本发明涉及到蛋白质组学研究领域的植物总蛋白提取方法，具体涉及到从tca/丙酮沉淀的蛋白质干粉中快速高效地提取蛋白质。
背景技术：
近年来，蛋白质组学相关技术的飞速发展将蛋白质组学的应用推进到几乎所有的生物领域，包括植物学领域。蛋白质样品的制备是蛋白质组学研究的基础，直接影响到后期的组学分析，理想的样品制备方法应当可以最大限度的提取样本中的所有蛋白质，同时具备良好的重复性。因此，样品的制备遵循以下几个原则：尽可能采用简单方法进行样品处理以避免蛋白丢失；尽可能减少蛋白的降解；尽可能提高蛋白的溶解性。植物组织中通常蛋白质丰度相对较低，却含有相对高量的蛋白酶和次生代谢物，严重影响了蛋白质的分离制备。tca/丙酮沉淀法是一种常用的植物蛋白分离方法，能够有效抑制样品中各种酶的活性和去除酚类等次生代谢物的干扰，但是tca/丙酮沉淀的蛋白质干粉在后续的溶解上速度慢、提取不完全，往往造成蛋白质的丢失。因此本发明针对tca/丙酮方法沉淀的蛋白质干粉发明了一种新的提取液，可以快速高效地从tca/丙酮沉淀的干粉中提取总蛋白，提取效率高、重复性好，适宜于lc-ms的蛋白质组学分析。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的缺点和不足，本发明提供一种植物蛋白质的提取方法以及快速高效地从tca/丙酮方法沉淀的蛋白质干粉中提取蛋白质的提取液。
本发明提供的一种植物总蛋白的提取方法，包括以下步骤：
（1）1g的植物组织在液氮中充分研磨粉碎，加入10ml预冷的10%tca/丙酮溶液，涡旋震荡使组织粉末分散均匀，放置-20℃过夜；
（2）次日早上取出于4℃、10000g离心30分钟，弃上清，再以丙酮充分洗涤除去残留的tca，室温晾干获得蛋白质干粉；
（3）配制包含以下成分的蛋白质干粉提取液：1）25mmhepes缓冲液、2）150mmkcl、3）2mmmgcl2、4）9m尿素、5）1%chaps、6）1mmdtt、7）1mmpmsf、8）蛋白酶抑制剂，配制过程分三步：1）先从储备液中按比例分取hepes、kcl和mgcl2配制基本组份；2）再将尿素加入到1）溶液中，使其完全溶解，再加入chaps至完全溶解；3）使用前加入dtt、pmsf和蛋白酶抑制剂；
（4）以蛋白质干粉：提取液=100mg：1ml的比例加入提取液进行溶解总蛋白质，4℃、10000g离心30分钟，收集上清，即总蛋白质溶液；
（5）bca法测定蛋白质浓度，取2µg总蛋白质进行sds-page分析。
步骤（1）的10%tca的丙酮溶液含有20mm的β-巯基乙醇，提前在-20℃预冷，并且在与样品粉末充分混匀后放置-20°c过夜。
步骤（2）的用于洗涤的丙酮含有20mm的β-巯基乙醇，在-20℃预冷，洗涤离心后尽量将上清吸走再加下一轮丙酮，需要重复3次以充分除掉tca。
步骤（3）的蛋白质干粉提取液的基本组成是hepes（ph8.0）、kcl和mgcl2，起始加入量是其终浓度的1.6倍，可提前配制4℃保存备用。
步骤（3）的尿素以2.7g加入到3ml基础组份的比例添加，尿素溶液宜当天配制当天使用，待尿素完全溶解后再加入chaps，chaps加入比例以尿素溶解后的溶液体积为依据。
步骤（3）的dtt、pmsf和蛋白酶抑制剂均在使用前由母液按比例分取加入。
步骤（4）的蛋白质干粉的总蛋白提取在室温下操作，加入专用提取液后静置10分钟让蛋白质干粉充分吸涨，再轻柔混匀2分钟，离心。
步骤（5）的sds-page电泳分离胶浓度为10%，浓缩胶90v进行30分钟，分离胶150v进行40分钟。
本发明主要针对tca/丙酮沉淀的蛋白质干粉的提取效率，运用两性离子缓冲液hepes（ph8.0）作为基础缓冲体系配制的提取液，包含了高浓度的尿素（9m）和两性离子去污剂chaps（1%），可减少一些蛋白质在缓冲液中难溶而无法提取的问题，从蛋白质干粉中快速高效地提取蛋白质，使制备的样品更能全面反映研究对象中蛋白质的组成。同时，用此提取液分别应用于烟草和紫薇叶片的蛋白质提取，两种植物的蛋白质干粉溶解性均较好，溶解出来的蛋白质经sds-page电泳分离检测条带清晰、分布区域广、不拖尾、不弥散，能够满足lc-ms的蛋白质组学分析。
附图说明
图1为实施例1提取的烟草叶片总蛋白的sds-page电泳图。
图2为实施例2提取的紫薇突变体和野生型叶片总蛋白的sds-page电泳图。
图3为紫薇突变体和野生型总蛋白质经过trypsin酶切，uplc分离出的不同肽段。
具体实施方式：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
试剂：
尿素、pmsf、acr、bis、sds、cbbr250、cbbg250均购自上海生工生物工程有限公司，dtt、hepes、chaps、蛋白酶抑制剂购自sigma公司，temed、β-巯基乙醇购自上海麦克林生化科技有限公司，氯化钾、氯化镁、异丙醇、三氯乙酸、丙酮、甲醇、乙酸、磷酸、过硫酸铵均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司，实验中所用到的水为超纯水。
实施例1，应用本发明提取烟草叶片总蛋白
（1）三份1g烟草叶片依次在液氮中充分研磨粉碎，加入10ml预冷的10%tca/丙酮（含20µmβ-巯基乙醇）溶液，涡旋震荡使组织粉末分散均匀，放置-20℃过夜。取出于4℃、10000g离心30分钟，弃去上清液。再以预冷的丙酮（含20µmβ-巯基乙醇）充分洗涤沉淀，弃去上清液，重复洗涤3次，沉淀室温晾干获得蛋白质干粉。
（2）以本发明的蛋白质干粉提取液进行总蛋白质的提取，100mg蛋白质干粉中加入1ml提取液，室温静置5分钟，让蛋白质干粉充分吸涨溶解出蛋白质，轻柔混匀2分钟，于4℃、10000g离心30分钟，收集上清液，即总蛋白质溶液
（3）bradford法测定蛋白质浓度，取2µg总蛋白质进行10%的sds-page分离，考马斯亮蓝染色。
（4）由图1可以看出烟草叶片蛋白在sds-page上得到了良好的分离，平行提取的三个样品的蛋白条带清晰，重复性较好，没有出现拖尾、弥散现象，蛋白质在高分子量和低分子量的分布比较均匀，说明本发明的蛋白质干粉提取液的总蛋白质质量较高。
实施例2，应用本发明提取紫薇突变体和野生型的叶片总蛋白
（1）分别取紫薇突变体和野生型的叶片各三个重复样品1g，分别在液氮中充分研磨粉碎，加入10ml预冷的10%tca/丙酮（含20µmβ-巯基乙醇）溶液，涡旋震荡使组织粉末分散均匀，-20℃静置过夜。取出于4℃、10000g离心30分钟，弃去上清液。再以预冷的丙酮（含20µmβ-巯基乙醇）充分洗涤沉淀，弃去上清液，重复洗涤3次，沉淀室温晾干获得蛋白质干粉。
（2）以本发明的蛋白质干粉提取液进行总蛋白质的提取，100mg蛋白质干粉中加入1ml提取液，室温静置5分钟，让蛋白质干粉充分吸涨溶解出蛋白质，轻柔混匀后，于4℃、10000g离心30分钟，收集上清液，即总蛋白质溶液。
（3）bradford法测定蛋白质浓度，取2µg总蛋白质进行sds-page分离，考马斯亮蓝染色。
（4）由图2可以看出紫薇叶片蛋白质在10%的sds-page上得到了良好的分离，平行提取的三个样品的蛋白质重复性较好，条带清晰，蛋白质在高分子量和低分子量的分布比较均匀，没有出现拖尾、弥散现象，说明本发明的蛋白质干粉提取液同样适用于木本植物总蛋白质的提取。提取的突变体和野生型总蛋白质在sds-page上即可观察到明显的差异，等量总蛋白质进行typsin蛋白酶解和uplc分离，获取的肽段信号良好，野生型和突变体肽段丰度差异显著（图3），表明提取的蛋白质能够反映样品的属性。
本发明针对植物常用提取方法tca/丙酮制备的蛋白质干粉的提取能力发明的专用提取液，在室温下静置吸涨5分钟即可提取到相对丰富的蛋白质，经sds-page检测条带清晰、分布范围广、不拖尾、不弥散，能较为全面的反映研究对象中蛋白质的组成。同时，用此提取液提取紫薇突变体和野生型的叶片总蛋白质，取得了良好的提取效果，能够直观的反映出两种比较材料的蛋白质组成上的差异。