一种快速检测Q烟粉虱体内共生菌Cardinium的引物及方法与流程

本发明涉及一种基于常规pcr技术快速检测烟粉虱体内cardinium共生菌的引物及方法，属于农业生物技术领域。

背景技术：

烟粉虱bemisiatabaci(gennadius)是一种世界性农业害虫，也是科技界有史以来唯一冠以“超级害虫”称谓的昆虫。烟粉虱既通过吸取植物汁液直接为害宿主植物，又可以分泌蜜露而滋生煤污菌对宿主植物造成间接危害；更重要的是多数刺吸式昆虫都是植物病毒传播媒介，传播植物病毒并引发植物病毒病是烟粉虱对农作物的最主要危害方式。烟粉虱是一个包含多个隐种的复合种，其中b和q隐种是入侵性最强、分布最广的两种。2003年在云南昆明一品红植株上首次发现q烟粉虱入侵中国后，在其他多数省份也陆续发现了q烟粉虱。目前，q烟粉虱已在全国范围内取代了b烟粉虱成为作物上烟粉虱优势种。

共生菌cardinium是q烟粉虱体内一种重要次生内共生菌，属于拟杆菌门(bacteroidetes)鞘脂杆菌纲(sphingobacteria)，屈挠杆菌科(flexibacteraceae)。cardinium于2004年在恩蚜小蜂属(encarsia)寄生蜂中首次报道，目前已发现在蛛形纲以及昆虫纲的膜翅目和半翅目等类群中广泛存在。cardinium对寄主的调控功能基本与wolbachia一致，能够引起宿主的雌性化，诱导产雌孤雌生殖和诱导胞质不亲和等生殖异常现象。此外，研究还表明cardinium能提高种群的繁殖率进而提高其适合度。

共生菌cardinium的传播方式主要是通过雌虫产卵垂直传给下一代。目前使用传统的cardinium检测方法检测已知感染cardinium烟粉虱，即提取单头烟粉虱dna，以dna为模板，利用cardinium的16srrna基因进行常规pcr扩增(尹祥杰，孙秀新，muhammadzahmed，任顺祥，邱宝利.2015.南方部分地区烟粉虱及其寄生蜂内共生菌cardinium的检测及其系统发育关系，应用昆虫学报，52(4)：1014-1022.)，发现在已知感染cardinium的烟粉虱种群中cardinium检测率仅有30％左右。使用现有常用引物(card-f：5’-acgggaggcagcagta-3’；card-r：5’-ccgcagggattgtttt-3’)检测已确定感染cardinium烟粉虱种群发现，该引物对烟粉虱体内cardinium具有非特异性扩增现象。另外，虽然利用荧光定量pcr与常规pcr相结合的方法能够在烟粉虱体内全部检出cardinium(张文平，刘佰明，张珊，万方浩，褚栋.2015.基于epg技术的烟粉虱两个品系取食行为的比较，中国农业科学，2016，49(13)：2544-2552.)，但操作步骤繁琐且耗时耗力。

综上所述，目前对q烟粉虱体内共生菌cardinium的检测存在着检出率低或者操作步骤繁琐且浪费人力、物力、财力的不足。因此，目前急需一种快速高效检测q烟粉虱体内cardinium共生菌的引物及方法。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种快速有效的检测q烟粉虱体内共生菌cardinium的引物及方法。

本发明技术方案如下：

一种快速检测q烟粉虱体内共生菌cardinium的基因片段，核苷酸序列如seqidno.3所示。

一种快速检测q烟粉虱体内共生菌cardinium的引物，所述引物为一对，上游引物核苷酸序列如seqidno.1所示，下游引物核苷酸序列如seqno.2所示。

上游引物ceper1-f：5’-ttcaaagcagaggtgccaaa-3’；seqidno.1

下游引物ceper1-r：5’-caaaatagtagaagcacagccaatc-3’；seqidno.2

一种快速检测烟粉虱体内cardinium共生菌的方法，步骤如下：

(1)提取q烟粉虱基因组dna，制得基因组dna溶液；

(2)以步骤(1)制得的基因组dna为模板，利用上述的引物对基因组dna进行pcr扩增，制得pcr扩增产物；

(3)对步骤(2)制得的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用2％琼脂糖凝胶电泳结束后在紫外凝胶成像仪上成像，当pcr扩增产物电泳图谱显示被测样品有147bp的一条条带时，则该被检测样品为cardinium感染q烟粉虱；当pcr扩增产物电泳图谱显示被测样品无条带时，则为cardinium未感染q烟粉虱。

优选的，所述步骤(2)中pcr扩增的扩增体系为：

基因组dna溶液2μl，10μm引物0.26μl，5u/μltaq酶0.13μl，10×taqbuffer(缓冲液)1.3μl，10mmdntp0.26μl，ddh2o补至13μl；

优选的，所述步骤(2)中pcr扩增的扩增条件如下：

94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，64℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸3分钟。

上述步骤(1)中提取q烟粉虱基因组dna和步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)。

有益效果

1、本发明根据共生菌cardinium的基因组中的ceper1基因片段设计引物。该基因片段具有物种特异性，通过对该片段设计特异引物，可以显助提高检测的准确性，并且减少了操作步骤，降低了检测成本，大大提高了cardinium在q烟粉虱体内的检测效率；

2、本发明从分子水平探索建立了q烟粉虱体内共生菌cardinium的检测技术，为今后q烟粉虱与共生菌cardinium的互作机制研究奠定了基础。

附图说明

图1、实施例1中pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图中：a、已知cardinium感染q烟粉虱种群，b、已知cardinium未感染q烟粉虱种群，m、dl2000dnamarker；

图2、实施例2中pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图中：a、山东省枣庄地区q烟粉虱种群，b、山东省济南地区q烟粉虱种群，m、dl2000dnamarker；

图3、实施例3中海南省陵水黎族自治县q烟粉虱pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图中：m、dl2000dnamarker，+、阳性对照，-、阴性对照；

图4、对比例1扩增已知感染cardinium的q烟粉虱琼脂糖凝胶电泳图；

图中：a、已知cardinium感染q烟粉虱种群，b、已知cardinium未感染q烟粉虱种群，m、dl2000dnamarker；

图5、对比例2扩增已知感染cardinium的q烟粉虱琼脂糖凝胶电泳图；

图中：a、已知cardinium感染q烟粉虱种群，b、已知cardinium未感染q烟粉虱种群，m、dl2000dnamarker。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步的阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物样品

实施例1、对比例1和对比例2中的已知cardinium感染与未感染q烟粉虱种群是根据青岛农业大学入侵生物实验室长期饲养种群，按照(张文平，刘佰明，张珊，万方浩，褚栋.2015.基于epg技术的烟粉虱两个品系取食行为的比较，中国农业科学，2016，49(13)：2544-2552.)中所记载方法建立种群；

实施例2中所述q烟粉虱于2015年采集于山东省枣庄市、济南市。

实施例3中所述q烟粉虱于2016年采集于海南省陵水黎族自治县。

实施例1

一种快速检测q烟粉虱体内共生菌cardinium的方法，步骤如下：

(1)将待检测的单头q烟粉虱置于含30μl碱裂解液0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·l^-1tris-hcl(ph8.0)、20mmol·l^-1nacl、1mmol·l^-1edta(乙二胺四乙酸)、1％sds(十二烷基硫酸钠)，用封口枪头充分研磨匀浆后置于pcr仪(65℃15min，95℃10min)后，制得基因组dna溶液；

(2)以步骤(1)制得的基因组dna溶液为模板进行pcr扩增，制得pcr扩增产物；

所述pcr扩增的引物核苷酸序列如下：

上游引物ceper1-f：5’-ttcaaagcagaggtgccaaa-3’；seqidno.1

下游引物ceper1-r：5’-caaaatagtagaagcacagccaatc-3’；seqidno.2

所述pcr扩增的体系如下：

q烟粉虱基因组dna溶液2μl；10μm引物0.26μl；5u/μltaq酶0.13μl；10×taqbuffer1.3μl；10mmdntp0.26μl；ddh20补至13μl；

所述pcr扩增的程序如下：

94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，64℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸3分钟。

(3)用质量百分比为2.0％的琼脂糖凝胶电泳对步骤(2)制得的pcr扩增产物进行电泳检测。

通过对已知cardinium感染与未感染q烟粉虱种群进行上述检测，cardinium感染q烟粉虱在成像胶片上均有一条片段长度147bp左右的条带，经检测，序列如seqidno.3所示；cardinium未感染q烟粉虱在成像胶片上均无条带，结果如图1所示。

对比例1

如实施例1中检测q烟粉虱体内共生菌cardinium的方法，不同之处在于，所述引物为cfb-f：5’-gcggtgtaaaatgagcgtg-3’和cfb-r

5’-acctmttcttaactcaagcct-3’。(尹祥杰，孙秀新，muhammadzahmed，任顺祥，邱宝利.2015.南方部分地区烟粉虱及其寄生蜂内共生菌cardinium的检测及其系统发育关系，应用昆虫学报，52(4)：1014-1022.)。结果发现在已知感染cardinium的烟粉虱种群中cardinium检测率仅有30％左右(图3)。

对比例2

如实施例1中检测q烟粉虱体内共生菌cardinium的方法，不同之处在于，所述引物为card-f：5’-acgggaggcagcagta-3’和card-r：5’-ccgcagggattgtttt-3’，检测已确定感染cardinium烟粉虱种群发现，该引物对烟粉虱体内cardinium具有非特异性扩增现象(图4)。

实施例2

如实施例1中检测q烟粉虱体内共生菌cardinium的方法，不同之处在于，所述q烟粉虱于2015年采集于山东省枣庄市、济南市。

结果如图2显示，成像胶片上共有4条大约在147bp左右的条带均采自于枣庄地区，表明在该地区随机挑取的10头q烟粉虱中共检测到4头感染cardinium烟粉虱；济南地区随机选取的10头q烟粉虱中没有检测到感染cardinium烟粉虱。

实施例3

如实施例1中检测q烟粉虱体内共生菌cardinium的方法，不同之处在于，所述q烟粉虱于2017年采集于海南省陵水黎族自治县。

结果如图2显示，成像胶片上共有5条大约在147bp左右的条带均采自于陵水地区，表明在该地区随机挑取的10头q烟粉虱中共检测到5头感染cardinium烟粉虱。

以上结果表明本发明所述引物及方法能够用来进行田间采集烟粉虱种群中cardinium的检测。

结果分析

通过以上实施例1和对比例1-2的结果可以看出，采用对比例1的检测方法，在已知感染cardinium的烟粉虱种群中cardinium检测率仅有30％左右。采用对比例2的检测方法检测已确定感染cardinium烟粉虱种群发现，该引物对烟粉虱体内cardinium具有非特异性扩增现象。而实施例1的检测结果与实际结果完全吻合，并且检测结果清晰可辨。为今后q烟粉虱与共生菌cardinium的互作机制研究奠定了基础。

上述实施例仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明内容所作的均等变化与修饰，都为本发明权利要求所要求保护的范围所涵盖。

sequencelisting

<110>青岛农业大学

<120>一种快速检测q烟粉虱体内共生菌cardinium的引物及方法

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

ttcaaagcagaggtgccaaa20

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

caaaatagtagaagcacagccaatc25

<210>3

<211>147

<212>dna

<213>cardinium

<400>3

ttcaaagcagaggtgccaaacgcttggtgtaaccaaactgcaatcttcaatattgctgct60

gcttgcaaagaagacaacactaagctgagtagtgccactgttaccattggaaaaatgaca120

acgattggctgtgcttctactattttg147