检测呼吸道感染常见病原体的悬浮微珠阵列系统的制作方法

本发明涉及一种检测呼吸道感染常见病原体的系统，特别涉及一种检测呼吸道感染常见病原体的悬浮微珠阵列系统。
背景技术：
：呼吸道感染是人类最常见的传染性疾病之一，而儿童呼吸道感染更是儿童面临的主要公共健康问题之一，在发展中国家已成为5岁以下儿童死亡的首要病因。研究报道学龄前儿童每年平均患呼吸道感染6-10次，并有大约3％的1岁以下儿童由于中重度的呼吸道感染而住院治疗。引发呼吸道感染的病原体种类复杂，既有病毒，也有细菌、支原体等。这些病原体引发呼吸道感染后，患者的临床表现往往都有发热、咳嗽、咽痛、流涕，可伴随全身无力、头晕、肌肉酸痛等全身症状。若不鉴别出引发感染症状的病原体，会导致抗生素滥用，并且治疗效果有限。目前临床诊断呼吸道病原体的方法学，只能检测少数几个指标，容易造成漏诊，并且患者每检测一个病原体指标，就要单独交一次检测的费用，导致检测费用居高不下。本发明根据目前呼吸道病原体检测无法满足临床诊断需求的现状，采取悬浮微阵列技术，在一次测试中，在核酸水平对能引起呼吸道感染的8种病毒、4种细菌、1种支原体同时进行检测。一方面简化了检测病原体的流程，另一方面也可以降低临床的检测费用。悬浮微珠阵列技术是属于生物芯片技术的一种，它是以一种可以在液体中悬浮流动的微珠为介质来固定支持探针，探针就能随着微珠的流动方式和样本进行杂交；而固定在玻璃平面或者尼龙膜平面上的探针则是不能流动的，这样悬浮微珠阵列技术中核酸分子的杂交动力学就会优于固态表面的杂交，并且由于微珠可以通过外表面包裹磁性材料而使得悬浮微珠阵列技术容易实现自动化操作。悬浮微珠阵列技术的技术核心是微珠的编码和解码。固体平面上的探针是通过有序的行与列的位置关系来实现探针的寻址的；而微珠悬浮阵列技术中，微珠是流动的，自然就无法通过位置来寻址了，因此只能通过对微珠本身进行编码。目前国际上有两种微珠编码技术，一种是美国的luminex公司的基于红外材料的荧光编码技术，就是把两种红外材料按照不同的配比混合，使之发出不同波段的荧光，达到编码微珠的目的，称为荧光编码，例如99％的a材料+1％的b材料混合后，编码1号微珠；98％的a材料+2％的b材料混合后，编码2号微珠，诸如类推，这样至少可以编码100种微珠。另外一种悬浮微珠技术是美国appliedbiocode公司，以及中国台湾plexbio公司的二维编码技术，是通过电脑微加工技术，分别在长方体和圆柱体的硅质颗粒上蚀刻出不同方向的痕迹，产生横向和纵向的二维编码，可编码4000-16000种微珠。这两种悬浮微珠阵列技术尽管各自的编码技术不同，但对于临床应用来说，都可以满足一次试验检测指标多、容易自动化操作、单位时间检测样本量多的需求。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有的从核酸水平检测呼吸道病原体方法的不足，提供一种基于以上两种悬浮微珠阵列系统检测呼吸道多种病原体的方法。在一种实施方式中，本发明提供一种检测呼吸道感染常见病原体的悬浮微珠阵列系统，所述系统在一次实验中实现对流感病毒a型、流感病毒b型、副流感病毒、人偏肺病毒、鼻病毒、博卡病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、卡塔布兰汉菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和百日咳菌的检测。在一种实施方式中，本发明提供一种检测呼吸道感染常见病原体的悬浮微珠阵列系统包括：a.检测rna病毒的多重pcr引物序列：流感病毒a型、流感病毒b型、副流感病毒3型、偏肺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒，b.检测dna检测的病原体的多重pcr引物序列：博卡病毒、腺病毒、肺炎链球菌、肺炎支原体、卡他布兰汉菌、流感嗜血杆菌和百日咳杆菌，在一种实施方式中，引物hbo-r、had-r、spn-r、mpn-r、mca-r、hin-r和bpe-r的5’端标记生物素。在一种实施方式中，所述系统包括以下探针序列：在一种实施方式中，探针ia-p，ib-p，pv3-p，rsv-p，rv-p，mpv-p，hbo-p，had-p，spn-p，mpn-p，mca-p，hin-p，bpe-p的5’端带c18-nh2修饰。在一种实施方式中，系统中还包括作为内参的人的gapdh基因的多重pcr引物：正向引物seqidno:1：caagctcatttcctggtatgaca，反向引物seqidno:2：gggagattcagtgtggtggg；以及检测其的探针序列seqidno:29：tggggagtccctgccacac。本发明所描述的悬浮微珠阵列系统检测呼吸道感染常见病原体较目前同样在核酸水平检测呼吸道病原体感染的荧光定量等检测方法的优点包括：①在一次实验中就可以完成8种病毒、4种细菌、1种支原体的检测，可以最大程度的防止漏检，有利于临床进行针对性的治疗；②摊分到单个指标的检测上，试剂耗材的成本费用大幅度降低，因此可以降低医疗成本。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1是流感病毒a型探针优化前后阴性与阳性样本信号值前后比较图；图2是流感嗜血杆菌的探针优化前后阴性与阳性样本信号值前后比较图；图3是本发明的呼吸道感染常见病原体的悬浮微珠阵列系统检出样本中的呼吸道合胞病毒；和图4是本发明的呼吸道感染常见病原体的悬浮微珠阵列系统检出样本中的流感嗜血杆菌。具体实施方式为了使本领域
技术领域：
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。本发明通过设计呼吸道感染常见病原体的多重pcr扩增引物和探针，可以兼容两种悬浮微珠阵列系统来多种呼吸道感染病原体，在一次实验中可实现对流感病毒a型、流感病毒b型、副流感病毒、人偏肺病毒、鼻病毒、博卡病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、卡塔布兰汉菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、百日咳菌；共计8种病毒、5种细菌、1种支原体进行检测。一、多重pcr引物设计由于流感病毒a型、流感病毒b型、副流感病毒、人偏肺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒是rna病毒，因此这6种rna病毒的多重反转录pcr设计在一管中反应，这6种病毒，以及用于内参的人的gapdh基因对应的pcr引物序列见表1。而博卡病毒、腺病毒、肺炎支原体、卡塔布兰汉菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、百日咳菌则是基于dna水平检测，因此无需做反转录，只需要基于pcr扩增即可，这7种基于dna检测的病原体的多重pcr引物的引物序列见表2。表1.检测rna病毒的多重pcr引物序列表2.基于dna检测的病原体的多重pcr引物序列表1和表2中，名称后加“-f”表示的正向引物，名称后加“-r”表示的正向引物；所有的反向引物r引物的5’端标记生物素。二、探针设计本发明针对8种病毒、5种细菌、1种支原体和1个人的内参基因一共设计了15条探针，探针序列如表3。表3.本发明的探针序列所有的探针的5’带c18-nh2修饰。虽然本领域技术人员一般都可以设计引物探针，但是在同一个实验中同时进行8种病毒、5种细菌和1种支原体的不同类型生物病原体的检测，在这14种病原体中既有rna型病原体，又有dna型病原体。由于这些因素的存在，对于这些引物和探针的设计提出了巨大挑战。本申请的发明人经过大量辛苦的工作和不断地筛选，成功地设计了上述引物和探针，保证了本发明能够高效地同时检测出上述病原体，大大增加了检测的效率，降低了呼吸道疾病的检测成本。本发明的所有引物和探针都是经过反复筛选和优化设计的，以下以本发明的二个探针为例说明本发明的技术效果。表4.流感病毒a型优化前后的探针序列探针名称探针序列号探针序列(5'-3')tm简并度原探针seqidno:43tcaggccccctcaaagccga65.7-66.12新探针seqidno:30tcggctttgagggggcctgayg65.7-68.32图1中是流感病毒a型探针优化前后信号值对比，流感病毒a型探针优化前后阴性与阳性样本信号值前后比较(n＝4)从图中可看出，优化后的探针，在保持阴性样本不被检出的特异性情况下，在阳性样本中检测灵敏度大大增加。表5.以下是流感嗜血杆菌优化前后的探针序列探针名称探针序列号探针序列(5'-3')tm原探针seqidno:44gtggttaaatatgccgatggtg57.5新探针seqidno:41caatggcagaagtggttaaatatg56.4图2是流感嗜血杆菌的探针优化前后信号值对比，流感嗜血杆菌的探针优化前后阴性与阳性样本信号值前后比较(n＝3)。从图中可看出，优化后的探针在保证了阳性样本检出灵敏度的同时，大大降低了阴性。本发明设计的引物和探针能够实现同时检测上述8种病毒、5种细菌和1种支原体，同时灵敏度和准确度又满足临床的要求。三、悬浮微珠阵列的制备将荧光编码微球或者二维编码微球与所述的探针分别偶联，然后根据检测目的将偶联好探针的编码微球混合，得到悬浮微珠阵列。按照一万人份理论量计算，一种探针与一个编码的磁珠进行偶联，具体实验步骤为；a、从-20℃取出密封干燥保存的二氯乙烷(edc)粉末，使其恢复至室温。b、融化已配置好的100μm的探针溶液，涡旋5s混匀并3000rpm离心30s。c、轻柔涡旋悬浮原料检验合格的磁珠(2-8℃储存)，超声处理30-60s。d、取1.5ml低吸附离心管编好号(磁珠编号+探针号)固定于磁力架上，将磁珠轻柔颠倒5-10次，避免剧烈震荡，移液器反复吹吸3次后吸取12.5×106(1ml)磁珠靠磁力架内壁加至对应离心管中，吸附1min。e、小心移去上清(左手往磁力架方向压住管身，右手缓慢吸净上清，枪头始终应尽量靠远离磁力架方向，若有磁珠跟进枪头，则需重新吹打均匀，待其重新吸附后再次尝试；加入60μl0.1m，ph＝4.5的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)溶液，超声处理30-60s，涡旋5s混匀。f、加入15μl100μm探针。g、称量10mg的edc粉末至于1.5ml离心管管中，加入1ml纯水，终浓度10mg/ml，涡旋5s混匀，立即取10ul加入到偶联管中，涡旋5s混匀。h、偶联管室温避光孵育30min，期间每隔10min涡旋5s混匀。i、重复步骤g和h两次。j、加入1ml0.02％tween-20，涡旋5s混匀，3000rmp离心1min，上磁力架1min。k、轻轻开盖并小心移除上清，加入1ml0.1％sds，涡旋5秒重悬,3000rmp离心1min，上磁力架1min，。l、轻轻开盖并小心移除上清，加入500ulteph8.0超声处理30-60s后涡旋5秒重悬。m、取1ul稀释100倍用细胞计数板在显微镜下进行计数(有自动计数仪亦可)，计算回收率计算珠子总数。n、每种珠子根据两种不同的系统要求进行混合配制：luminex公司的微珠按照每人份每种微珠2000颗进行混合；appliedbiocode公司的微珠按照每人份每种微珠50颗进行混合；o、2-8℃避光保存，有效期14个月。四、标本检测本发明所检测的标本类型包括肺泡灌洗液、咽拭子等来自呼吸道的临床样本，可采用不同公司的商业化试剂盒-病毒基因组dna/rna提取试剂盒来提取肺泡灌洗液或者咽拭子中的核酸。由于rna病毒需要做反转录反应，而dna病原体无需进行反转录反应，因此按照两种体系进行病原体核酸的扩增：a体系进行反转录pcr来扩增rna病毒，反应体系如表4，反应条件如表5；b体系进行pcr来扩增dna病原体，反应体系如表6，反应条件如表7。表6.rt-pcr扩增rna病毒的a反应体系表7.rt-pcr反应条件表8.pcr扩增dna病原体的b反应体系名称体积(25l反应体系)终浓度2×pcr缓冲液12.51×正向引物混合物(每种10m)1每种0.4m反向引物混合物(每种10m)1每种0.4mhstaq酶0.5核酸模板2补水8表9.pcr反应条件取以上所配制的悬浮微珠阵列杂交液，分装至96孔板中，每孔45μl；然后加入a体系和b体系的pcr产物各2.5μl。热变性→95℃，5min杂交→60℃，15min显色→60℃，7min显色母液链霉亲和素r-藻红蛋白按照1：50稀释，每孔加入25μl，吸打10-20下以充分混匀。即可分别用luminex公司和appliedbiocode公司的悬浮微珠阵列读取仪对微珠进行解码，以及微珠上杂交信号的读取。通过仪器软件检测探针的荧光强度分析临床样本中是否含有所检测的病原体。判读的标准为：人的内参基因gapdh探针的信号值>1000，说明实验成功。在此前提下，病原体探针<600时，病原体为阴性；600≤病原体探针信号≤1000时，需要重复测试或者用qpcr方法进行验证；病原体探针>1000时，病原体为阳性。上述参考值是基于luminex公司系统所确定；appliedbiocode公司的系统参考值可以根据实际情况进行确定。一名呼吸道感染的儿童的肺泡灌洗液，用目前临床已有的pcr-呼吸道病原体6项(呼吸道合胞病毒、肠道病毒、肺炎支原体、巨细胞病毒、eb病毒、结核分枝杆菌)方法检出是呼吸道合胞病毒感染的样本，用本发明所描述的呼吸道感染常见病原体悬浮微珠阵列方法检测结果参见图3，也检出呼吸道合胞病毒的感染。另一名呼吸道感染的儿童的肺泡灌洗液，用目前临床已有的pcr-呼吸道病原体6项(呼吸道合胞病毒、肠道病毒、肺炎支原体、巨细胞病毒、eb病毒、结核分枝杆菌)方法检出6项指标都为阴性，用本发明所描述的呼吸道感染常见病原体悬浮微珠阵列方法检测结果参见图4，检出流感嗜血杆菌感染。可见，本发明能在一次实验中检出呼吸道感染常见的8种病毒、4种细菌、1种支原体。使用本发明的系统，约8小时能得出结果。应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。序列表<110>广州奥百阕谱生物科技有限公司<120>检测呼吸道感染常见病原体的悬浮微珠阵列系统<130>2017<160>44<170>patentinversion3.3<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1caagctcatttcctggtatgaca23<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gggagattcagtgtggtggg20<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3agycttctaaccgaggtcgaaac23<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4tacgctgcagtcctcgctca20<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5ggcaaagcagaactagca18<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6tttcctggtctttgggttt19<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7ggataaaatggacatggcata21<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列<400>8tgtaatgcagcttgttgt18<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列<400>9taggctcatcttcaacagg19<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10tatgttgttrgatgatctggc21<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列<400>11caagyacttctgtytccc18<210>12<211>19<212>dna<213>人工序列<400>12cacggacacccaaagtagt19<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13gctccagaatayaggcatga20<210>14<211>22<212>dna<213>人工序列<400>14ctgcaaaratyccttcaactct22<210>15<211>18<212>dna<213>人工序列<400>15tatgatgtcacaacgagg18<210>16<211>18<212>dna<213>人工序列<400>16taatccgtgatgacttgc18<210>17<211>19<212>dna<213>人工序列<400>17tgcacatcgccggvcagga19<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18tcsgtggtcacatcrtgsgt20<210>19<211>18<212>dna<213>人工序列<400>19gtgtcgctctttgcagta18<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<400>20ttcattatcagtcccagtcg20<210>21<211>21<212>dna<213>人工序列<400>21tactacttccacaataacccc21<210>22<211>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