一种HCV重组融合抗原及其应用的制作方法

本发明涉及体外检测诊断试剂，具体地说，涉及一种用于检测hcv的重组融合抗原。
背景技术：
：丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus，hcv)感染是重大的健康问题，全球的平均感染率约为3％。超过75％的急性感染个体最终发展成慢性携带状态，最终导致肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。丙型肝炎病毒主要通过血液传播，占输血后肝炎的80-90％。目前hcv感染的治疗方法是干扰素和利巴韦林药物联合用药，但该治疗方法并不是在所有情况下都有效。由于目前没有丙型肝炎的有效治疗药物，尽早发现hcv感染，准确判断病毒亚型及患者感染状况，是防控丙型肝炎的重要手段。因此，利用灵敏度高、特异性强、稳定性好的诊断试剂对血源及血液制品等执行严格hcv筛查程序，对有效防控丙型肝炎起重要作用。hcv病毒属于黄病毒科的肝炎病毒属，其基因组为9.6kb的正义、单链rna，编码一个3011个氨基酸的多蛋白前体。多蛋白前体在宿主及病毒自身蛋白酶的作用下，被切割成多个功能蛋白，包括3种结构蛋白，即核衣壳蛋白core，囊膜糖蛋白e1和囊膜糖蛋白e2；以及6种非结构蛋白，即ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a及ns5b。自1989年hcv被发现以来，国际hcv诊断试剂已经发展到了第三代。第一代抗-hcvelisa诊断试剂采用的抗原是c100-3，c100-3是hcv非结构基因(ns3/ns4)和人超氧化物歧化酶(sod)基因嵌合后表达的融合蛋白，全长为527个氨基酸，其中c100占363个氨基酸，sod占154个氨基酸。应用c100-3对献血员进行hcv筛查后，输血后丙型肝炎发病率下降84％。但第一代抗体有几点不足:1、灵敏度低，有假阴性；2、特异性低，易出现假阳性；3、不能作为传染性的指标。仅17～25％的抗c100-3阳性的血制品可以传播hcv；4、不宜用于急性丙型肝炎的早期诊断，由于抗c100出现较晚，输血后获得性丙型肝炎病人抗c100-3抗体阳性的平均时间为18周。为弥补第一代试剂的不足，又发展了第二代抗-hcvelisa诊断试剂。第二代抗-hcvelisa诊断试剂包含hcv核衣壳区重组蛋白c22-3和非结构蛋白ns3区重组蛋白c33c抗原。第二代抗-hcvelisa诊断试剂，在hcv感染高危人群(如肾透析病人，静脉毒品成瘾者和血友病患者)中，抗hcv检出率较第一代高5～40％；在急性输血后丙型肝炎和散发性丙型肝炎中，抗hcv检出率高于第一代约20％以上，在慢性丙型肝炎中，抗hcv检出率较第一代增加10％以上。此外，hcv患者血清转换的窗口期从第一代抗-hcvelisa诊断试剂的18周缩减为10周。但第二代抗-hcvelisa诊断试剂仍存在假阳性问题和少数漏检问题。1996年fda批准了第三代抗-hcvelisa试剂，与第二代抗-hcvelisa试剂相比，增加了hcvns5区作为包被抗原，可检出单独ns5抗体阳性者，使特异性达到99％。目前公认的丙型肝炎病毒确诊试剂是hcv3.0riba，该试剂包含2个重组抗原(c33c，ns5)和3个合成肽(c100，c22，5-1-1)，可用于确定可疑阳性标本。人工合成多肽抗原具有特异性好，无感染性等优点，但也存在一些缺点，合成多肽分子量较小，不易吸附至固相；结构较短，与抗体亲和力低，所包含的表位较少，易发生漏检；合成肽的成本较高，不利于推广等。除了漏检风险之外，由于丙型肝炎病毒诊断试剂中使用的主要原材料重组抗原是生物活性物质，其活性易受温度的影响而失活，抗原的热稳定性较差，同时在制备成hcv检测试剂盒之后均要求于2-8℃保存，受环境温度影响也较大。在实际使用过程中，由于检测试剂盒的保存条件有时并不能尽如人意，人们通常希望检测试剂盒在经过恶劣的环境变化后还能保持高度的稳定性与可信度。因而，一个具有降低漏检风险、提高耐热性能的hcv重组融合抗原是丙型肝炎病毒诊断检测中一直追求的目标。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强且热稳定性好地检测hcv抗体的重组融合抗原。为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：本发明首先提供一种hcv重组融合抗原，所述融合抗原由core抗原(2-102aa)、柔性连接子和ns5抗原(2322-2422aa)构成。该融合抗原在设计上，首先经过对核衣壳蛋白抗原区域的优化，去除c端多余氨基酸，选择2-102aa抗原区域，降低假阳率而不损害灵敏度。而后，在上述核衣壳蛋白的基础上添加非结构蛋白ns5的2322-2422aa氨基酸区域，很大程度提高了所述融合抗原的灵敏度和热稳定性。由于核衣壳蛋白的等电点很高，重组蛋白在普通的buffer条件下极不稳定，导致其纯化、保存困难，需添加表面活性剂。表面活性剂的添加，增大了纯化成本。同时，表面活性剂对hcv诊断体系也有影响，容易导致假阳性的出现。本发明采用hcv核衣壳蛋白及非结构蛋白ns5融合表达的方法，可很大程度提高重组抗原的亲水性和稳定性，并且不损害重组抗原的抗原性。不仅如此，本发明根据hcv核衣壳蛋白及非结构蛋白ns5抗原表位的一级结构和二级结构的特点选择柔性连接子进行连接，该柔性连接也提高了融合抗原的亲水性，并且可以使hcv核衣壳蛋白(core抗原)及非结构蛋白ns5抗原表位更好的折叠形成正确的空间结构，很大程度的提高了融合抗原的亲水性和稳定性，并且不损害融合抗原的抗原性。更为具体地，所述融合抗原由seqidno.1所示蛋白、柔性连接子和seqidno.2所示蛋白构成。融合抗原中的上述元件不需采用天然hcv多蛋白中正常出现的顺序。因此，core抗原可位于融合蛋白的n-和/或c-末端。所述融合抗原由n端到c端依次为：seqidno.1所示蛋白、柔性连接子和seqidno.2所示蛋白；或依次为：seqidno.2所示蛋白、柔性连接子和seqidno.1所示蛋白。进一步地，所述柔性连接子的氨基酸序列如seqidno.3所示。作为优选，所述融合抗原的氨基酸序列如seqidno.7所示。在上述基础上，所述融合抗原的编码基因也属于本发明的保护范围。进一步地，所述融合抗原的编码基因由编码hcv核衣壳蛋白、柔性连接子和非结构蛋白ns5抗原的核苷酸序列组成。可选地，由seqidno.4、5、6所示的核苷酸序列组成。所述编码基因的核苷酸序列，还取决于前述融合蛋白中n端至c端的元件顺序。作为优选，所述编码基因为如下(1)～(3)之一：(1)seqidno.8所示的核苷酸序列；(2)与(1)编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)不同的序列；(3)在(1)或(2)的基础上进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的，且编码相同蛋白质的核苷酸序列。其编码得到的融合蛋白由n端至c端依次为hcv核衣壳蛋白、柔性连接子和非结构蛋白ns5抗原。进一步地，含有前述融合蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞或工程菌也属于本发明的保护范围。本发明进一步提供了前述融合抗原及其编码基因在制备hcv检测试剂盒方面的应用。所述应用具体为，将所述融合抗原的编码基因构建重组表达载体，转化至工程菌中诱导表达，得到融合抗原。纯化后经复性处理，获得可溶的融合抗原，利用其包被免疫磁珠后，用于检测hcv抗体。经验证，本发明制备的重组融合抗原尽管是以包涵体形式表达的，但十分容易复性，只需要常规的pbs等普通buffer即可成功获得可溶的抗原。不需要添加表面活性剂，从而克服了hcv核衣壳蛋白由于必须添加表面活性剂而在免疫检测的应用中受限的缺点。因此，含有本发明所述融合抗原的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种重组融合hcv抗原，该融合抗原涵盖了hcv核衣壳蛋白及非结构蛋白ns5的优势抗原表位区域，具有很高的灵敏度、很强的特异性以及良好的热稳定性。同时，本发明公布了经筛选后的hcv核衣壳蛋白及非结构蛋白ns5的氨基酸序列、核苷酸序列，以及整个抗原设计构建的技术路线，为高品质丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒(化学发光法)的开发奠定基础。附图说明图1为本发明实施例2中重组表达质粒的酶切鉴定图；从左到右，依次为：markerdl10000、酶切结果：pet28a-1025。图2为本发明实施例3中重组抗原诱导表达鉴定图；从左到右，依次为：蛋白marker、诱导前菌样、诱导后菌样。图3为本发明实施例4中重组抗原纯化电泳图；从左到右，依次为：蛋白marker、菌体破碎上清、包涵体溶解上清、穿透样品、洗脱目的蛋白。图4为本发明实施例4中重组抗原复性电泳图；从左到右，依次为：蛋白marker、复性过程中的沉淀蛋白、复性重组抗原。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1hcv重组融合抗原的设计由于病毒性传染病的抗原往往较大，在体外难以实现完整抗原蛋白的表达，或者即使实现体外表达，分子量比较大的抗原蛋白也往往不能正确折叠，导致后期的复性困难，或者复性获得的抗原活性很差，制约了检测试剂的开发。因此利用基因工程技术，将多个优势抗原表位基因融合表达成为抗原研究的方向。本发明通过大量实验的筛选，最后确定选取core(2-102aa)、ns5(2322-2422aa)两个优势抗原表位，对密码子进行优化后通过亲水性较强的柔性连接gggsgg将其串联。选取的core的抗原表位为2-102aa，其氨基酸序列为seqidno.1，对应的优化后的核苷酸序列为seqidno.4。选取的ns5的抗原表位为2322-2422aa，其氨基酸序列为seqidno.2，对应的优化后的核苷酸序列为seqidno.5。将上述两个抗原表位通过相应的连接子串联后的氨基酸序列为core+ns5(seqidno.7)，该hcv重组融合抗原对应优化后的核苷酸组成序列为core+ns5(seqidno.8)。以上优化的编码hcv重组融合抗原的表达基因序列采用化学合成的方法得到核苷酸序列core+ns5(seqidno.8)。以core+ns5(seqidno.8)为模板，以core+ns5-f(seqidno.9)、core+ns5-r(seqidno.10)为引物进行pcr扩增。pcr反应体系为：pcr反应条件为：94℃，5分钟；94℃，30秒，59℃，30秒，72℃，1分钟(扩增30个循环)；72℃，5分钟。扩增产物用1％tae琼脂糖凝胶电泳检测。用axygen小量胶回收试剂盒回收。即得到目的基因片段1025(seqidno.11)。实施例2hcv重组融合抗原表达载体的构建将实施例1中得到的目的基因片段1025(seqidno.11)和表达载体pet28a分别经限制性内切酶ecori和xhoi双酶切处理。目的基因片段1025的酶切反应体系为：表达载体pet28a的酶切反应体系为：37℃水浴酶切过夜。酶切产物用1％tae琼脂糖凝胶电泳检测。用axygen小量胶回收试剂盒回收。16℃连接4h，并将连接产物通过热激法转入感受态e.colidh5α细胞，涂布于含50μg/mlkan+的lb琼脂培养基上，在37℃条件下，倒置培养过夜或培养12～14小时至长出单菌落。利用菌液pcr进行初步筛选。具体做法是首先用无菌牙签挑取单菌落于含有1mllb(50μg/mlkan+)的1.5mleppendoff管中，37℃振荡培养4小时后取出菌液备用。按下列比例加好pcr反应体系(20μl)：加好反应体系后，用小枪头吸取1.0μl培养过的菌液，混于混合物中，放入pcr仪后开始扩增。pcr反应条件为：94℃，5分钟；94℃，30秒，59℃，30秒，72℃，1分钟(扩增30个循环)；72℃，5分钟。扩增产物用1％tae琼脂糖凝胶电泳检测。用双酶切鉴定进行进一步的鉴定。具体做法是：吸取10μl经菌液pcr鉴定正确的克隆子菌液，加入到含有5mllb(50μg/mlkan+)的15ml试管中，37℃振荡培养过夜。用axygen小量质粒试剂盒进行质粒提取。用限制性内切酶ecori和xhoi进行双酶切鉴定。酶切反应体系为：37℃水浴酶切2h。酶切产物用1％tae琼脂糖凝胶电泳检测。对经菌液pcr和质粒酶切鉴定正确的菌液进行菌种保存后送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果与预期一致。未发生碱基置换、缺失或者添加；双酶切鉴定可见一条大小600bp左右的目的片段，与seqidno.8的片段大小一致(见图1)。说明目的基因成功克隆至表达载体pet28a，将其命名为pet28a-1025。实施例3hcv重组融合抗原的诱导表达将测序正确的酶切鉴定过的阳性重组质粒pet28a-1025用热激法转化大肠杆菌e.colibl21(rossetta)感受态细胞，涂布于含50μg/mlkan+和25μg/mlchl+的lb琼脂培养基上，在37℃条件下，倒置培养过夜或培养12～14小时至长出单菌落。挑取2个单菌落接种至含50μg/mlkan+和25μg/mlchl+的5mllb液体培养基中，37℃，200r/min培养过夜。次日，取200μl菌液转接于5ml新鲜的含50μg/mlkan+和25μg/mlchl+的lb液体培养基中，37℃，200r/min培养至od600≈0.8。加入iptg至终浓度1mm，于37℃下继续振荡培养4小时。诱导结束后进行sds-page电泳(见图2)。将诱导出目的蛋白的克隆子菌液进行菌种保存，并将其命名为rpet28a-1025。选择诱导出目的蛋白的克隆子rpet28a-1025按上述确定的诱导条件进行大量发酵培养2000ml。收集菌体，并用20mmpbsph7.4的缓冲液洗涤两次。rpet28a-1025菌体冻存于-20℃。实施例4hcv重组融合抗原的纯化用破菌缓冲液(20mmpbsph7.4，0.5mnacl)重悬rpet28a-1025发酵菌体，加入1mmpmsf后冰浴条件下超声破碎(超声破碎条件为：超声5s，间隔10s，超声总时间为15min，共循环4次)；超声结束后12000rpm/min，4℃条件下离心15min；去上清。用上样缓冲液(20mmpbsph7.4，0.5mnacl，8m尿素)重悬包涵体沉淀，加入1mmpmsf后冰浴条件下超声破碎包涵体沉淀，(超声破碎条件为：超声5s，间隔10s，超声总时间为15min，共循环2次)，而后2-8℃放置2-4h，使包涵体充分溶解；包涵体溶解后，12000rpm/min，4℃条件下离心15min；取上清进行纯化。上样缓冲液为20mmpbsph7.4，0.5mnacl，8m尿素；平衡缓冲液为：20mmpbsph7.4，0.5mnacl，8m尿素，30mm咪唑；洗脱缓冲液为：20mmpbsph7.4，0.5mnacl，8m尿素，300mm咪唑。分别取破碎上清、流穿样品、洗脱目的蛋白的小样进行sds-page电泳，目的蛋白大小与预期一致(见图3)，蛋白纯度大于80％，重组蛋白命名为1025。实施例5hcv重组融合抗原的复性对纯化后的目的蛋白进行尿素梯度稀释复性处理。具体为：将目的蛋白装入分子量3000的透析袋中，在20mmpbsph7.4，5mmedta，0.1％pc300，4m尿素透析液中透析处理4h；而后将目的蛋白转入20mmpbsph7.4，5mmedta，0.1％pc300，2m尿素透析液中透析处理4h；而后将目的蛋白转入20mmpbsph7.4，5mmedta，0.1％pc300，1m尿素透析液中透析处理4h；而后将目的蛋白转入20mmpbsph7.4，5mmedta，0.1％pc300，0.5m尿素透析液中透析处理4h；而后将目的蛋白转入20mmpbsph7.4，5mmedta，0.1％pc300透析液中透析处理4h，重复该操作一次。收集目的蛋白透析液，12000rpm/min，4℃条件下离心15min。上清即为复性后的hcv重组融合抗原。取小样进行行sds-page电泳。目的蛋白大小与预期一致，蛋白纯度大于80％(见图4)。实施例6hcv重组融合抗原的灵敏度检测在其它生产工艺完全一致的情况下，用本发明的实施例5所制备的hcv重组融合抗原代替四川迈克生物科技股份有限公司生产的丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒(化学发光法)中的所使用的免疫磁珠包被蛋白1(含core(2-120aa)、ns5(2212-2313aa)区域的嵌合抗原)(暂命名为：所述hcv重组融合抗原制备的1025丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒(化学发光法))，并检测丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品，进行本发明蛋白的灵敏度评价。将四川迈克生物科技股份有限公司生产的丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒(化学发光法)作为对照试剂盒。结果表明本发明重组融合抗原对丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品检测均能达到国家标准，能满足免疫诊断试剂开发的需求(见表1)表11025丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒(化学发光法)灵敏度检测结果注：rlu：信号值；s/co＜1阴，s/co≥1阳。注：丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品，其中n1～n30为阴性参考品；p1～p30为阳性参考品，l1～l4为最低检出限参考品。阴性参考品要求≥29/30，实际检测结果为30/30；阳性参考品要求≥29/30，实际检测结果为29/29；最低检出限参考品要求≥2/4(l4需为阴性)，实际检测结果为3/4且l4为阴性。对照试剂盒在2～8℃保存条件下，测试国家参考品漏检4个，不符合要求。含有包被本发明所述hcv重组融合抗原的免疫磁珠的试剂盒，在2～8℃保存条件下，以及在37℃加速热破坏6天后，测试anti-hcv国家参考品均符合要求。实施例7hcv重组融合抗原的临床样本检测在其它生产工艺完全一致的情况下，用本发明的实施例5所制备的hcv重组融合抗原代替四川迈克生物科技股份有限公司生产的丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒(化学发光法)中的所使用的某公司生产的免疫磁珠包被蛋白1(暂命名为：所述hcv重组融合抗原制备的1025丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒(化学发光法))，并检测临床随机样本1167例，进行本发明蛋白的临床样本符合率的评价。结果发现1167例临床随机样本中，1025丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒(化学发光法)检测出阳性样本129例，四川迈克生物科技股份有限公司生产的丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒(化学发光法)对照试剂检测出阳性样本125例(表2)。将检测结果不一致的四个临床样本dj-59、dj-12、dj-64和eps-0358分别用第三方roche试剂进行检测，结果为阳性(表3)。表21025丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒(化学发光法)临床特异性检测结果1025丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒(化学发光法)对照试剂盒临床样本1167例129125表31025丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒(化学发光法)疑似假阳血清确诊结果注：rlu：信号值；s/co＜1阴，s/co≥1阳。由此说明，含有本发明所述hcv重组融合抗原的试剂盒，相比对照试剂盒的检测准确性更高。实施例8hcv重组融合抗原的热稳定性检测对1025免疫磁珠进行37℃加速热破坏，进行本发明蛋白的试剂稳定性评价。结果表明本发明重组融合抗原热加速稳定性能达到公司对该产品的要求，且较现售的免疫磁珠包被蛋白1具有更优的稳定性，能满足免疫诊断试剂开发的需求(表4)。表41025免疫磁珠稳定性验证注：cal1：阴性质控品，cal2：阳性质控品，rep1：重复1，rep2：重复2，ave：平均值虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>四川迈克生物新材料技术有限公司<120>一种hcv重组融合抗原及其应用<130>khp171113001.5<160>11<170>patentinversion3.5<210>1<211>101<212>prt<213>core2-102aa<400>1serthrasnprolysproglnarglysthrlysargasnthrasnarg151015argproglnaspvallyspheproglyglyglyglnilevalglygly202530valtyrleuleuproargargglyproargleuglyvalargalathr354045arglysthrsergluargserglnproargglyargargglnproile505560prolysalaargargprogluglyargthrtrpalaglnproglytyr65707580protrpproleutyrglyasngluglyleuglytrpalaglytrpleu859095leuserproarggly100<210>2<211>101<212>prt<213>ns52322-2422aa<400>2alaproproileproproproargarglysargthrvalvalleuthr151015gluserthrvalserseralaleualagluleualathrlysalaphe202530glyserserlysserseralathraspglyglythralathralapro354045proasphisalaseraspaspglyasplysglyseraspvalgluser505560tyrsersermetproproleugluglygluproglyaspproaspleu65707580seraspglysertrpserthrvalsergluglualasergluaspval859095valcyscyssermet100<210>3<211>6<212>prt<213>linker<400>3glyglyglyserglygly15<210>4<211>303<212>dna<213>core2-102aa<400>4agcacgaatcctaaacctcaaagaaaaaccaaacgtaacaccaaccgccgcccacaggac60gtcaagttcccgggcggtggtcagatcgttggtggagtttacctgttgccgcgcaggggc120cccaggttgggtgtgcgcgcgactaggaagacttccgagcggtcacaacctcgtggaagg180cgacaacctatccccaaggctcgccgtcccgagggaaggacctgggcgcagcccgggtac240ccttggcccctctatggcaatgagggcttggggtgggcaggatggctcctgtcaccccga300ggc303<210>5<211>306<212>dna<213>ns52322-2422aa<400>5gcccccccaataccgcctccacggaggaagaggacggttgtcctgacagagtccaccgtg60tcttctgccttggcggagctcgctactaaggccttcggcagctccaaatcatcggccacc120gacggcggcacggcgaccgcccctcctgaccacgcctccgacgacggcgacaaaggatcc180gacgttgagtcgtactcctccatgcccccccttgagggagagccgggggaccccgatctc240agcgacgggtcctggtctaccgtgagcgaggaggccagtgaggacgtcgtctgctgctca300atgtaa306<210>6<211>18<212>dna<213>linker<400>6ggtgg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