用add1特异性的基因扩增和taqman探针，基于taqman探针定量pcr方法进行目的基因分型检测具有简便快捷，重复性高，灵敏度高，特异性好的特点。

附图说明

图1为本发明实施例中人add1基因rs4961位点tt基因型特异性片段扩增曲线示意图。

图2为本发明实施例中人add1基因rs4961位点gt基因型特异性片段扩增曲线示意图。

图3为本发明实施例中人add1基因rs4961位点gg基因型特异性片段扩增曲线示意图。

图4为本发明实施例中人add1基因rs4961位点的检测结果分布示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

请参阅图1-4，进行add1基因rs4961位点多态性的分型检测方法，采用add1基因特异性的引物seq1和seq2扩增add1基因片段，同时在add1基因特异性的引物界定的扩增区域内设计add1基因特异性taqman探针seq3-fam-t和seq4-vic-g；若位点为t，则add1基因特异性taqman探针seq3-fam-t释放fam荧光信号而被定量pcr仪器检测确认位点为t；若位点为g，则add1基因特异性taqman探针seq4-vic-g释放vic荧光信号而被定量pcr仪器检测确认位点为g，最终通过fam/vic信号的比值来判断位点基因型；

所述add1基因特异性的引物seq1的核苷酸序列号如下：

5´-cccactcagacacagtttt-3´；

所述add1基因特异性的引物seq2的核苷酸序列号如下：

5´-acaccttagtcttcgacttg-3´；

所述add1基因特异性taqman探针seq3-fam-t的核苷酸序列号如下：

fam-5´-ctgcttccattctgccattc-3´-mgb；

所述add1基因特异性taqman探针seq4-vic-g的核苷酸序列号如下：

vic-5´-tgcttccattctgcccttc-3´-mgb。

实施例：

（1）测试用正常人基因组dna制备：

采取正常人口腔咽拭子，chlex100抽提制备，正常人基因组dna浓度稀释到10ng/μl。

（2）pcr特异性引物和探针设计合成

根据人add1基因基因序列设计合成基因特异性引物seq1，seq2和add1特异性taqman基因探针标记seq3-fam-t和seq4-vic-g。

（3）add1定量pcr检测：

1）引物探针混合物配置：

2）反应体系：引物探针混合物1.5μl，2倍tiantoughgenotypingqpcrpremix(probe)12.5μl，标准模板1.5μl，ddh2o9.5μl。

3）定量pcr仪：abi7500。

4）反应条件：95℃2分钟；95℃15秒——60℃32秒，42循环。

（4）基因验证结果读取：

参见图1-4，图1-3中横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号，检测到vic、fam信号确定为扩增成功。根据样本fam/vic比值确定具体样本的基因型。

本发明是基于基因特异性pcr结合taqman探针判断基因snp位点分型靠的方法，本发明采用add1特异性的基因扩增和taqman探针，基于taqman探针定量pcr方法进行目的基因分型检测具有简便快捷，重复性高，灵敏度高，特异性好的特点。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。