本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种新的具有抑制血小板聚集作用的多肽。
背景技术：
心脑血管疾病主要包括急性心肌梗死、脑梗死、肺梗死、缺血性心脏病、脑卒中等常见病，严重威胁人类健康及生命，为我国居民首位死因[1]。血小板活化是心脑血管疾病发生、发展过程中重要的始动因子，而血小板激活、粘附及聚集直至血栓形成是一系列的级联反应，不仅在生理性止血过程中发挥关键作用，同时也参与血栓形成、组织修复等病理过程[2,3]。血小板聚集对于血栓的形成起着核心作用。血小板聚集的诱导剂主要包括：胶原、花生四烯酸、adp、凝血酶等。
1、胶原引起的血小板活化
当血管内皮细胞受损或斑块破裂使胶原蛋白暴露时，血小板膜蛋白和暴露的胶原蛋白或活化的vwf结合，是启动血栓形成的关键步骤。血小板表面拥有膜蛋白gpvi和整合素-α2β1两个识别胶原蛋白的特定序列，从而牢固结合胶原蛋白。其中gpvi是胶原信号转导受体，参与整合素-α2β1调节的血小板粘附后的信号转导和血小板活化与聚集[4-7]。胶原与两种膜蛋白的共同作用下，最终激活整合素αⅱbβ3活化途径，引起血小板聚集、释放[8,9]。
2、花生四烯酸引起的血小板活化
血小板胞内ca2+水平升高可引起磷脂酶a2活化，继而花生四烯酸从磷脂膜中游离出来。花生四烯酸在环氧合酶-1作用下合成血栓素a2（txa2），txa2与血小板膜上的txa2受体结合后[10]，与特异性的g蛋白偶联受体gq和g13结合使血小板活化。txa2不仅是血小板活化和血管平滑肌收缩的强激动剂，它还可以放大由低剂量凝血酶和adp等引起的血小板活化信号。txa2与受体结合后激活其下游的plcβ，引起ip3、dag、g13以及与这些蛋白相关的信号通路的活化[11]，最终引起血小板变形和血小板内颗粒体的释放[12]。
3、adp引起的血小板活化
adp是活化血小板中致密颗粒释放的主要成分，其在血小板活化和聚集过程中起着非常重要的作用。adp受体主要有p2y1,p2y12和p2x1。其中，p2y1是一种g蛋白偶联的跨膜受体,adp与p2y1受体结合后,p2y1受体与gq蛋白偶联激活磷酯酶c从而导致ca2+从细胞外流入细胞内,细胞内ca2+浓度的升高激活了蛋白激酶c引起血小板变形和聚集[13]。p2y12是一类g蛋白偶联的受体[14],不仅对adp引起的血小板不可逆聚集非常重要,而且对adp介导的txa2的产生至关重要。p2x1蛋白受体为配体门控性离子通道,主要负责由adp引起的快速钙内流，在血小板聚集中所起的作用比较微弱[15]。
4、凝血酶引起的血小板活化
凝血酶是最有效的血小板激动剂，其通过与血小板膜表面蛋白酶活化受体（pars）结合后激活血小板。人的血小板表达par-1和par-4[16]，其中任何一个活化都可引起血小板聚集和颗粒释放[17]。研究发现，par-1对低浓度的凝血酶敏感，而par-4仅在高浓度凝血酶环境下触发血小板的活化和聚集；并且凝血酶对par-4的裂解作用比par-1慢20至70倍，因此，par-1是凝血酶引起血小板活化最重要的受体[18,19]。研究表明，par-1和gq、g13、gi/z偶联，par-4只和gq、g13偶联从而使凝血信号与胞内信号通路链接起来，导致plcβ、pi3k和ras相似物rho激酶的活化，引起ip3水解，钙动员以及pkc活化[17,20]。
然而，现有抗血小板药物不仅具有出血倾向（脑出血、消化道大出血）等副作用[21]，且在临床应用中存在抵抗或者低应答现象，不良缺血事件仍有发生；同时，这些药物作用机制单一，抗血小板作用存在一定局限性：如阿司匹林不可逆地阻断cox-1合成，从而抑制血小板活化、聚集[10,22]；氯吡格雷不可逆地抑制adp与其受体p2y12结合，抑制adp诱导的血小板聚集[23]；替格瑞洛可逆地与adp-p2y12受体相互作用，同样抑制adp诱导的血小板聚集[24]；vorapaxar和atopaxar是现处于临床试验阶段的par-1抑制剂，可抑制凝血酶诱导的血小板聚集[25,26]；阿昔单抗、替罗非班、依替巴肽均属于gpⅱb/ⅲa受体拮抗剂[27]。临床上，为了增加疗效、减少副作用，多联合使用不同作用机制的抗血小板药物。因此，寻求更安全可靠的新型抗血小板药物具有重要意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗血小板聚集的多肽km22，该多肽对胶原、adp、花生四烯酸、凝血酶诱导的血小板聚集有明显抑制作用，可用于探索其与其它血小板激活剂（肾上腺素，瑞斯托霉素等）对血小板的作用及相关功能的影响，还可以用于监测现有的抗血小板治疗。
实现本发明所述目的而采取的技术方案是：该多肽是由8个氨基酸组成的多肽km22，具有seqidno:1的多肽的序列，分子量1112.20da，序列为gln-asp-thr-thr-tyr-leu-trp-trp。
所述的抗血小板聚集的多肽km22可应用于制备对血小板聚集有抑制作用的制剂中。合成多肽后，经高效液相色谱法及质谱法技术验证，表明合成的底物为完整的氨基酸序列（图1、图2）。
所述的抗血小板聚集的多肽km22可应用于制备抗血小板聚集及治疗心血管疾病药物。
所述的抗血小板聚集的多肽km22应用于制备抗血小板聚集及治疗心血管疾病药物中，该多肽km22为活性成分，并且含有一种或者多种药学上可接受的载体。
本发明所提供的多肽的生物学特性能预见其许多应用。
本发明可涉及用于制备抗血小板聚集及治疗心血管疾病药物中的应用。
本发明可涉及用于出血性疾病：评估血小板聚集功能，评估现有止血治疗（止血绷带、止血粘着剂等）的有效性。
本发明可涉及用于血栓性疾病：评估血小板聚集功能，评价抗血小板治疗（如阿司匹林，氯吡格雷、替格瑞洛等）现在或将来治疗的有效性；同时，因其抑制血小板聚集作用，可用于抗血栓治疗。
本发明所提供的多肽，经测试具有明显抑制凝血酶、adp、胶原、花生四烯酸诱导的血小板聚集的作用：在凝血酶、adp、花生四烯酸、胶原单独作用下，诱导血小板平均聚集率分别为40%、40%、61%、73%，在100μmkm22和凝血酶、adp、花生四烯酸、胶原共同作用下诱导血小板平均聚集率分别为21%、20%、41%、25%，且km22抑制血小板聚集的作用呈现剂量依赖性（图3、图4）。该多肽不限定于抑制凝血酶、adp、胶原、花生四烯酸诱导的血小板聚集，可用于探索其与其它血小板激活剂（肾上腺素，瑞斯托霉素等）对血小板的作用及相关功能的影响，还可以用于监测现有的抗血小板治疗。
本发明涉及一个由8个氨基酸组成的多肽km22，通过体外人血血小板聚集实验来测定其对血小板聚集活性的作用。实验证明，该多肽对胶原、adp、花生四烯酸、凝血酶诱导的血小板聚集有明显抑制作用。本发明所涉及的新的多肽km22序列，迄今尚未见到相关报道。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明的发明范围。
图1为本发明所提供的多肽的高效液相色谱纯化图：峰值c即为km22。
图2为峰值c（即km22）的二级质谱图。
图3为经光学比浊法检测km22对凝血酶、adp、胶原、花生四烯酸诱导的血小板聚集影响的血小板聚集曲线图。富血小板血浆与不同浓度的km22在37℃下孵育20分钟后，加入凝血酶、adp、胶原、花生四烯酸诱导剂，并记录血小板聚集曲线（均数，n≥3）。
图4为经光学比浊法检测km22对凝血酶、adp、胶原、花生四烯酸诱导的血小板聚集的影响的条状图。不同浓度km22对凝血酶、adp、胶原、花生四烯酸诱导的血小板聚集的影响（均数±标准误，n≥3）。*（p<0.05），**（p<0.01）。
具体实施方式
实施例：本发明所提供的多肽人体外抑制凝血酶、adp、胶原、花生四烯酸诱导的人血小板聚集
通过光学比浊法检测来评价km22对凝血酶、adp、胶原、花生四烯酸诱导的血小板聚集的影响。
从我院血库提供的健康的志愿者签字同意后，收集单采血小板。
（1）用含有15%dmso的去离子水稀释多肽，调整多肽终浓度为10mm；在对照实验组中加入等体积的15%dmso无多肽的去离子水。
（2）取100μl单采血小板，用300μl改良的tyrode’s缓冲液(137mmnacl,27mmkcl,1mmmgcl2,0.42mmnah2po4,5.5mmglucose,5.55mmhepes,0.25%bovineserumalbumin,ph7.4)稀释血小板，即为富血小板血浆，血小板数目调整为2.5×108个血小板/ml；另外取100μl单采血小板并用300μltyrode’s缓冲液稀释血小板后10000rpm/分钟离心10分钟，上清为贫血小板血浆。
（3）吸取400μl血小板重悬液37℃下预热5min后在上述血小板重悬液中加入不同浓度的km22（0μm，1μm，10μm，100μm）37℃孵育20min。打开血小板聚集仪，按要求设置好参数，在孵育好的富血小板血浆中放入磁力棒，将带有磁力搅拌棒的血小板反应杯插入机器的检测孔中，将其置于血小板聚集仪测试区调零后加入凝血酶、adp、胶原、花生四烯酸刺激剂，在37℃、1200rpm/s条件下观察km22对不同激活剂引起的血小板聚集的影响，共观察5-10min。每个km22浓度组重复至少三次，取平均值。根据血小板聚集率记录血小板聚集曲线图和绘制相应的条状图（图3，图4）
（4）实验数据用spss21.0统计软件进行处理。结果用均数±标准误表示。多组间比较先进行方差齐性检验，方差齐者用单因素方差分析（one-wayanova），两两比较用lsd（least-significantdifference,即最小显著性差异法）检验；若方差不齐则行tamhane’st2检验，两两比较采用t检验。p<0.05则认为差异具有统计学意义。
经血小板聚集实验，该多肽能明显抑制凝血酶、adp、胶原、花生四烯酸等刺激剂诱导的人血小板聚集。在凝血酶、adp、花生四烯酸、胶原单独作用下，诱导血小板平均聚集率分别为40%、40%、61%、73%，在100μmkm22和凝血酶、adp、花生四烯酸、胶原共同作用下诱导血小板平均聚集率分别为21%、20%、41%、25%。
从以上结果可以看出，本发明提供的多肽km22对凝血酶、adp、胶原、花生四烯酸等刺激剂诱导的人血小板聚集有明显抑制作用,呈现剂量依赖关系。
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sequencelisting
<110>昆明医科大学附属第一医院
<120>一种抗血小板聚集的多肽km22
<140>
<160>1
<170>patentinversion3.5
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<212>prt
<213>人工序列
<400>1
glnaspthrthrtyrleutrptrp
15