用于检测RhDmRNA剪接体的PCR引物组合、试剂盒及实时荧光定量检测方法与流程

本发明涉及一种用于检测rhdmrna剪接体的pcr引物组合，同时还涉及包含该引物组合的试剂盒及rhdmrna剪接体实时荧光定量检测方法，属于生物检测
技术领域：
。
背景技术：
：rh基因的复杂性直接体现在rhd抗原表达的多态性，这被认为是不仅与rhdmrna水平上的异质性有关还与相关基因外显子的缺失、数量表达等相关。同时levankim等还发现：rhce基因存在选择性剪接而形成不同形式的基因转录产物[1]，同样的有研究者发现在正常的d抗原阳性的个体中存在第7外显子至第9外显子的多种复杂的选择性剪接[2]，该剪接体的多态性决定rhd基因表达d抗原的特性。血型基因的遗传背景有明显的种族间差异，是因为不同人种的rhdmrna基因出现选择性多样剪接出现rhd亚型所造成[3]。mrna即messengerrna信使rna是由dna经由转录而来，带着相应的遗传讯息，为下一步转译成蛋白质提供所需的讯息。基于rhd基因的多态性，本文建立实时荧光定量的方法对不同个体的rhdmrna剪接体检测，通过监测rhdmrna表达的多态性了解不同个体rhd基因的差异。实时荧光定量pcr(real-timequantitativepcr)/qrt-pcr，是指在pcr反应体系中加入荧光标记物，利用荧光信号的积累实时监测整个pcr过程，通过扩增曲线对未知模板进行定量分析的方法。[1]levankc,mouroi,cherif-zaharb,etal.molecularcloningandprimarystructureofthehumanbloodgrouprhdpolypeptideproenatl.acadseiusa,1992,89(22):10925-10929.[2]邵超鹏，熊文,等.替代剪切形成多种形式的rhdmrna.中国输血杂志，2004，17(5)：310-314.[3]levankc，cherif-zaharb，raynalv，etal.multiplerhmessengerrnaisoformsareproducedbyalternativesplicing.blood,1992,80(4):1074-1078.技术实现要素：为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种检测rhdmrna剪接体的pcr引物组合、试剂盒及实时荧光定量pcr检测方法。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于检测rhdmrna剪接体的pcr引物组合，包括以下三对引物的至少一对：(1)用于扩增全长rhdmrna剪接体的1对共2条引物，2条引物的序列分别为：上游引物：5'-cccacagctccatcatggg-3'(seqidno:1)，下游引物：5'-gccaatcatgccattgccggc-3'(seqidno:2)；(2)用于扩增缺失exon-7的rhdmrna剪接体的1对共2条引物，2条引物的序列分别为：上游引物：5'-tggctgggctgatctccg-3'(seqidno:3)下游引物：5'-tggaagccaatccggcaggt-3'(seqidno:4)；(3)用于扩增缺失exon-7,8,9的rhdmrna剪接体的1对共2条引物，2条引物的序列分别为：上游引物：5'-tggctgggctgatctccg-3'(seqidno:5)下游引物：5'-caaatgaggaaacggcaggt-3'(seqidno:6)。优选地，优选地，所述引物组合物中各引物的浓度为5pmol/l。一种检测rhdmrna剪接体的试剂盒，包括所述的pcr引物组合物。优选地，所述的用于检测rhdmrna剪接体的试剂盒还包括pcr级h2o，mastermix。一种用于检测rhdmrna剪接体的实时荧光定量pcr检测方法，包括如下步骤：(3)配制若干个不同浓度标准品；(4)配制pcr反应液，包括上述pcr引物组合物；(3)pcr扩增：将上述pcr反应液与不同浓度的标准品或待测样品分别混合进行pcr扩增；(4)利用不同浓度的标准品得到的数据制作标准曲线；(5)利用标准曲线计算待测样品的浓度。优选地，所述步骤(1)中，所述标准品为选自以下至少一种所示的核苷酸序列：全长标准品：5'-cccacagctccatcatgggctacaacttcagcttgctgggtctgcttggagagatcatctacattgtgctgctggtgcttgataccgtcggagccggcaatggcatgattggc-3'(seqidno:7)缺失exon-7标准品：5'-tggctgggctgatctccgtcgggggagccaagtacctgccggattggcttcca-3'(seqidno:8)缺失exon-7,8,9标准品：5'-tggctgggctgatctccgtcgggggagccaagtacctgccgtttcctcatttg-3'(seqidno:9)。优选地，所述步骤(1)中，所述若干为选自6、8、10、12、16中的一种。优选地，所述步骤(1)，所述不同浓度的标准品相邻浓度之间的梯度为1个数量级，即浓度相差10倍。优选的，所述步骤(2)中，所述pcr反应液中还包括pcr级h2o，mastermix。优选的，所述步骤(3)中，pcr扩增的反应程序为：95℃预变性10min；96℃变性10s，60℃复性3s，72℃延伸3秒，循环35次，72℃再延伸10s。优选地，所述步骤(5)中，所述计算是利用2ndderivativemax计算法进行的。本发明的主要优点包括：本发明针对rhdmrna剪接体序列设计实时荧光定量pcr引物组合，该引物的特异性强，不受其他非目的基因干扰，能快速、高效、准确地对rhdmrna剪接体进行定量。本发明应用实时荧光定量pcr方法对rhdmrna剪接体进行定量检测，方法简单、精确，无管道内污染，无需凝胶电泳，此方法可以准确定量不同个体rhdmrna剪接体的拷贝数。结果重现性好，检测灵敏度高，特异性强，可用于高通量的样品检测。附图说明图1显示了全血提取高质量、高纯度的mrna电泳图。图2rhdmrna剪接体实时荧光定量实时监控。具体实施方式下述实施例及试验例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。实施例1检测rhdmrna剪接体的pcr引物组合物的制备方法，引物组合物包含下面3对引物中的至少一对：用于扩增全长rhdmrna剪接体的1对共2条引物，2条引物的序列分别为：上游引物：5'-cccacagctccatcatggg-3'(seqidno:1)，下游引物：5'-gccaatcatgccattgccggc-3'(seqidno:2)；用于扩增缺失exon-7的rhdmrna剪接体的1对共2条引物，2条引物的序列分别为：上游引物：5'-tggctgggctgatctccg-3'(seqidno:3)下游引物：5'-tggaagccaatccggcaggt-3'(seqidno:4)；以及用于扩增缺失exon-7,8,9的rhdmrna剪接体的1对共2条引物，2条引物的序列分别为：上游引物：5'-tggctgggctgatctccg-3'(seqidno:5)下游引物：5'-caaatgaggaaacggcaggt-3'(seqidno:6)。将上、下游引物等体积混合后，即得到引物组合物。优选地，所述引物组合物中各引物的浓度为5pmol/l。实施例21材料与方法1.1剂与仪器mrna提取试剂盒：levsimplyrnabloodkit(由promega公司生产)；cdna反转录试剂盒：transcriptorhighfidelitycdnasynthesiskit(由roche公司生产)；实时荧光定量pcr扩增仪：software由德国罗氏诊断有限公司提供。rhdmrna剪接体pcr扩增引物由takara公司合成。1.2标准曲线的制备1.2.1人工合成ssdna作为标准曲线的标准品、rhdmrna各剪接体标准品及引物序列见表1。1.2.2标准品梯度稀释：以双蒸水溶解标准品，使其浓度为50ng/ul。稀释至10个拷贝数的浓度，每次递减1个数量级，共12个梯度：取12支0.5ml的pcr管，从第2管开始(第一管为原液管)每管加入双蒸水90ul，做好标记1，2，3…..，12，在第2支稀释管中加入10ul的50ng/ul的ssdna文库，悬涡混匀后吸出10ul加到第3管，依次操作，直至稀释到最后一管。最后一管的梯度稀释液去掉。1.3pcr扩增操作：1.3.1提取mrna，反转录为cdna，并以cdna为检测样品。1.3.2标准品：使用各自的标准品(表1)，并设置3复孔。1.3.3引物：所用引物为实施例1中所述三对引物中的上游下游引物分别混合得到的三种引物组合物。1.3.4qpcr加样体系操作：见表2。1.3.5体系扩增条件见表3。表1rhdmrna各剪接体cdna实时荧光定量检测的标准品及序列表2rhdmrna各剪接体cdna的pcr加样体系试剂成分体积(μl)pcr级h2o8.5引物组合物(5pmol/l)0.5mastermix10标准品(或cdna)1反应总体积20表3rhdmrna剪接体cdna共用pcr扩增条件第一步第二步(35循环)第三步95℃10min96℃10s72℃10s65℃3s4℃∝68℃3s每个标准品或样品cdna均检测3个复孔，最终取各孔读数的和取平均数作为检测的结果。1.3.6rhdmrna各剪接体扩增效率全长序列的扩增效率：1.978，线性范围：104～109缺失exon7序列的扩增效率：1.951，线性范围：103～108缺失exon7/8/9序列的扩增效率：1.878，线性范围：104～1091.3.7rhdmrna的cdna定量计算方法：2ndderivativemax计算法。2结果2.1rhdmrna提取需达到标准：a260/a280的比值范围：1.8～2.1之间。mrna浓度>0.8μg/μl，从全血中提取mrna电泳如图1所示。2.2实时监测每一个pcr扩增循环中的实时荧光信号，实时荧光信号代表扩增产物的拷贝数，拷贝数的积累与rhdmrna剪接体含量成正比，标准曲线如图2所示。利用标准曲线，计算得到标准品及待测样品的定量结果如表4所示。表4利用标准曲线对样品进行定量标准品的实验结果要求达到：error<0.02；efficiency：1.9～2.1之间；线性范围：103～109之间。标准品的实验结果在以上可控范围内，实测样品的数据为有效数据。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。sequencelisting<110>深圳市血液中心<120>用于检测rhdmrna剪接体的pcr引物组合、试剂盒及实时荧光定量检测方法<130>kh17-1-436<160>9<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>whole-f<400>1cccacagctccatcatggg19<210>2<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><223>whole-r<400>2gccaatcatgccattgccggc21<210>3<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>exon-7-f<400>3tggctgggctgatctccg18<210>4<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>exon-7-r<400>4tggaagccaatccggcaggt20<210>5<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>exon-7,8,9-f<400>5tggctgggctgatctccg18<210>6<211>20<212>dna<213>artificia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