本发明涉及生物制品技术领域，尤其是涉及马尾藻活性多肽的制备方法。
背景技术：
马尾藻（sargassum）是褐藻中的一类海藻，属褐藻口，鹿角菜目，马尾藻科，大多为多年生大型藻类，主要生长在低潮带石沼中或潮下带2-3米水深处的岩石上，大多数为暖水性物种，广泛分布于暖水和温水海域，在我国南北海域均有分布，其中广东、广西马尾藻的产量较高，另外在海南岛和涠洲岛海域也有很高的产量。马尾藻藻体褐色，藻体分固着器、茎、叶和气囊四部分，髙达1米社。固着器盘状，上生圆柱状的主干。主干单生，偶有双生的现象。茎呈现兰棱形，叶子多是披针形，裹多生在末端小枝上，幼期为纺锤形或倒卵形，顶端有针状突起，成熟时为球形或亚圆球形，顶端圆滑或具尖细的突起。马尾藻中含有丰富膳食纤维，褐藻淀粉，矿物质和维生素及优质的高饱和脂肪酸和合理的必需氨基酸组成，其中必需氨基酸的含量远高于海带、紫菜，其余成分与海带、紫菜接近，可作为保健食品和药物的优质原料。我国古代书籍早有记录马尾藻的药用价值，民间传统也常采用马尾藻作为食物或是中草药治疗。《神农本草经》作为我国中药学著作最早记录了马尾藻可用于治疗甲状腺肿。1578年，李时珍撰写的《本草纲目》陈述了马尾藻能够软坚散结、清热化痰、化水利尿。中国现代药典和中药临床实践表明，羊栖菜和海蒿子能用于治疗瘰疬、睾丸肿痛、水肿、动脉硬化、皮肤病、高血压、急性食管炎、慢性支气管炎等。
现有技术如授权公告号为cn102228125b的中国发明专利，公开了海藻活性肽的制备方法，它以食品级海藻酸钠为原料，通过复合酶耦合催化水解，对酶加量、ph值、水解温度和水解时间等关键工艺参数进行控制，保证酶水解效率；水解液进行失活、脱色以及过滤处理后得到海藻多肽提取液；将该提取液分别通过分子量为1000da和300da的纳滤膜进行纯化、浓缩处理，得到分子量在300～1000da范围内的海藻活性肽产品，经灭菌真空干燥后得到海藻活性肽成品。该制备方法原料利用率高、产品纯度高还无需添加脱盐、真空浓缩等工艺，在简化生产工艺的同时也降低了生产成本，但是该制备方法直接对食品级海藻酸钠进行催化水解，不能合理利用藻类成分物质。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种活性蛋白肽得率高、加工周期短、能耗低、生产成本低、适用于工业化生产的马尾藻活性多肽的制备方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：马尾藻活性多肽的制备方法，包括细胞破碎、蛋白提取、蛋白酶解、脱腥、纯化分离，具体包括以下步骤：
细胞破碎：将马尾藻粉按1:35-40料液比加入浓度为3-5%的氢氧化钠溶液，混合均匀，在温度为45-50℃、功率为240-260w的超声波处理25-30min，调节ph至中性，然后经3~5℃、7000~9000rpm的低温离心机离心18~22min，备用，该步骤结合氢氧化钠与超声波进行细胞破壁，不影响蛋白质的活性，能够大大缩短细胞破壁的时间，提高工作效果，可大批量化破碎藻细胞，适用于工业化生产；
蛋白提取：于3-5℃环境中，离心液加入浓度为90-95%的乙醇，加入量为离心液体积的4-5倍，持续搅拌1-2min，静置4-5h，离心，去上清液，去除沉淀残余表面酒精，收集沉淀，用0.09-0.11mol/l、ph为6-7的pbs溶液溶解沉淀，该步骤中利用乙醇可使蛋白质沉淀的机理，加入大量的乙醇，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法蛋白质沉淀效果好，蛋白质中残留的乙醇溶液可在自然状态下挥发出去，不需要进一步处理，节约能耗，降低生产成本；
蛋白酶解：将马尾藻蛋白按1:4-6料液比加水混匀，调节ph至7-8，加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，酶低比为4-5%和3-4%，在50-55℃下酶解3-5h，灭酶，冷却，离心，上清液即为酶解液，该步骤采用双酶酶解法制备马尾藻活性多肽，利用两种蛋白酶作用的专一性，使原料蛋白质充分水解成活性多肽，提高马尾藻蛋白质的转化率，使蛋白质尽可能的降解为活性多肽，且可使活性肽具有味道鲜美、营养丰富的优点；
脱腥：将酶解液中加入0.5-1wt%的β-环糊精，在20-30℃下搅拌80-100min进行脱腥，经0.2-0.3μm微滤膜，滤掉β-环糊精即可得脱腥的酶解液，β-环糊精（β-cd）是环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉产生的一组环状低聚糖，具有“内疏水、外亲水”特殊分子结构，使得cd能作为“宿主”包络不同“客体”化合物，达到脱腥的目的；
纯化分离：将脱腥后的酶解液通过截留分子量为3-5kda的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质，然后通过截留分子量为200-300da的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液，冷冻干燥即得马尾藻活性多肽，该活性物质含有一种活性多肽，其氨基酸序列为hshayysvcgshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，该活性多肽与钙、锌、铁等离子结合，由小肠肠壁细胞吸收后再释放进入血液，从而避免了这些离子在小肠的中性和偏碱性环境中沉淀，促进了它们的吸收，具有促进骨骼和牙齿发育，预防和改善龋齿、佝偻病、骨质疏松等作用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供的马尾藻活性多肽的制备方法，活性蛋白肽得率高、加工周期短、能耗低、生产成本低、适用于工业化生产；该制备方法采用的双酶酶解法可利用两种蛋白酶作用的专一性，使原料蛋白质充分水解成活性多肽，提高马尾藻蛋白质的转化率，使蛋白质尽可能的降解为活性多肽；该提取方法得到的活性多肽能与钙、锌、铁等离子结合，由小肠肠壁细胞吸收后再释放进入血液，从而避免了这些离子在小肠的中性和偏碱性环境中沉淀，促进了它们的吸收，具有促进骨骼和牙齿发育，预防和改善龋齿、佝偻病、骨质疏松等作用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
马尾藻活性多肽的制备方法，包括细胞破碎、蛋白提取、蛋白酶解、脱腥、纯化分离，具体包括以下步骤：
1）细胞破碎：将马尾藻粉按1:38料液比加入浓度为3.5%的氢氧化钠溶液，混合均匀，在温度为48℃、功率为240w的超声波处理30min，调节ph至中性，然后经4℃、7800rpm的低温离心机离心20min，备用，该步骤结合氢氧化钠与超声波进行细胞破壁，不影响蛋白质的活性，能够大大缩短细胞破壁的时间，提高工作效果，可大批量化破碎藻细胞，适用于工业化生产；
2）蛋白提取：于4℃环境中，离心液加入浓度为95%的乙醇，加入量为离心液体积的4倍，持续搅拌1min，静置5h，然后经4℃、7800rpm的低温离心机离心20min，去上清液，去除沉淀残余表面酒精，收集沉淀，用0.1mol/l、ph为6.5的pbs溶液溶解沉淀，该步骤中利用乙醇可使蛋白质沉淀的机理，加入大量的乙醇，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法蛋白质沉淀效果好，蛋白质中残留的乙醇溶液可在自然状态下挥发出去，不需要进一步处理，节约能耗，降低生产成本；
3）蛋白酶解：将马尾藻蛋白按1:5料液比加水混匀，调节ph至7.5，加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，酶低比为4%和3.5%，在52℃下酶解4h，95℃的水浴灭酶18min，冷却至室温，然后经4℃、7800rpm的低温离心机离心20min，上清液即为酶解液，该步骤采用双酶酶解法制备马尾藻活性多肽，利用两种蛋白酶作用的专一性，使原料蛋白质充分水解成活性多肽，提高马尾藻蛋白质的转化率，使蛋白质尽可能的降解为活性多肽，且可使活性肽具有味道鲜美、营养丰富的优点；
4）脱腥：将酶解液中加入0.6wt%的β-环糊精，在25℃下搅拌90min进行脱腥，经0.2μm微滤膜，滤掉β-环糊精即可得脱腥的酶解液，β-环糊精（β-cd）是环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉产生的一组环状低聚糖，具有“内疏水、外亲水”特殊分子结构，使得cd能作为“宿主”包络不同“客体”化合物，达到脱腥的目的；
5）纯化分离：将脱腥后的酶解液通过截留分子量为4kda的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质，然后通过截留分子量为300da的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液，冷冻干燥即得马尾藻活性多肽，该活性物质含有一种活性多肽，其氨基酸序列为hshayysvcgshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，该活性多肽与钙、锌、铁等离子结合，由小肠肠壁细胞吸收后再释放进入血液，从而避免了这些离子在小肠的中性和偏碱性环境中沉淀，促进了它们的吸收，具有促进骨骼和牙齿发育，预防和改善龋齿、佝偻病、骨质疏松等作用。
实施例2：
马尾藻活性多肽的制备方法，具体包括以下步骤：
1）将马尾藻粉按1:38料液比加入浓度为5%的氢氧化钠溶液，混合均匀，在温度为48℃、功率为260w的超声波处理30min，调节ph至中性，低温离心机离心，备用，该步骤结合氢氧化钠与超声波进行细胞破壁，不影响蛋白质的活性，能够大大缩短细胞破壁的时间，提高工作效果，可大批量化破碎藻细胞，适用于工业化生产；
2）于5℃环境中，离心液加入浓度为93%的乙醇，加入量为离心液体积的5倍，持续搅拌1min，静置4.5h，离心，去上清液，去除沉淀残余表面酒精，收集沉淀，用0.11mol/l、ph为7的pbs溶液溶解沉淀，该步骤中利用乙醇可使蛋白质沉淀的机理，加入大量的乙醇，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法蛋白质沉淀效果好，蛋白质中残留的乙醇溶液可在自然状态下挥发出去，不需要进一步处理，节约能耗，降低生产成本；
3）将马尾藻蛋白按1:6料液比加水混匀，调节ph至7.8，加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，酶低比为5%和3%，在55℃下酶解4h，灭酶，冷却，离心，上清液即为酶解液，该步骤采用双酶酶解法制备马尾藻活性多肽，利用两种蛋白酶作用的专一性，使原料蛋白质充分水解成活性多肽，提高马尾藻蛋白质的转化率，使蛋白质尽可能的降解为活性多肽，且可使活性肽具有味道鲜美、营养丰富的优点；
4）将酶解液中加入1wt%的β-环糊精，在24℃下搅拌85min进行脱腥，经0.2μm微滤膜，滤掉β-环糊精即可得脱腥的酶解液，β-环糊精（β-cd）是环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉产生的一组环状低聚糖，具有“内疏水、外亲水”特殊分子结构，使得cd能作为“宿主”包络不同“客体”化合物，达到脱腥的目的；
5）将脱腥后的酶解液通过截留分子量为5kda的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质，然后通过截留分子量为300da的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液，冷冻干燥即得马尾藻活性多肽，该活性物质含有一种活性多肽，其氨基酸序列为hshayysvcgshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，该活性多肽与钙、锌、铁等离子结合，由小肠肠壁细胞吸收后再释放进入血液，从而避免了这些离子在小肠的中性和偏碱性环境中沉淀，促进了它们的吸收，具有促进骨骼和牙齿发育，预防和改善龋齿、佝偻病、骨质疏松等作用。
实施例3：
马尾藻活性多肽的制备方法：将马尾藻粉按1:40料液比加入浓度为5%的氢氧化钠溶液，混合均匀，在温度为48℃、功率为250w的超声波处理26min，调节ph至中性，然后离心；于5℃环境中，在离心液加入浓度为93%的乙醇，加入量为离心液体积的5倍，持续搅拌2min，静置4h，离心，去上清液，去除沉淀残余表面酒精，用0.09mol/l、ph为6.7的pbs溶液溶解沉淀；将马尾藻蛋白按1:4料液比加水混匀，调节ph至7.5，加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，酶低比为4.5%和3.5%，在55℃下酶解4.5h，灭酶，冷却，离心，上清液即为酶解液；将酶解液中加入0.7wt%的β-环糊精，在26℃下搅拌95min进行脱腥，经0.3μm微滤膜；将脱腥后的酶解液通过截留分子量为4kda的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质，然后通过截留分子量为300da的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液，冷冻干燥即得马尾藻活性多肽。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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