本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种成胶因子的制备方法和水凝胶的制备方法以及应用。
背景技术：
器官移植作为一种重要的医学技术，弥补了传统医学的不足，是器官功能衰竭根治的唯一方法，被誉为“21世纪医学之巅”；肝脏移植是良性终末期肝病、肝脏恶性疾病、先天性肝病、代谢性、急性/亚急性肝功能衰竭等肝脏疾病的根治方法。
然而，器官移植手术中的一个关键性问题就是移植排斥反应，这种反应是一种机体对移植器官的免疫响应。目前，临床上应用免疫抑制药物进行预防，术后早期是排斥反应的高发时间，常需联合应用大剂量免疫抑制药物进行预防，随着移植术后时间的延长，排斥反应的发生风险逐渐降低，可以逐步降低免疫抑制程度。对于急性排斥反应，可以采取激素冲击和增加免疫抑制药物浓度等方法进行治疗，而对于慢性排斥反应，目前尚缺乏有效的逆转措施，由于长期应用免疫抑制药物，器官移植受者容易罹患移植术后新发肿瘤、移植术后新发糖尿病、高脂血症、高尿酸血症、心脑血管疾病等并发症。因此，在发生排斥反应时，再用药是提高移植患者生存质量，预防并发症的重要手段。他克莫司(tac，fk506)是一种常用的免疫抑制试剂，主要在器官移植手术中通过干预t细胞的活化来降低器官移植排斥反应。然而，直接服用他克莫司可能导致严重的副作用，包括慢性移植肾肾病、糖尿病、动脉高血压和神经毒性等。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种成胶因子的制备方法，其能够制备得到具有很好地与他克莫司进行成胶，通过活化的t细胞响应能够使得他克莫司的释放，提高治疗效能，同时避免了直接服用他克莫司可能导致的毒副作用的成胶因子。
本发明的第二个目的是提供一种水凝胶的制备方法，使其制备得到通过活化的t细胞响应能够使得他克莫司的释放，提高治疗效能，同时避免了直接服用他克莫司可能导致的毒副作用的水凝胶。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提供的一种成胶因子的制备方法，其包括：通过固相合成方法合成nap-phe-phe-glu(otbu)-tyr(tbu)-oh肽段，再脱除酪氨酸侧链和谷氨酸侧链上的tbu保护基；其中，nap为萘基，phe为苯丙氨酸，glu为谷氨酸，tyr为酪氨酸。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，成胶因子的序列为：nap-l-phe-l-phe-glu-tyr-oh。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，成胶因子的序列为：nap-d-phe-d-phe-glu-tyr-oh。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，该成胶因子的结构为：
进一步地，在本发明较佳的实施例中，固相合成固相合成方法合成nap-phe-phe-glu(otbu)-tyr(tbu)-oh肽段包括：
将2-氯三苯甲基氯树脂在n,n-二甲基甲酰胺内溶胀后，加入第一个氨基酸酪氨酸和n，n-二异丙基乙胺进行第一次反应；
加入含有哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶胀，再加入活化的第二个氨基酸谷氨酸和n，n-二异丙基乙胺进行第二次反应；
再次加入含有哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶胀，然后加入活化的第三个氨基酸苯丙氨酸和n，n-二异丙基乙胺进行第三次反应；
再加入含有哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶胀，加入活化的第四个氨基酸苯丙氨酸和n，n-二异丙基乙胺进行第四次反应；
再加入含有哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶胀，加入活化后的萘乙酸和n，n-二异丙基乙胺进行第五次反应；
用含三氟乙酸的二氯甲烷从2-氯三苯甲基氯树脂上切下合成的所述nap-phe-phe-glu(otbu)-tyr(tbu)-oh肽段。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，第一个氨基酸、第二个氨基酸、第三个氨基酸、第四个氨基酸以及萘乙酸均用hobt和hbtu中的至少一种进行活化以及基团保护。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，第一个氨基酸、第二个氨基酸、第三个氨基酸、第四个氨基酸以及萘乙酸均用hobt和hbtu进行活化以及基团保护。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，含有哌啶的n,n-二甲基甲酰胺中的哌啶的体积浓度均为15～25％。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，含有哌啶的n,n-二甲基甲酰胺中的哌啶的体积浓度均为18～23％。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，含有哌啶的n,n-二甲基甲酰胺中的哌啶的体积浓度均为19～21％。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，每次溶胀的时间均为4～8分钟。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，每次溶胀的时间均为5～6分钟。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，第一次反应、第二次反应、第三次反应、第四次反应以及第五次反应的反应时间均为2～3小时。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，含三氟乙酸的二氯甲烷中的三氟乙酸的体积浓度为0.8～1.2％。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，含三氟乙酸的二氯甲烷中的三氟乙酸的体积浓度为0.9～1.1％。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，该成胶因子的制备方法还包括在脱除tbu保护基后进行纯化。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，使用旋转蒸发仪除去溶剂后利用制备型高效液相色谱纯化。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，固相合成固相合成方法合成nap-phe-phe-glu(otbu)-tyr(tbu)-oh肽段中，脱除tbu保护基是通过含有三氟乙酸的脱除液进行脱除。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，固相合成固相合成方法合成nap-phe-phe-glu(otbu)-tyr(tbu)-oh肽段中，脱除tbu保护基是通过含有体积浓度为94～96％的三氟乙酸的脱除液进行脱除。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，脱除液包括：94～96％的三氟乙酸、2～4％的三异丙基硅基以及1.5～2.5％的二氯甲烷。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，脱除液包括：95～96％的三氟乙酸、3～4％的三异丙基硅基以及2～2.5％的二氯甲烷。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，固相合成固相合成方法合成成胶因子nap-phe-phe-glu-tyr-oh包括：将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在4～6毫升n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4～8分钟后，加入2毫摩尔第一个氨基酸酪氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺，反应2～3小时后，用100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4～8分钟，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸谷氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2～3小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4～8分钟，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2～3小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4～8分钟，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2～3小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4～8分钟，再加入活化后的1.6毫摩尔萘乙酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2～3小时，最后用含体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷从该树脂上切下上述合成的肽段，通过旋转蒸发仪除去溶剂后利用制备型hplc纯化。
本发明还涉及一种水凝胶的制备方法，其包括：通过上述的成胶因子的制备方法制备得到成胶因子；利用成胶因子对他克莫司进行包覆。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，将成胶因子在45～55℃的温度下附着在他克莫司表面而得到。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，该水凝胶其主要通过以下制备方法得到：将成胶因子、他克莫司以及磷酸盐缓冲溶液的混合液进行加热后冷却。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，将混合液加热至45～55℃后，再冷却至室温。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，混合液的制备是先将他克莫司溶解在磷酸盐缓冲溶液中，再将成胶因子溶解在磷酸盐缓冲溶液中。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，他克莫司在磷酸盐缓冲溶液中的溶解量为5～15μg/ml。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1～0.3m。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，混合液是在含有5～15μg/ml他克莫司的0.1～0.3m的磷酸盐缓冲溶液中溶解0.5～2wt％的成胶因子而得到的。
通过提供一种成胶因子的制备方法，其能够通过固相合成得到一种可以通过分子间的π-π堆积作用成胶，并且能够在在ptk作用下磷酸化生成亲水性的磷酸盐，使得水凝胶转变为溶液的成胶因子。进而使得其包裹他克莫司形成的水凝胶能够在发生免疫排斥反导致的t细胞活化和ptk含量上升时，水凝胶解组装释放出他克莫司，进而避免直接服用他克莫司，达到提高治疗效能，同时避免了直接服用他克莫司可能导致的毒副作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施方式中的成胶因子的合成路线图；
图2为他克莫司的“智能”免疫响应释放示意图；
图3为水凝胶1和2在ptk的诱导下磷酸化以产生其亲水性磷酸酯1p和2p的化学结构的示意图；
图4为包裹了他克莫司的超分子水凝胶gel1和gel2的光学图片；
图5为l构型成胶因子的质谱图；
图6为l构型成胶因子的氢谱图；
图7为l构型成胶因子的流变图；
图8包裹了他克莫司的超分子水凝胶gel1水凝胶的储能模量(g′)和损耗模量(g″)的动态频率扫描示意图；
图9包裹了他克莫司的超分子水凝胶gel2水凝胶的储能模量(g′)和损耗模量(g″)的动态频率扫描示意图；
图10为裹药后超分子水凝胶gel1的tem图；
图11为裹药后超分子水凝胶gel2的tem图；。
图12为裹药后超分子水凝胶gel1的药物释放hplc图；
图13为裹药后超分子水凝胶gel2的药物释放hplc图；
图14为裹药后超分子水凝胶gel1的解胶tem图；
图15为裹药后超分子水凝胶gel2的解胶tem图；
图16为裹药后超分子水凝胶gel1的解胶流变图；
图17为裹药后超分子水凝胶gel2的解胶流变图；
图18为裹药后超分子水凝胶gel1与非活化或活化的t细胞孵育的hplc-ms分析；
图19为不同实验组中的t细胞流式细胞分析图；
图20为分别用水凝胶gel1、水凝胶gel2、他克莫司包封的琼脂糖处理的移植小鼠的外周静脉血中的时间依赖性药物浓度曲线图；
图21为分别用水凝胶gel1、水凝胶gel2、他克莫司包封的琼脂糖处理的移植小鼠的相应存活数。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施方式或实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施方式的成胶因子的制备方法和水凝胶的制备方法以及应用进行具体说明。
超分子水凝胶，作为一种新型的生物材料，它们一般由结构单元(例如：小分子多肽)自组装形成三维网状结构(例如：纳米纤维)，同时包裹大量的水(超过95％)。由于它们固有的生物兼容性和生物降解性，超分子水凝胶在药物释放，组织工程，伤口愈合，生物标记物检测，三维细胞培养，金属离子吸收和功能材料设计等方面具有很大的应用前景。超分子水凝胶的一大特点为其内部为疏松多孔的网状结构，因而也具有了运载其他生物分子(如药物等)的能力，通过物理包埋的方法将药物分子包裹于水凝胶的网络空隙中，随着凝胶的缓慢降解，释放包裹在凝胶中的药物，实现药物的缓释。此外，如果设计在超分子水凝胶到达目标位点后，发生特定响应，再释放出包裹的物质，就可以实现靶向递送，从而大大提高递送效率以及药物的治疗效果。
由于成胶因子的两亲性，在水凝胶中进行物理包埋可以实现对蛋白药物，疏水性药物，小分子药物等多种药物的递送。在到达目标位置后，可以通过环境中的ph、离子强度或特定酶活的变化等，实现水凝胶的可控解组装，同时释放出包裹的药物。
由于在器官移植手术中，抗原受体参与诱导t细胞活化导致蛋白酪氨酸激酶(ptk)含量上升广泛为大家所认同，发明人在此基础上提出了ptk含量上升可用于包裹了他克莫司的水凝胶的解组装，从而实现他克莫司的免疫响应释放的发明思路。
本发明的一些实施方式提供了一种成胶因子，其具有序列：nap-phe-phe-glu-tyr-oh，具体结构如下：
其中，nap为萘基，phe为苯丙氨酸，glu为谷氨酸，tyr为酪氨酸。
上述结构的成胶因子由于含有nap-phe-phe残基，因此，其可以通过分子间的π-π堆积作用成胶，使得其成胶性能好。而成胶因子中的glu-tyr肽段作为ptk磷酸化底物，其使得成胶因子能够在ptk的作用下磷酸化生成亲水性的磷酸盐，进而使得成胶因子形成的水凝胶转化为溶液，进而水凝胶解组装，释放出被包裹在内部的他克莫司，进而避免直接服用他克莫司，达到提高治疗效能，同时使他克莫司的毒副作用大大降低。
根据一些实施方式，成胶因子的序列为：nap-l-phe-l-phe-glu-tyr-oh，或nap-d-phe-d-phe-glu-tyr-oh。l型构型氨基酸和d构型氨基酸在在体内的稳定性有所差异，可以选择上述其中两种序列来形成成胶因子，且非天然的非天然的d构型氨基酸所组成的多肽可提高稳定性。
本发明的一些实施方式还提供了一种成胶因子的制备方法，其包括：通过固相合成方法合成nap-phe-phe-glu(otbu)-tyr(tbu)-oh肽段，再脱除酪氨酸侧链和谷氨酸侧链上的tbu保护基；其中，nap为萘基，phe为苯丙氨酸，glu为谷氨酸，tyr为酪氨酸。
根据一些实施方式，参见附图1，固相合成固相合成方法合成nap-phe-phe-glu(otbu)-tyr(tbu)-oh肽段包括：
将2-氯三苯甲基氯树脂在n,n-二甲基甲酰胺内溶胀后，加入第一个氨基酸酪氨酸和n，n-二异丙基乙胺进行第一次反应；
加入含有哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶胀，再加入活化的第二个氨基酸谷氨酸和n，n-二异丙基乙胺进行第二次反应；
再次加入含有哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶胀，然后加入活化的第三个氨基酸苯丙氨酸和n，n-二异丙基乙胺进行第三次反应；
再加入含有哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶胀，加入活化的第四个氨基酸苯丙氨酸和n，n-二异丙基乙胺进行第四次反应；
再加入含有哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶胀，加入活化后的萘乙酸和n，n-二异丙基乙胺进行第五次反应；
用含三氟乙酸的二氯甲烷从2-氯三苯甲基氯树脂上切下合成的nap-phe-phe-glu(otbu)-tyr(tbu)-oh肽段，l构型和d构型分别形成成胶因子1和成胶因子2。
根据一些实施方式，上述第一个氨基酸、第二个氨基酸、第三个氨基酸、第四个氨基酸以及萘乙酸均用hobt和hbtu进行活化以及基团保护。hobt的中文名称为1-羟基苯并三唑(hobt)，≥99％(hplc)，基于将单个n-α保护氨基酸反复加到生长的氨基成份上，合成一步步地进行，通常从合成链的c端氨基酸开始，接着的单个氨基酸的连接通过用dcc，混合炭酐，或n-carboxy酐方法实现。carbodiimide方法包括用dcc做连接剂连接n-和c-保护氨基酸。重要的是这种连接试剂促接n保护氨基酸自己炭基和c保护氨基酸自由氨基间的缩水，形成肽链，同时产出n，n/font>-dyaylcohercylurea副产物。然而，此方法因其导致消旋的副反应，或在强碱存在时形成5(4h)-oxaylones和n-acylurea而受到影响。通过加入hobt这样的连接催化剂，能够用于合成n保护氨基酸的活性酯衍生物，依次产生的活性酯将自发与任何别的c保护氨基酸或肽反应形成新的肽。hbtu的中文名为o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu),≥99.5％(hplc)，使用其的目的是由于酸和胺的缩合中hbtu缩合剂反应机理：直接用酸活性太低，把酸跟缩合剂如hbtu和二乙基氰基磷酸酯先反应生成一个大的取代基(活化步骤)，然后很容易就被氨基取代。因此，采用hobt和hbtu进行活化以及基团保护的缩合剂能够很好地进行固相合成中的多肽合成。
根据一些实施方式，含有哌啶的n,n-二甲基甲酰胺中的哌啶的体积浓度均为15～25％；一些实施方式中，每次溶胀的时间均为4～8分钟；一些实施方式中，第一次反应、第二次反应、第三次反应、第四次反应以及第五次反应的反应时间均为2～3小时；一些实施方式中，含三氟乙酸的二氯甲烷中的三氟乙酸的体积浓度为0.8～1.2％。通过选择上述合适的溶胀时间、反应时间以及体积浓度可以使得固相合成反应的效果达到最佳，且能够节约成本。
根据一些实施方式，脱除tbu保护基是通过含有体积浓度为94～96％的三氟乙酸的脱除液进行脱除；优选地，脱除液包括：94～96％的三氟乙酸、2～4％的三异丙基硅基以及1.5～2.5％的二氯甲烷，例如，脱除液脱除液包括95％的三氟乙酸、3％的三异丙基硅基以及2％的二氯甲烷。
根据一些实施方式，其制备方法还包括在脱除tbu保护基后进行纯化，优选地，使用旋转蒸发仪除去溶剂后利用制备型高效液相色谱纯化。通过制备型高效液相色谱即制备型hplc进行纯化，可以很好地纯化最终产物，使得其形成的成胶因子的性能更好。
根据一些实施方式，固相合成固相合成方法合成成胶因子nap-phe-phe-glu-tyr-oh包括：将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在4～6毫升n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4～8分钟后，加入2毫摩尔第一个氨基酸酪氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺，反应2～3小时后，用100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4～8分钟，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸谷氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2～3小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4～8分钟，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2～3小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4～8分钟，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2～3小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4～8分钟，再加入活化后的1.6毫摩尔萘乙酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2～3小时，最后用含体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷从该树脂上切下上述合成的肽段，通过旋转蒸发仪除去溶剂后利用制备型hplc纯化，即可得到成胶因子。
需要说明的是，成胶因子还可以通过其他常规的固相合成的参数和反应物质的选择获得本发明实施方式中公开的成胶因子。
本发明的一些实施方式还涉及一种水凝胶，其包括他克莫司，他克莫司的表面包覆有上述任一实施方式的成胶因子形成的凝胶层。
本发明的一些实施方式还涉及一种水凝胶的制备方法，其包括：通过上述任意实施方式的成胶因子的制备方法制备得到成胶因子；利用所述成胶因子对他克莫司进行包覆。
根据一些实施方式，其主要包括：将成胶因子、他克莫司以及磷酸盐缓冲溶液的混合液进行加热后冷却。
根据一些实施方式，将混合液加热至45～55℃后，再冷却至室温。通过加热到45～55℃的温度范围内，可以使得成胶因子分子之间的π-π堆积作用进行成胶，并且在冷却后凝固，形成稳定的结构。
根据一些实施方式，混合液是在含有5～15μg/ml他克莫司的0.1～0.3m的磷酸盐缓冲溶液中溶解0.5～2wt％的成胶因子。通过上述成分配比以及缓冲溶液的浓度选择，使得其能够更好地形成结构稳定的水凝胶。
根据一些实施方式提供的水凝胶的制备方法，其包括在含有5～15μg/ml他克莫司的0.1～0.3m的磷酸盐缓冲溶液中溶解0.5～2wt％的成胶因子，将形成的混合液加入至45～55℃后，再冷却至室温。
本发明实施方式合成的一种成胶因子nap-phe-phe-glu-tyr-oh，这种成胶因子不仅可以和不同浓度的他克莫司共组装形成一种超分子水凝胶，同时ptk也可以诱导gel解组装变成溶液sol，并且释放他克莫司。涂在创口处的超分子水凝胶将有效的转变为亲水性的磷酸盐，导致水凝胶的解组装，水凝胶转变为溶液，同时释放他克莫司，从而降低移植排斥反应，并能降低他克莫司的副作用，该水凝胶智能免疫响应释放的过程如图2所示，其化学式和作用机理如图3所示。
本发明还涉及一种药物组合物，其包括上述任意一种实施方式得到的水凝胶。该含有他克莫司的水凝胶可以和其他药物进行共同治疗。
本发明的一些实施方式还涉及上述任一实施方式的成胶因子或水凝胶在制备治疗器官移植排斥反应的药物中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在5毫升n,n-二甲基甲酰胺内溶胀6分钟后，加入2毫摩尔第一个氨基酸酪氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺，反应2.5小时后，用100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀6分钟，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸谷氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2.5小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀6分钟，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2.5小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀6分钟，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2.5小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀6分钟，再加入活化后的1.6毫摩尔萘乙酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2.5小时，最后用含体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷从该树脂上切下上述合成的肽段，通过旋转蒸发仪除去溶剂后利用制备型hplc纯化，得到成胶因子。其中，对应氨基酸选用l构型，得到的成胶因子为nap-l-phe-l-phe-glu-tyr-oh，即成胶因子1。
将成胶因子2在含有10μg/ml他克莫司的0.2m的磷酸盐缓冲溶液中溶解1wt％的成胶因子，将形成的混合液加入至50℃后，再冷却至室温，形成水凝胶2。
实施例2
将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在5毫升n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4～8分钟后，加入2毫摩尔第一个氨基酸酪氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺，反应2.5小时后，用100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀6分钟，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸谷氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2.5小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀6分钟，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2.5小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀6分钟，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2.5小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀6分钟，再加入活化后的1.6毫摩尔萘乙酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2.5小时，最后用含体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷从该树脂上切下上述合成的肽段，通过旋转蒸发仪除去溶剂后利用制备型hplc纯化，得到成胶因子。其中，对应氨基酸选用l构型，得到的成胶因子为nap-d-phe-d-phe-glu-tyr-oh，即成胶因子2。
将成胶因子2在含有10μg/ml他克莫司的0.2m的磷酸盐缓冲溶液中溶解1wt％的成胶因子，将形成的混合液加入至50℃后，再冷却至室温，形成水凝胶2。
实施例3
将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在6毫升n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4～8分钟后，加入2毫摩尔第一个氨基酸酪氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺，反应3小时后，用100微升含有22％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀8分钟，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸谷氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应3小时，再加入100微升含有22％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀8分钟，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应3小时，再加入100微升含有22％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀8分钟，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应3小时，再加入100微升含有22％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀8分钟，再加入活化后的1.6毫摩尔萘乙酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应3小时，最后用含体积浓度为2％的三氟乙酸的二氯甲烷从该树脂上切下上述合成的肽段，通过旋转蒸发仪除去溶剂后利用制备型hplc纯化，得到成胶因子。其中，对应氨基酸选用l构型，得到的成胶因子为nap-l-phe-l-phe-glu-tyr-oh，即成胶因子1。
将成胶因子1在含有15μg/ml他克莫司的0.3m的磷酸盐缓冲溶液中溶解2wt％的成胶因子，将形成的混合液加入至55℃后，再冷却至室温，形成水凝胶1。
实施例4
将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在4毫升n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4分钟后，加入2毫摩尔第一个氨基酸酪氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺，反应2小时后，用100微升含有18％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4分钟，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸谷氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2小时，再加入100微升含有18％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4分钟，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2小时，再加入100微升含有18％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4分钟，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2小时，再加入100微升含有18％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4分钟，再加入活化后的1.6毫摩尔萘乙酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2小时，最后用含体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷从该树脂上切下上述合成的肽段，通过旋转蒸发仪除去溶剂后利用制备型hplc纯化，得到成胶因子。其中，对应氨基酸选用l构型，得到的成胶因子为nap-l-phe-l-phe-glu-tyr-oh，即成胶因子1。
将成胶因子1在含有5μg/ml他克莫司的0.1m的磷酸盐缓冲溶液中溶解0.5wt％的成胶因子，将形成的混合液加入至45℃后，再冷却至室温，形成水凝胶1。
实施例5
将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在6毫升n,n-二甲基甲酰胺内溶胀8分钟后，加入2毫摩尔第一个氨基酸酪氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺，反应3小时后，用100微升含有22％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀8分钟，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸谷氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应3小时，再加入100微升含有22％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀8分钟，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应3小时，再加入100微升含有22％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀8分钟，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应3小时，再加入100微升含有22％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀8分钟，再加入活化后的1.6毫摩尔萘乙酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应3小时，最后用含体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷从该树脂上切下上述合成的肽段，通过旋转蒸发仪除去溶剂后利用制备型hplc纯化，得到成胶因子。其中，对应氨基酸选用l构型，得到的成胶因子为nap-d-phe-d-phe-glu-tyr-oh，即成胶因子2。
将成胶因子2在含有15μg/ml他克莫司的0.3m的磷酸盐缓冲溶液中溶解2wt％的成胶因子，将形成的混合液加入至55℃后，再冷却至室温，形成水凝胶2。
实施例6
将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在4毫升n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4分钟后，加入2毫摩尔第一个氨基酸酪氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺，反应2小时后，用100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4分钟，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸谷氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4分钟，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2～3小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4分钟，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸苯丙氨酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2小时，再加入100微升含有20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺内溶胀4分钟，再加入活化后的1.6毫摩尔萘乙酸和2毫摩尔n，n-二异丙基乙胺反应2小时，最后用含体积浓度为0.5％的三氟乙酸的二氯甲烷从该树脂上切下上述合成的肽段，通过旋转蒸发仪除去溶剂后利用制备型hplc纯化，得到成胶因子。其中，对应氨基酸选用l构型，得到的成胶因子为nap-d-phe-d-phe-glu-tyr-oh，即成胶因子2。
将成胶因子2在含有5μg/ml他克莫司的0.1m的磷酸盐缓冲溶液中溶解0.5wt％的成胶因子，将形成的混合液加入至45℃后，再冷却至室温，形成水凝胶2。
试验例
1、裹药后水凝胶的表征以及他克莫司体外释放研究
裹药后的水凝胶在体外可以与一种ptk(p56lck)孵育，孵育过后观察水凝胶的形状改变以及释放出来的他克莫斯的药物浓度，观察酶的工作浓度以及释放药物的量。可以通过流变测试仪表征超分子水凝胶是否已经转变为了溶液；tem观察纳米纤维是否破坏；高效液相色谱-质谱(hplc-ms)可以用来表征水凝胶是否被p56lck磷酸化，转变为了对应的磷酸盐1p/2p。
通过实施例1和实施例2形成的水凝胶gel1和gel2的光学图片如图4所示。从图4中可以看出，包裹了他克莫司的水凝胶gel1和gel2是透明的，说明他克莫司可以与成胶因子1和成胶因子2共组装形成超分子水凝胶。
细胞培养及细胞实验是传统实验项目，并且南京医科大学分析测试中心拥有完备的细胞实验室，为实现细胞实验提供了基础。从正常血样中提取t细胞，cd3和cd28抗体可以将t细胞活化，使得ptk含量升高。分离出来的t细胞活化后与实施例1和实施例2的包裹了他克莫司的水凝胶gel1和gel2孵育，可以将水凝胶中的成胶因子1和成胶因子2磷酸化，生成对应的磷酸盐1p/2p，水溶性增强，水凝胶将解组装，释放其中包裹的他克莫司，而与未活化的t细胞孵育不能释放他克莫司。其中，hplc-ms可以用于表征包裹了他克莫司的超分子水凝胶与ptk孵育后，水凝胶中的成胶因子1/2是否被ptk磷酸化，转变为了对应的磷酸盐1p/2p；及是否有他克莫司释放出来。流变测试仪可以用于表征，与ptk孵育后，超分子水凝胶是否已经转变为了溶液，力学性质发生了哪些改变。透射电镜tem可以用于观察与pkt孵育后，已形成的超分子水凝胶的纳米结构是否被破坏以及破环后样品的形貌。
对实施例1的l型成胶因子进行上述分析，结果如图5-图7所示，从图5到图7表明l型成胶因子的合成与表征没有问题。如图5所示，ms:c44h45n4o9的计算结果[(m+h)+]:773.3186，观察结果maldi-ms:m/z773.3184。如图6所示，成胶因子1的1hnmr(300mhz,dmso-d6)δ(ppm):12.50(s,2h),9.24(s,1h),8.21(dd,j＝19.9,8.2hz,4h),7.86(d,j＝7.1hz,1h),7.81–7.64(m,2h),7.58(s,1h),7.53–7.37(m,2h),7.32–6.81(m,12h),6.66(d,j＝8.3hz,2h),4.54(d,j＝7.3hz,2h),4.35(s,2h),3.52(dd,j＝31.2,13.9hz,6h),3.09–2.91(m,2h),2.74(dd,j＝21.8,11.4hz,2h),2.26(t,j＝7.9hz,2h)。如图7所示，1的13cnmr(75mhz,dmso-d6)δ(ppm):174.05,172.84,171.15,170.90,170.70,169.75,155.94,137.70,137.59,133.85,132.85,131.66,130.00,130.00,129.22,129.22,129.16,129.16,127.98,127.98,127.86,127.86,127.54,127.39,127.39,127.30,127.30,127.20,126.19,126.10,125.93,125.40,114.98,114.98,53.85,53.69,51.52,42.16,37.46,35.78,29.93,27.80,17.81,12.03。
为了评估所形成的水凝胶的粘弹性，首先使用动态应变扫描来确定水凝胶gel1和水凝胶gel2的动态频率扫描的适当条件。存储的值水凝胶gel1和水凝胶gel2的模量(g′)和损耗模量(g″)表现出0.5至1.5％应变(以g′为主的g″)的弱依赖性，表明样品为水凝胶。在将应变幅度设定为1.0％(在应变幅度的线性响应状态内)之后，使用动态频率扫描来研究水凝胶gel1和水凝胶gel2。图8和图9显示了两种凝胶的g′和g″随着频率从0.1增加到10hz。对于两种水凝胶，它们的g′值显着高于g″，表明它们对外力相当容忍。同时，水凝胶gel1的g′和g″值分别比水凝胶gel2的高100倍，这表明水凝胶gel1的弹性比水凝胶gel2强得多。这可能归因于d-phe的负面影响成胶因子2的包装行为以形成水凝胶gel2中的纳米纤维。通过透射电子显微镜(tem)观察以水凝胶gel1和水凝胶gel2中纳米纤维的形态。如图10所示，透射电子显微镜(tem)下的水凝胶gel1的显微结构显示纳米纤维的平均宽度为7.39±0.33nm，而如图11所示，tem下水凝胶gel2的图像显示平均宽度为7.18±0.24nm的纳米纤维。
裹药后超分子水凝胶在体外可以与不同浓度的ptk(p56lck，ptk的一种)孵育，来探寻最佳的他克莫司包裹浓度及酶量，为后续研究提供基础。孵育过后的水凝胶中的成胶因子将被p56lck磷酸化，转变为了对应的磷酸盐1p，水溶性增强，水凝胶转变为溶液，释放包裹的他克莫司。通过对水凝胶gel1进行研究，得到如图12和图13所示的裹药后超分子水凝胶gel1和gel2的药物释放图、如图14和图15所示的裹药后超分子水凝胶gel1和gel1分别与酶孵育解胶透射电镜图以及如图16和图17所示的裹药后超分子水凝胶gel1和gel2与酶孵育解胶流变测试图。通过裹药后超分子水凝胶与ptk(p56lck)孵育6小时的hplc-ms分析，如图12和图13中hplc-ms结果表明，裹药后超分子水凝胶与ptk孵育，可以检测到成胶因子将磷酸化转变为对应的磷酸盐。如图14和图15中tem结果表明，裹药后超分子水凝胶与ptk孵育后，水凝胶的纳米纤维结构解组装，变成了不规则的结构。图16和图17中裹药后超分子水凝胶与ptk孵育后的样品的储能模量(g′，黑色)和损耗模量(g″)的动态频率扫描。流变测试在37℃应变幅度设置为1.0％下进行。流变测试仪结果表明，裹药后超分子水凝胶与ptk孵育后，水凝胶解胶，变成了溶液。
2.包裹了他克莫司(1mg/μl)的l型成胶因子形成的超分子水凝胶对活化t细胞的作用
从正常血样中提取t细胞，cd3和cd28抗体可以将t细胞活化，使得ptk含量升高。分离出来的t细胞活化后与包裹了他克莫司的l型水凝胶孵育，可以将水凝胶中的成胶因子磷酸化，生成对应的磷酸盐，水溶性增强，水凝胶将解组装，释放其中包裹的他克莫司。而与未活化的t细胞孵育不能释放他克莫司。实验分为两组，一组为未活化的t细胞，一组为为活化后的t细胞；加药为未裹药的水凝胶、l型水凝胶1mg/μl裹药组以及琼脂糖1mg/μl裹药组；通过流式细胞仪检测t活化细胞的数目，来反应药物是否对活化t细胞是否有抑制作用。通过hplc-ms测定药物浓度、成胶因子浓度。通过实验后得到如图18所示的裹药后超分子水凝胶与非活化或活化的t细胞孵育的hplc-ms分析图以及如图19所示的不同实验组中的t细胞流式细胞分析图。其中，图19中，左：对照，中：10ng/ml他克莫司，右：包裹了10ng/ml的他克莫司的l型超分子水凝胶。q1代表非活化t细胞，q2代表活化t细胞。
hplc-ms结果表明，裹药后超分子水凝胶与非活化的t细胞孵育，培养基中只能检测到溶解到培养基中的成胶因子；而与活化的t细胞孵育，培养基中可以检测到成胶因子磷酸化后对应的磷酸盐p和释放出来的他克莫司。初步实验结果表明，活化的t细胞可以使包裹了他克莫司的水凝胶裹药后超分子水凝胶释放出他克莫司，实现免疫响应释放药物。
流式细胞实验结果表明，他克莫司可以很好的抑制t细胞的活化(相比于对照组中71.9％的活化t细胞，这一组活化t细胞的比例降到了5.81％)；然而包裹了他克莫司的水凝胶对t细胞的活化有更好的抑制作用，这一组活化t细胞的比例降到了1.45％。
3.不同裹药浓度、给药方式对动物移植排斥反应的作用
肝移植后，通常采用两种给药方式：给药方式一、术后切口表面一次性给药；给药方式二、术后切口表面一次性给药+术后每15天皮下注射给药；将包裹不同浓度他克莫司的水凝胶应用肝脏移植大鼠模型；动物实验分为l型实验组、d型实验组、琼脂糖组、对照组；通过观察大鼠的血药浓度和存活率来评价水凝胶裹药对肝脏移植的作用。
本实验选取4-6周龄雌性lewis老鼠、雄性brownnorway(bn)老鼠，每组实验30只，符合统计学要求。建立大鼠肝移植组，这个模型主要根据kamda报道的二袖套技术，使用雌性lewis老鼠作为捐助者，雄性brownnorway(bn)老鼠作为受助者建立；根据kamda报道的二袖套技术，设立假手术组。所有的动物程序都根据“护理和使用指南”南京医科大学实验动物实验室(njmu，中国)，并获得njmu动物护理和使用委员会的批准。
肝移植后，接受口服给予他克莫司治疗的接受者(剂量为0.05mg/kg，每12小时强制给药7天，共0.7mg/kg)，将接枝表面涂有0.7用含mg/kg他克莫司的琼脂糖凝胶作为阳性对照，使用含0.7mg/kg他克莫司的水凝胶gel1或水凝胶gel2涂抹移植物表面的受体作为实验组。对每组进行12名接受者的评估，值得注意的是，对于涂有琼脂糖凝胶，水凝胶gel1或水凝胶gel2的受体组，不需要进一步灌服他克莫司。在手术过程之后，收集所受体大鼠的外周静脉血样以检测他克莫司的药物浓度，实验结果如图20和图21所示，图20和图21分别为用水凝胶gel1、水凝胶gel2、他克莫司包封的琼脂糖处理的移植小鼠的外周静脉血中的时间依赖性药物浓度曲线和用水凝胶gel1、水凝胶gel2、他克莫司包封的琼脂糖处理的移植小鼠的相应存活数。
从图20中可以看出，在他克莫司组中，在肝移植后的前10小时期间观察到可能引起接受者的服务器副作用的高血药浓度(高达16ng/ml)。相反，在水凝胶gel1和水凝胶gel2组中，迅速实现了他克莫司向接受者血液中的稳定释放(最高血药浓度为9.2ng/ml)。hplc-ms追踪显示血液样品中他克莫司的出现伴随有1p/2p的出现，这表明他克莫司从水凝胶gel1/水凝胶gel2的释放是由活化的ptk在移植物表面的t细胞上诱导。至于含他克莫司的琼脂糖凝胶组，在6小时达到16.7ng/ml的峰值浓度后，他克莫司浓度随着时间的推移持续下降，表明释放来自琼脂糖凝胶的他克莫司是快速但不具有免疫响应性的。从图20中还可以看出，第3天起，水凝胶gel2组的平均血液他克莫司浓度高于水凝胶gel1组，这表明水凝胶gel2的d-构象比水凝胶gel1的l-构象具备更高的可生物降解性。从图21中显示的受者的生存率数据，七天存活数据表明，水凝胶gel2组和他克莫司组的受者具有最高的存活率和相同的存活趋势。注意，尽管他克莫司组的受者在手术后第7天与水凝胶gel2组接受者具有相同的存活率，但他们更可能具有潜在的长期副作用，因为他们在开始时血液他克莫司浓度更高手术后10小时。与上述血液药物浓度数据一致(即水凝胶gel1组的血液他克莫司浓度从第3天开始低于水凝胶gel2组)，在第5天和之后，水凝胶gel1组受体的存活率开始低于水凝胶gel2组。琼脂糖凝胶组中的接受者在7天的观察期间具有最低的存活率。
因此，这些体内数据表明，在肝移植后在移植物表面涂抹水凝胶gel1或水凝胶gel2是一种简便且可行的免疫反应释放他克莫司以克服器官移植排斥的方法。对于水凝胶gel2，不仅显示出与临床方法相同的治疗效果(即，在7天内口服他克莫司14次)，而且使他克莫司对受体的副作用最小化。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。