一种鉴定水稻垩白性状的分子标记、鉴定方法及应用与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种鉴定水稻垩白性状的分子标记、鉴定方法及应用。
背景技术：
：垩白为稻米胚乳中不透明的部分，是胚乳中淀粉及蛋白质排列不紧密形成的光学特性，垩白性状对稻米外观品质、加工品质均有负向影响。低垩白水稻品种其商业价值较高，受到育种工作者的青睐。但是目前，垩白性状主要通过表型进行鉴定，在育种早世代难以开展相关的选择工作，且表型鉴定受环境条件影响较大，年度间鉴定结果不近一致，且需要耗费大量人力及物力，在育种工作早世代时难以开展选择工作，通过分子标记辅助进行低垩白稻米品种的选择可以大大提高选择效率，不受世代及样品数量的限制，是改良水稻垩白性状的最佳手段。chalk5基因作为调控籼稻腹白率的主效qtl于2014年被成功克隆；研究学者亦通过全基因组关联分析证实了chalk5基因在籼稻中的作用。chalk5基因被定位于水稻5号染色体，高垩白chalk5等位基因型与低垩白chalk5等位基因型存在2个功能性snp差异，分别为启动子atg前-721位c-t及-485位a-t，两个snp分离方向一致。然而，现有技术针对于chalk5基因，目前可供鉴定上述两种等位基因型的功能性分子标记缺失，致使基于chalk5基因鉴定水稻垩白性状的分子手段难以推广使用。技术实现要素：本发明提供的一种鉴定水稻垩白性状的分子标记、鉴定方法及应用，是目前唯一一个针对于chalk5基因构建的pcr类型的功能性分子标记，该分子标记能够较好区分水稻垩白性状的两种等位基因型，操作简单，耗费较低。本发明的第一个目的是提供一种鉴定水稻垩白性状的分子标记，所述分子标记为chalk5-tpap，包括核苷酸序列如seqidno.1所示的chalk5-tpap-o-f、seqidno.2所示的chalk5-tpap-o-r、seqidno.3所示的chalk5-tpap-i-f和seqidno.4所示的chalk5-tpap-i-r。本发明的第二个目的是提供一种利用上述分子标记鉴定水稻垩白性状的方法，包括以下步骤：s1，提取待测水稻材料的基因组dna；s2，以s1获得的基因组dna为模板，以chalk5-tpap-o-f、chalk5-tpap-o-r、chalk5-tpap-i-f和chalk5-tpap-i-r为引物进行pcr扩增；s3，结果判定以chalk5-tpap-o-f与chalk5-tpap-o-r结合扩增出364bp片段作为阳性对照；当chalk5-tpap-i-f与chalk5-tpap-o-r结合扩增出225bp片段时，检测材料为低垩白等位基因型t；当chalk5-tpap-o-f与chalk5-tpap-i-r结合扩增出194bp片段时，检测材料为高垩白等位基因型c。优选的，上述分子标记鉴定水稻垩白性状的方法，pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30、58.4℃退火30s、72℃延伸30s-50s、35次循环；72℃延伸10min；4℃冷却10min。本发明的第三个目的是提供一种上述分子标记在水稻垩白性状分子标记辅助选育中的应用。本发明的第四个目的是提供一种上述鉴定水稻垩白性状的方法在水稻垩白性状分子标记辅助选育中的应用。与现有技术相比，本发明提供一种鉴定水稻垩白性状的分子标记、鉴定方法及应用，具有以下有益效果：本发明基于chalk5基因启动子atg前-721位c-t的功能性snp差异，利用四引物受阻扩增突变原理(tetra-primerarms-pcr)，设计基于pcr的功能性分子标记chalk5-tpap，并构建了该分子标记的pcr扩增体系。分子标记chalk5-tpap是目前唯一一个针对于chalk5基因构建的pcr类型的功能性分子标记。分子标记chalk5-tpap是从dna碱基的功能性多态性进行鉴定，发明人经过大量试验材料证实该分子标记可以对chalk5基因的水稻垩白性状的两种等位基因型进行直接鉴定，且准确率达100％，能够较好区分两种等位基因型，不受环境条件的影响，鉴定操作方法简单，耗费较低，而其他现有文献公开的引物分子标记只能达到50-70％的鉴定准确率；本发明的分子标记chalk5-tpap为chalk5基因等位基因型的鉴定及相应的分子标记辅助选择工作打下了坚实的基础，适合于大范围推广使用。附图说明图1为h94材料的chalk5基因；图2为珍汕97材料的chalk5基因；图3为不同退火温度组进行pcr扩增结果；其中，m泳道为dna标准分子量；1、3、5、7、9、11、13、15泳道分别为珍汕97材料在55.1℃、55.4℃、55.8℃、56.3℃、57.1℃、57.7℃、58.4℃、59.1℃退火温度下的扩增结果；2、3、4、5、10、12、14、16泳道分别为h94材料在55.1℃、55.4℃、55.8℃、56.3℃、57.1℃、57.7℃、58.4℃、59.1℃退火温度下的扩增结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明提供的一种鉴定水稻垩白性状的分子标记，所述分子标记为chalk5-tpap，包括核苷酸序列如seqidno.1所示的chalk5-tpap-o-f、seqidno.2所示的chalk5-tpap-o-r、seqidno.3所示的chalk5-tpap-i-f和seqidno.4所示的chalk5-tpap-i-r。具体按照以下方法获得：ncbi查找克隆序列：高垩白等位基因型珍汕97，kj363317；低垩白等位基因型h94，kj363318。选用启动子atg前-721位c-t的snp进行设计。利用在线引物设计软件primer1进行分子标记设计，命名为chalk5-tpap，chalk5-tpap包括核苷酸序列如seqidno.1所示的chalk5-tpap-o-f、seqidno.2所示的chalk5-tpap-o-r、seqidno.3所示的chalk5-tpap-i-f和seqidno.4所示的chalk5-tpap-i-r，其序列信息详见表1。seqidno.5为低垩白等位基因型h94的核苷酸序列，其中第1-28位为chalk5-tpap-o-f的结合位点，第337-364位为chalk5-tpap-o-r的结合位点，第140-165位为chalk5-tpap-i-f的无效扩增位点，第165-197位为chalk5-tpap-i-r的结合位点。如图1所示，图1中snp差异位点用加黑斜体字母t表示，带下划线的字母表示引物结合位点，实线箭头表示引物扩增方向，虚线箭头表示不能有效扩增。seqidno.6为高垩白等位基因型珍汕97的核苷酸序列，其中第1-28位为chalk5-tpap-o-f的结合位点，第337-364位为chalk5-tpap-o-r的结合位点，第140-165位为chalk5-tpap-i-f的结合位点，第165-197位为chalk5-tpap-i-r的无效扩增位点。如图2所示，图2中snp差异位点用加黑斜体字母c表示，带下划线的字母表示引物结合位点，实线箭头表示引物扩增方向，虚线箭头表示不能有效扩增。表1chalk5-tpap中各分子标记序列基因标记序列(5’-3’)chalk5chalk5-tpap-i-fagaagagagaagtgccaaggatcggtchalk5chalk5-tpap-i-rggtttttgaataaaacaactctgggtcctgchalk5chalk5-tpap-o-fgattgcatgcatcttaacagcaaagagachalk5chalk5-tpap-o-rcaaattaggtgtatctgacgcatgagca实施例1利用上述分子标记chalk5-tpap鉴定供试水稻材料的垩白性状，具体包括以下步骤：供试材料为chalk5基因克隆试验中的对照材料水稻品种珍汕97和水稻品种h94(h94与中国专利cn103382479b中述及的水稻品种h94为同一品种)，其中珍汕97携带高垩白等位基因型chalk5，h94携带低垩白等位基因型chalk5。s1，分别提取珍汕97和h94两个材料的基因组dna，基因组dna提取采用全式金植物dna提取试剂盒进行(操作按照试剂盒说明)。s2，以s1获得的基因组dna为模板，以chalk5-tpap-o-f、chalk5-tpap-o-r、chalk5-tpap-i-f和chalk5-tpap-i-r为引物进行pcr扩增。pcr扩增反应体系为10μl：包括dna0.2μl(1ng/μl)；chalk5-tpap-o-f0.3μl、chalk5-tpap-o-r0.3μl、chalk5-tpap-i-f0.2μl、chalk5-tpap-i-r0.2μl；2×tappcrmastermix(带染料，康为世纪公司购买)5.0μl；ddh2o3.8μl。其中chalk5-tpap-o-f、chalk5-tpap-o-r为外引物，chalk5-tpap-i-f和chalk5-tpap-i-r为内引物，上述引物的浓度均为4pmol/μl。pcr扩增反的应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、58.4℃退火30s、72℃延伸30s、35次循环；72℃延伸10min；4℃冷却10min。反应产物在5％琼脂糖凝胶上100v电泳1h，经溴化乙锭(ethidiumbromide，eb)染色后并于凝胶成像系统下观察，记录结果。s3，结果判定以chalk5-tpap-o-f与chalk5-tpap-o-r结合扩增出364bp片段作为阳性对照；当chalk5-tpap-i-f与chalk5-tpap-o-r结合扩增出225bp片段时，检测材料为低垩白等位基因型t；当chalk5-tpap-o-f与chalk5-tpap-i-r结合扩增出194bp片段时，检测材料为高垩白等位基因型c。通过chalk5-tpap对2个对照材料的8个退火温度组进行pcr扩增，其中，pcr扩增的8个退火温度分别为55.1℃、55.4℃、55.8℃、56.3℃、57.1℃、57.7℃、58.4℃、59.1℃，其余程序均参照实施例1的s2中记载的pcr扩增反应程序。不同退火温度组进行pcr扩增结果如图3所示，由图3可知，当退火温度为58.4℃时，电泳图中条带亮度区分明显，不存在假阳性现象。chalk5-tpap-o-f与chalk5-tpap-o-r结合扩增出364bp片段作为阳性对照；当检测材料为低垩白等位基因型h94时，chalk5-tpap-i-f与chalk5-tpap-o-r结合扩增出225bp片段；当检测材料为高垩白等位基因型珍汕97时，chalk5-tpap-o-f与chalk5-tpap-i-r结合扩增出194bp片段。由于选取的对照材料为前人研究中该基因位点已测序材料，证实了chalk5-tpap的有效性及准确性。实施例2利用分子标记chalk5-tpap进行dh群体后代的基因型检测dh群体为低垩白等位基因型水稻品种h94(父本)杂交高垩白等位基因型水稻品种秋光(母本)，由花药培养而获得的150个稳定品系，通过标记chalk5-tpap进行150个稳定品系的chalk5等位基因型鉴定，并与2012-2013年两年垩白表型进行对比，结果如表2所示，2012年，高垩白等位基因型水稻品共计89个，表型均为高垩白，如平均垩白粒率15.25％，平均垩白粒度8.95％；低垩白等位基因型水稻品种共计61个，表型均为低垩白，如平均垩白粒率5.06％，平均垩白粒度2.56％；2013年，高垩白等位基因型水稻品共计89个，表型均为高垩白，如平均垩白粒率14.14％，平均垩白粒度9.38％；低垩白等位基因型水稻品种共计61个，表型均为低垩白，如平均垩白粒率6.09％，平均垩白粒度1.97％。统计分析表明不同等位基因型后代垩白性状差异达到极显著水平，基因型与表型吻合，证实了标记chalk5-tpap的准确性。表2利用分子标记chalk5-tpap检测dh群体垩白及垩白表型对比结果注释：标注字母a及b代表了0.01水平上的显著性实例2利用分子标记chalk5-tpap进行ril群体后代的基因型检测ril群体为低垩白等位基因型水稻品种h94(父本)杂交高垩白等位基因型水稻品种桥科951(母本)，由单粒传方法而获得的110个稳定品系，通过标记chalk5-tpap进行110个稳定品系的chalk5等位基因型鉴定，并与2013-2014年两年垩白表型进行对比，结果如表3所示，2013年，高垩白等位基因型水稻品共计38个，表型均为高垩白，如平均垩白粒率16.32％，平均垩白粒度6.84％；低垩白等位基因型水稻品种共计72个，表型均为低垩白，如平均垩白粒率6.31％，平均垩白粒度3.12％；2014年，高垩白等位基因型水稻品共计38个，表型均为高垩白，如平均垩白粒率13.51％，平均垩白粒度7.21％；低垩白等位基因型水稻品种共计72个，表型均为低垩白，如平均垩白粒率7.09％，平均垩白粒度2.37％。统计分析表明不同等位基因型后代垩白性状差异达到极显著水平，基因型与表型吻合，证实了标记chalk5-tpap的准确性。表3利用分子标记chalk5-tpap检测ril群体垩白及垩白表型对比结果注释：标注字母a及b代表了0.01水平上的显著性需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。序列表<120>一种鉴定水稻垩白性状的分子标记、鉴定方法及应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>28<212>dna<213>人工合成<400>1gattgcatgcatcttaacagcaaagaga28<210>2<211>28<212>dna<213>人工合成<400>2caaattaggtgtatctgacgcatgagca28<210>3<211>26<212>dna<213>人工合成<400>3agaagagagaagtgccaaggatcggt26<210>4<211>30<212>dna<213>人工合成<400>4ggtttttgaataaaacaactctgggtcctg30<210>5<211>364<212>dna<213>h94<400>5gattgcatgcatcttaacagcaaagagagatgcaaactcttgaagtttatcatcacagga60aaacttatgacatctacaactttgaaattgaaatatagcaagacaaatcaagtagccttt120ccaagtttcttttgacccaagaagagagaagtgccaaggatctgtatgacccagagttgt180tttattcaaaaaccaccattcgaaatgaaggtagctagatgcatgatgagggaaattttg240ttgcatgtgggtgaaccccaaagcttacctaatggcattgtccgtcagcattttcagtgc300gtccaaaccccaatgagacgcaccgtatataacttatgctcatgcgtcagatacacctaa360tttg364<210>6<211>364<212>dna<213>珍汕97<400>6gattgcatgcatcttaacagcaaagagagatgcaaactcttgaagtttatcatcacagga60aaacttatgacatctacaactttgaaattgaaatatagcaagacaaatcaagtagccttt120ccaagtttcttttgacccaagaagagagaagtgccaaggatctgcatgacccagagttgt180tttattcaaaaaccaccattcgaaatgaaggtagctagatgcatgatgagggaaattttg240ttgcatgtgggtgaaccccaaagcttacctaatggcattgtccgtcagcattttcagtgc300gtccaaaccccaatgagacgcaccgtatataacttatgctcatgcgtcagatacacctaa360tttg364当前第1页12