一种与黄芩中黄酮合成物相关的基因序列及其应用的制作方法

本发明涉及药用植物基因工程领域，具体涉及参与黄芩中黄酮类化合物合成相关的基因序列及其应用。更具体地说，涉及克隆一条黄酮合成酶和两条黄酮羟化酶的基因，转化上述基因均可以有效提高黄芩中黄酮类次生代谢产物含量。

背景技术

黄芩，为唇形科黄芩属的多年生草本植物，两千年来一直被作为传统的药用植物；主要用其治疗上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾等症。现代医学研究表明，黄芩中主要的活性成分，为其根中大量存在的黄酮类物质：黄芩素，汉黄芩素及其糖基化产物黄芩苷，汉黄芩苷。根据动物细胞实验发现，上述物质能够作为抗氧化剂，自由基清除剂并具有抑制癌基因表达的活性。

随着黄芩的药理活性研究的广泛和深入，针对黄芩素，汉黄芩素及其糖基化产物黄芩苷，汉黄芩苷的合成途径，特别是在分子生物学水平及生化水平上的合成途径的研究逐渐成为研究的热点。与一般的黄酮类化合物不同的是，黄芩素、汉黄芩素是一类特异的黄酮。它们在黄酮的b环上不含有4’位羟基。而a环上具有大多数黄酮不具有的6-羟基(黄芩素)或8位甲氧基(汉黄芩素)。

黄酮类化合物一般以苯丙氨酸为合成起始物，经过pal，c4h，4cl，chs，chi合成柚皮素，之后经过作用于不同碳位的黄酮羟化酶继而合成相应的黄酮类化合物。由于黄芩素、汉黄芩素在b环上不含有4’位羟基，而且目前植物中也未报道过能够除去柚皮素4’位羟基的酶。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，发明人推测合成黄芩素、汉黄芩素存在一条尚未发现的合成途径。即同样以苯丙氨酸为起始物质，经过pal，4cl，chs，chi，在没有c4h的参与下合成不带4’-羟基的松属素，之后在黄酮合成酶(sbfnsii-2)的作用下生成白杨素，从白杨素开始分别经黄酮6-羟化酶(sbf6h)合成黄芩素；经黄酮8-羟化酶(sbf8h)及8位甲氧基转移酶合成汉黄芩素。本发明首次从唇形科黄芩属药用植物黄芩中克隆到编码参与黄芩素、汉黄芩素及其苷基合成途径的sbfnsii-2、sbf6h、sbf8h的三条基因及其编码的蛋白。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种与黄芩中黄酮类化合物合成相关的基因，其包括如seqidno.1所示序列的黄酮合成酶基因、如seqidno.3所示序列的黄酮6位羟化酶基因、如seqidno.5所示序列的黄酮8位羟化酶基因中的一种或多种。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地，黄酮合成酶(sbfnsii-2)基因的读码框位于1-1518位；黄酮6位羟化酶(sbf6h)基因的读码框位于1-1554位；黄酮8位羟化酶(sbf8h)基因的读码框位于1-1581位。

本发明还提供一种用于扩增上述与黄芩中黄酮类化合物合成相关的基因的全序列或部分片段的引物组合物。

优选地，该引物组合物包括seqidno.7-seqidno.8所示序列组成的引物对、seqidno.9-seqidno.10所示序列组成的引物对、seqidno.11-seqidno.12所示序列组成的引物对中的一种或多种。

优选地，所述引物组合中的每一引物均具有gateway重组位点。

本发明还提供一种由上述与黄芩中黄酮类化合物合成相关的基因编码的蛋白。

优选地，由seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5所示序列的基因中的至少一个通过一个或几个核苷酸的添加、删除、取代而得到的序列，其编码与所述基因序列功能相同的蛋白。

优选地，如seqidno.1所示序列的黄酮合成酶基因编码的蛋白为seqidno.2所示序列，如seqidno.3所示序列的黄酮6位羟化酶基因编码的蛋白为seqidno.4所示序列，如seqidno.5所示序列的黄酮8位羟化酶基因编码的蛋白为seqidno.6所示序列。

本发明还提供一种含有与黄芩中黄酮类化合物合成相关的基因的全序列或部分片段的重组载体、宿主细胞或转基因细胞系。

优选地，所述重组载体包括亚克隆载体，大肠杆菌，酵母等微生物细胞表达载体及植物表达载体；所述宿主细胞包括大肠杆菌、酵母等微生物细胞及植物细胞及植物体；所述转基因细胞系包括转基因植物细胞或转基因植物。

最后，本发明提供一种上述基因，上述引物组合物，或上述重组载体、宿主细胞或转基因细胞系在体外合成黄酮类化合物中的应用。

优选地，在体外合成黄酮类化合物中的应用包括如下步骤：

(1)采用seqidno.7-seqidno.12所示序列的引物组合物来扩增核苷酸序列分别为seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5的黄芩黄酮合成酶、黄酮6位羟化酶、黄酮8位羟化酶基因。

(2)利用gateway技术构建含黄芩黄酮合成酶、黄酮6位羟化酶、黄酮8位羟化酶基因的重组载体；

(3)将重组载体转入宿主细胞或转基因细胞系，并在培养基中进行培养，在一特定时间的培养周期后，提取培养产物中的黄酮类成分并进行含量测定。

优选地，上述步骤具体如下：

(a)克隆黄酮合成酶(sbfnsii-2)、黄酮6位羟化酶(sbf6h)、黄酮8位羟化酶(sbf8h)基因。

(b)构建含sbfnsii-2，sbf6h，sbf8h基因的植物过表达载体，转化根癌农杆菌，获得用于转化拟南芥的含sbfnsii-2，sbf6h，sbf8h基因的根癌农杆菌菌株；

(c)利用步骤(b)所构建的根癌农杆菌菌株转化拟南芥，经pcr验证获得转基因拟南芥植株，在培养基中添加相应的底物，培养两周后对拟南芥中的黄酮类成分进行hplc测定。

(d)构建含sbfnsii-2，sbf6h，sbf8h基因的酵母表达载体，转化酵母菌株，获得含有sbfnsii-2，sbf6h，sbf8h基因的酵母菌株，之后在酵母表达培养基添加相应的底物，培养24h后收集菌体，破碎提取产物并用hplc测定。

表1核苷酸或氨基酸序列表

注：sbfnsii-2-f、sbfnsii-2-r、sbf6h-f、sbf6h-r、sbf8h-f、sbf8h-r的核苷酸序列中的标注下划线的碱基为gateway重组位点。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的目的在于克隆黄芩中的黄酮合成酶/黄酮6位羟化酶/黄酮8位羟化酶基因，解析黄芩素、汉黄芩素的合成途径，同时预测这几种酶基因在黄芩黄酮类物质积累过程的重要作用；本发明涉及黄芩sbfnsii-2，sbf6h，sbf8h基因的克隆，同时在外源植物以及微生物体内验证上述酶的功能，本发明中由上述基因编码的蛋白能够参与合成黄芩素、汉黄芩素以及催化具有相似结构的黄酮类物质的合成和羟基化反应，其为生产有效的活性物质提供很好的基础，为大规模生产黄芩素、汉黄芩素及其苷基提供理论基础，也为工业生产其他相关的黄酮类化合物奠定了坚实的基础。

附图说明

图1为酵母体系中黄酮合成酶(sbfnsii-2)酶促反应产物的hplc图谱；

图2为酵母体系中黄酮6位羟化酶(sbf6h)酶促反应产物的hplc图谱；

图3为酵母体系中黄酮8位羟化酶(sbf8h)酶促反应产物的hplc图谱；

图4为拟南芥体系中黄酮合成酶(sbfnsii-2)酶促反应产物的hplc图谱；

图5为拟南芥体系中黄酮6位羟化酶(sbf6h)酶促反应产物以及黄酮8位羟化酶(sbf8h)酶促反应的hplc图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种与黄芩中黄酮类化合物合成相关的基因，其包括如seqidno.1所示序列的黄酮合成酶基因，和/或如seqidno.3所示序列的黄酮6位羟化酶基因，和/或如seqidno.5所示序列的黄酮8位羟化酶基因，并提供了扩增上述基因的引物组合物，以及由该基因编码的蛋白，以及含有上述基因的重组载体、宿主细胞或转基因细胞系，及其应用。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的各种试剂盒、酶均购于天根生化科技有限公司和thermofisher公司，质粒pk7wg2r购于thermofisher公司，质粒pdoner207购于thermofisher公司。

实施例1

本实施例为克隆黄芩黄酮合成酶(sbfnsii-2)基因、黄酮6位羟化酶(sbf6h)基因、黄酮8位羟化酶(sbf8h)基因及构建相应植物过表达载体和酵母表达载体。

(1)sbfnsii-2、sbf6h、sbf8h基因引物设计与合成；

首先对黄芩转录组进行深度测序，然后，分别根据genbank中已有的sbfnsii-2和sbf6h基因序列进行比对，以唇形科植物已报道过的近缘物种相关序列为标准，选取部分编码蛋白相似度>60％的序列，绘制进化树后，得到黄芩中的相关基因序列，利用primerpremier5.0设计引物全长引物，同时在sbfnsii-2，sbf6h，sbf8h的引物还各自加上了gateway重组位点(gateway用下划线表示)。

sbfnsii-2-f：

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcccgatggaagtcacactgaatgtggseqidno.7

sbfnsii-2-r：

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtactctccataaaagcagcagcaacagseqidno.8

sbf6h-f：

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggagttgagctctgtcatctatgseqidno.9

sbf6h-r：

ggggaccactttgtacaagaaagctgggttttaatatagagtaggtgacaaccttggseqidno.10

sbf8h-f：

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatgctatatgacaacagccaatacseqidno.11

sbf8h-r：

ggggaccactttgtacaagaaagctgggttctagtaaagagtgggagacaacseqidno.12

引物由上海生工合成。

(2)sbfnsii-2、sbf6h和sbf8h基因的克隆；

以黄芩根为材料，按照rna提取试剂盒的说明书提取黄芩根部的总rna，使用反转录试剂盒进行反转录得到黄芩根部的cdna。

以cdna为模板，分别以sbfnsii-2-f和sbfnsii-2-r，sbf6h-f和sbf6h-r，sbf8h-f和sbf8h-r为引物进行扩增反应，获得sbfnsii-2、sbf6h和sbf8h基因。

pcr反应体系：cdna1μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，phusionhfbuffer10μl，10μmdntpmix1μl，phusionenzyme0.5μl，ddh2o32.5μl。

pcr的设定程序是：1)98℃，3min；2)98℃，10s；3)55℃，20s；4)72℃，1min；5)72℃，5min。循环从2)到4)，循环数40个。

pcr扩增结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得了1518bp的sbfnsii-2基因，1554bp的sbf6h基因，1581bp的sbf8h基因。

(3)构建pdonar207-sbfnsii-2、pdonar207-sbf6h、pdonar207-sbf8h载体；

将步骤(2)中的pcr产物使用天根切胶回收试剂盒回收特异性条带，测定回收产物的浓度，之后进行bp反应。

bp反应：pcr产物100-200ng(3μl)，pdonar207100ng(1μl)，1×te0.5μl，bpclonase酶0.5μl；25℃温育5h，加入0.5μl蛋白酶k37℃温育10min，终止bp反应。

将上述反应产物转化大肠杆菌dh5α，将菌液涂布在含有20mg/l的庆大霉素(gen)的lb固体培养基上，37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单克隆进行菌落pcr验证，将阳性克隆送到生工公司测序。根据测序结果提取质粒，得到质粒pdonar207-sbfnsii-2，pdonar207-sbf6h，pdonar207-sbf8h。

(4)构建sbfnsii-2、sbf6h、sbf8h基因的植物过表达载体和酵母表达载体；

针对sbfnsii-2基因植物过表达载体使用的是载体pk7wg2r，sbf6h和sbf8h使用的是载体ph7wg2，酵母表达载体则均使用的是载体pyes-dest52。将步骤(3)中的经bp反应得到的质粒测定浓度后，进行lr反应。

lr反应：bp反应质粒100-200ng(3μl)，pk7wg2r/ph7wg2/pyes-dest52100ng(1μl)，1×te0.5μl，lrclonase酶0.5μl；25℃温育5h，加入0.5μl蛋白酶k37℃温育10min，终止lr反应。将上述反应产物转化大肠杆菌dh5α，将菌液涂布在含有50mg/l的壮观霉素(spe)和氯霉素(chl)的lb固体培养基上，37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单克隆进行菌落pcr验证。得到的阳性克隆提取质粒即得到含有目的基因的植物过表达载体和酵母表达载体。

实施例2

本实施例为在酵母体系中验证黄芩sbsbfnsii-2，sbf6h，sbf8h基因的蛋白功能。

在酵母中表达黄芩sbsbfnsii-2，sbf6h，sbf8h基因的蛋白。

将酵母表达载体pyes-dest52-sbfnsii-2，pyes-dest52-f6h，pyes-dest52-f8h用化学转化的方法转入酿酒酵母wat11菌株中，得到含有目的基因的酵母菌株，同时转化含有pyes-dest52空质粒作为阴性对照，在含有葡萄糖且缺失uracil(ura)的sd固体培养基中28℃生长24-48h。

然后挑取单克隆在10ml含有葡萄糖且缺失his的sd液体培养基中28℃，200rpm下生长24h至od600达到2-3。收集菌体，用无菌水洗掉菌体中的葡萄糖。用20ml含有半乳糖且缺失ura的sd液体培养基将菌体重悬，28℃200rpm培养2h诱导目的蛋白表达。然后向培养基中添加100μm相应蛋白的反应底物。培养24h小时后收集菌体。

收集菌体后，用1ml的70％甲醇溶解菌体，超声破碎2h提取代谢产物。12000rpm离心5min取上清，用0.22μm的有机滤膜过滤，即得样品，用于hplc检测。

hplc检测条件：waters2659高效液相色谱仪，rp-watersc18(100×2mm，3μm)柱，检测波长280nm。流动相条件：流速0.26ml/min，流动相为0.1％甲酸水(a)和乙腈/甲醇(1:1)+0.1％甲酸(b)，柱温35℃，梯度洗脱：0-3min，20％b；20min，50％b；20-30min，50％b；36min，30％b；37min，20％b；37-43min，20％b。

由图1～图3的结果表明：在酵母体系中，黄芩根特异性表达的黄酮合成酶(sbfnsii-2)只能够催化松属素生成白杨素，对柚皮素或圣草酚没有活性，说明sbfnsii-2对于含有4’-oh的底物没有活性。黄酮6位羟化酶(sbf6h)能够催化白杨素生成黄芩素。黄酮8位羟化酶(sbf8h)则以白杨素为底物生成去甲汉黄芩素。

实施例3

本实施例为在外源植物拟南芥中验证黄芩sbfnsii-2，sbf6h，sbf8h基因的蛋白功能。

使用电击转化的方法将植物表达载体pk7wg2r-sbfnsii-2，ph7wg2-sbf6h和ph7wg2-sbf8h转入根癌农杆菌菌株gv3101pmp90中，同时将含有camv35s启动子的空质粒转入菌株作为阴性对照。

野生型拟南芥col-0作为转基因材料。拟南芥种子播种到土壤，4℃避光保存两天，然后转移至光照时间为16h，温度23℃及湿度50％的培养间中进行培养。通过花序浸染发转化拟南芥，待收取种子后，将t1代种子播种到含有卡纳霉素(kan)抗性的ms培养基上进行筛选，然后转移至土壤。通过pcr进行验证得到的阳性转基因植株，之后收集阳性植株的t3代种子。

t3代种子播种到ms培养基上，生长两周的小苗转移至含有或不含有相应底物的ms培养基上，生长三周后收集材料。洗净后，冻干，磨碎，用1ml70％的甲醇提取10mg干重的材料，室温下超声破碎1h。12000rpm离心5min取上清，使用0.22μm的有机滤膜进行过滤，制备样品，用于hplc检测。

hplc检测条件：waters2659高效液相色谱仪，rp-watersc18(100×2mm，3μm)柱，检测波长280nm。流动相条件：流速0.26ml/min，流动相为0.1％甲酸水(a)和乙腈/甲醇(1:1)+0.1％甲酸(b)，柱温35℃，梯度洗脱：0-3min，20％b；20min，50％b；20-30min，50％b；36min，30％b；37min，20％b；37-43min，20％b。

由图4～图5的结果表明：在拟南芥体系中，黄芩根特异性表达的黄酮合成酶(sbfnsii-2)只能够催化松属素生成白杨素，对柚皮素或圣草酚没有活性，说明sbfnsii-2对于含有4’-oh的底物没有活性。黄酮6位羟化酶(sbf6h)能够催化白杨素生成黄芩素。黄酮8位羟化酶(sbf8h)则以白杨素为底物生成去甲汉黄芩素。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

sequencelisting

<110>上海辰山植物园

<120>一种与黄芩中黄酮合成物相关的基因序列及其应用

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<223>黄酮合成酶基因序列

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