一种基于猪非典型瘟病毒E2基因的荧光定量RT‑PCR检测试剂盒的制作方法

本发明涉及病毒检测领域，具体地，涉及一种基于猪非典型瘟病毒e2基因的荧光定量rt-pcr检测试剂盒。
背景技术：
：新生仔猪先天性震颤的发生特点是仔猪在出生后发生全身性肌肉阵挛、吮乳困难而导致死亡。赵文远研究小组于1960年在国内首次发现该病以来，我国兽医学界进行了大量的探索性研究，但一直无法找到发病的原因。1980年，杜念兴研究小组通过一系列试验基本上确定该病是病毒导致的传染病，但缺乏直接的证据。2015年，hause研究小组证实了猪非典型瘟病毒（atypicalporcinepestivirus,appv）可能是仔猪先天性震颤的病原。随后，德国、荷兰、奥地利等多个国家先后发现猪群存在appv流行。华南农业大学宁章勇课题组首次发现了我国猪群appv感染的发生，并分离了appvgd1和gd2毒株。appv为黄病毒科、瘟病毒属成员，该病毒属还包括牛病毒性腹泻病毒1型和2型（bvdv-1和bvdv-2）、猪瘟病毒（csfv）和边界病病毒（bdv）及之后发现的其它的瘟病毒（hobi-likepestivirus）。目前对于猪非典型瘟尚无疫苗可以应用，检测猪非典型瘟病毒appv对于提高对猪非典型瘟的防控能力是非常重要的。目前实验室病原学检测方法主要是病毒分离，检测速度尚不能满足要求，而且操作比较复杂。已有检测试剂盒（cn106801109a）灵敏度不高；单纯以国外的毒株为模板进行设计，采用简并引物；仅通过核酸电泳来判断检测结果，无法进行定量分析。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一对检测猪非典型瘟病毒的特异性荧光定量rt-pcr检测引物。本发明的另一个目的是提供一种基于猪非典型瘟病毒e2基因的荧光定量rt-pcr检测试剂盒。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：一对检测猪非典型瘟病毒的特异性荧光定量rt-pcr检测引物，包括pcr上游引物和pcr下游引物，引物的核苷酸序列如seqidno：1～2所示。与公开号为cn106801109a的检测试剂盒相比，本发明的试剂盒的区别点和优势为：(1)引物针对的基因靶标不同：本发明是基于appve2（核苷酸序列：2144-2866）基因进行引物的设计，而公开号为cn106801109a的检测试剂盒是基于appvns3基因设计的引物。(2)引物设计的可检测范围不同：本发明设计的引物可以针对国内外appv毒株进行检测，因为设计的引物同时考虑到了国外现有的毒株和国内的毒株。而公开号为cn106801109a的检测试剂盒单纯以国外的毒株为模板进行设计，所以其引物必须设计成简并引物，含有未知核苷酸y（y代表c或者t）。(3)两对引物扩增产物长度不同：本发明的引物扩增appv的e2基因的序列长度为141bp，公开号为cn106801109a的检测试剂盒引物扩增ns3基因的序列长度为440bp。（4）两个试剂盒设计的鉴定方法不同：本发明是通过荧光定量pcr，读取ct值进行鉴定；而公开号为cn106801109a的检测试剂盒必须进行核酸电泳来判断。(5)两者的灵敏度不同：本发明可以检测到最低为10拷贝/ul的病毒rna，大约折合0.08ng/ul而公开号为cn106801109a的检测试剂盒为0.122ng/ul，本发明检测的灵敏度高于公开号为cn106801109a的检测试剂盒。(6)对样品数据的分析不同：本发明建立的荧光定量rt-pcr方法获得的数据可以对结果进行定量分析，可以鉴别出不同阳性样品中的病毒滴度的高低，而公开号为cn106801109a的检测试剂盒只是进行一个阳性和阴性的定性判断，不同的阳性样品不能进行毒株含量的高低比较。seqidno：1～2所示所述的检测猪非典型瘟病毒的特异性荧光定量rt-pcr检测引物在制备猪非典型瘟病毒的检测试剂盒中的应用。一种基于猪非典型瘟病毒e2基因的荧光定量rt-pcr检测试剂盒，含有seqidno：1～2所示的检测引物。所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂，荧光定量pcr所需试剂，depc处理水，阳性对照和阴性对照。所述阳性对照为含有appve2基因片段的t载体克隆，阴性对照为depc处理水。优选地，所述反转录反应所需试剂为5×primescriptrtmastermix，荧光定量pcr所需试剂为：sybrpremixextaqii。优选地，所述试剂盒检测病毒的10μl反转录反应的体系为：5×primescriptrtmastermix2μl，总rna﹤500ng，用depc处理水补齐到10μl。优选地，所述试剂盒检测病毒的20μl的荧光定量pcr反应检测体系为：sybrpremixextaqii10ul，pcr上游引物0.8μl，pcr下游引物0.8μl，dna模板﹤100ng，用depc处理水补齐到20μl。优选地，所述试剂盒的反转录反应的条件为：37℃反应15min，85℃反应5sec。优选地，所述试剂盒的荧光定量pcr反应条件为：预变性：95℃反应30sec；pcr：95℃反应5sec，60℃反应30sec，40个循环；溶解：95℃反应5sec，60℃反应1min。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明具有快速高效、操作简便、高灵敏度、高特异性、鉴定简单、适用现场检测等有益效果，表现在：（1）快速高效：整个扩增只需60～90min即可完成，扩增产量达108～109个拷贝；（2）操作简便：只需进行常规的rna提取，反转录，然后进行荧光定量rt-pcr即可。同时适用于大批量标本的检测，易于大范围推广应用；（3）高特异性：本发明根据猪非典型瘟病毒appv的e2基因的保守结构域进行引物的设计，经过筛选，此对引物特异性高，非常稳定，不易于形成引物二聚体，保证了反应的顺利进行。（4）高灵敏度：引物能最低检测到10拷贝/ul（相当于0.08ng/ul）的病毒rna灵敏。（5）鉴定简便：只需进行常规的荧光定量rt-pcr操作即可，然后对数据进行分析。（6）应用范围广：适用于国内外appv毒株。附图说明图1为引物测试结果；其中a图为扩增曲线，可以看出呈现标准s型扩增；b图为溶解曲线，呈现单峰状态；c图为扩增结果电泳图，显示条带单一，特异性良好。图2为实施例中引物特异性实验结果图，其中，1：appv病毒样品；2：猪瘟病毒（c株）；3：猪蓝耳病病毒（r98株）；4：伪狂犬病病毒（bartha-k61株）。图3为实施例中引物灵敏度实验的检测结果图，其中a：1×108拷贝/μl；b：1×107拷贝/μl；c：1×106拷贝/μl；d：1×105拷贝/μl；e：1×104拷贝/μl；f：1×103拷贝/μl；g：1×102拷贝/μl；h：1×101拷贝/μl。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1一对检测猪非典型瘟病毒的荧光定量rt-pcr引物的设计：以猪非典型瘟病毒的e2基因（appvgd3的genbank登录号为ky612413，而e2基因核苷酸位置为：2144-2866bp）为靶基因，利用设计软件primerpremier5和oligo7进行引物的设计。本实施例利用以上软件设计出其中的三对备选引物进行筛选，备选引物如下：第一对：f:5’-gcagccgataagacagag-3’（seqidno：1）；r:5’-gatagccatacaccttccct-3’（seqidno：2）；第二对：f1:5’-atgccacagaagacaagacta-3’（seqidno：3）；r1:5’-tttctgatagggtctcattcg-3’（seqidno：4）；第三对：f2:5’-tggcaagtggactgtgataac-3’（seqidno：5）；r2:5’-tagtattgctcttcaaggacg-3’（seqidno：6）；通过筛选，发现第二对引物（f1，r1）和第三对引物（f2，r2）的特异性效果欠佳，而且容易出现引物二聚体以及发夹结构。而第一对引物（f，r）的特异性良好，不出现引物二聚体及发夹结构。所以最终选择最佳的第一对引物（f，r）作为检测引物。实施例2一种基于猪非典型瘟病毒e2基因的荧光定量rt-pcr检测试剂盒，包括实施例1的荧光定量rt-pcr引物组合、rt-pcr反转录反应所需混合物5×primescriptrtmastermix、荧光定量pcr反应所需混合液sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)（2×conc.）、depc处理水、阳性对照和阴性对照。其中，所述阳性对照为含有appve2基因片段的t载体克隆，其具体构建方法如下：以合成的e2基因片段为模板，利用上述引物对e2基因进行扩增，得到扩增产物p，扩增产物p长度为141bp（核苷酸序列如seqidno：7所示），回收该扩增片段，利用常规方法连接到t载体中，即为含有e2基因的标准质粒。利用本发明的试剂盒检测猪非典型瘟病毒的方法，包括如下步骤：（1）待检样品rna的提取：采用病毒rna提取试剂盒提取样品rna；所用的猪非典型瘟病毒为gd3株，分离地点是广东，宿主是猪，通过小脑组织研磨液分离得到。（2）rna的反转录：10μl的定量rt-pcr反转录体系的配置为：5×primescriptrtmastermix2μl，总rna﹤500ng，用depc处理水补齐到10μl。然后置37℃反应15min，85℃5sec，4℃保存或者直接进行下一步的荧光定量rt-pcr反应。（3）荧光定量rt-pcr扩增反应：扩增反应20μl反应体系含有：sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)（2×conc.）10μl，pcr上游引物0.8μl，pcr下游引物0.8μl，dna模板﹤100ng，用灭菌蒸馏水补齐到20μl。然后预变性：95℃反应30sec；pcr：95℃5sec，60℃30sec，40个循环；溶解：95℃反应5sec，60℃1min。（4）结果判断：通过实时荧光定量pcr仪进行结果的读取，判断s型扩增曲线、单峰的溶解曲线和ct值，在扩增曲线和溶解曲线都正常的情况下，若ct值＜35时，则可记为阳性，若ct值＞35时，记为阴性。实施例3实施例2所述检测猪非典型瘟病毒的荧光定量rt-pcr检测试剂盒的特异性评价。1、特异性评价，用实施例2构建的试剂盒按以下方法对待检样品进行检测：（1）待检样品rna提取：采用病毒rna提取试剂盒提取纯化待测样品rna；所述待测样品分别为猪非典型瘟病毒（gd3株）、猪瘟病毒（c株）、猪蓝耳病病毒（r98株）和伪狂犬病病毒（bartha-k61株），后述病毒均由山东农业大学刘思当教授惠赠。（2）rna反转录：10μl的定量rt-pcr反转录体系的配置为：5×primescriptrtmastermix2μl，总rna﹤500ng，用depc处理水补齐到10μl。然后置37℃反应15min，85℃5sec，4℃保存或者直接进行下一步的荧光定量rt-pcr反应。（3）荧光定量rt-pcr的扩增反应：20μl反应体系含有：sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)（2×conc.）10μl，pcr上游引物0.8μl，pcr下游引物0.8μl，dna模板﹤100ng，用灭菌蒸馏水补齐到20μl。然后预变性：95℃反应30sec；pcr：95℃5sec，60℃30sec，40个循环；溶解：95℃反应5sec，60℃1min。（4）结果判断：反应完成后进行数据的读取，如果出现扩增曲线，而且ct值＜35时，则可记为阳性；无扩增曲线或者ct值＞35时，记为阴性。图3结果显示建立的猪非典型瘟病毒荧光定量rt-pcr检测方法能特异地检测到appv病毒，而不与猪的其他常规病毒发生交叉反应。2、灵敏度评价：将已纯化的猪非典型瘟病毒rna作10倍梯度稀释，取101~108拷贝/μlappv病毒用实施例3的操作方法分别对稀释后的appvrna进行检测。鉴定结果显示：在101～108拷贝/μlappv病毒rna都可以发生扩增（图3）。经测定，本发明的引物能检测到最低10拷贝/μl的appv病毒rna。3、重复性评价：将已纯化的猪非典型瘟病毒rna作10倍梯度稀释，取1×102、1×104和1×107拷贝/μlappv病毒用实施例2的操作方法分别对稀释后的appvrna进行检测。使用ct值计算平均值、标准差（sd）和变异系数（cv）。变异系数分别为0.23%、1.13%和0.61%，均低于2.5%，表明该方法具有高度稳定性和可重复性（表1）。表1荧光定量rt-pcr的重复性实施例4本发明猪非典型瘟病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒临床标本实际应用评价：使用本发明荧光定量rt-pcr检测试剂盒与常规的pcr电泳跑胶检测方法分别检测53份临床标本。检测结果见表2。结果显示，本发明试剂盒标本检测阳性率为7.5%（4/53），常规pcr方法的阳性率为3.8%（2/53），经统计学计算两种方法阳性率存在显著性差异，说明本发明试剂盒对于临床标本检测能力优于常规pcr检测方法（表2）。表2本试剂盒与常规pcr鉴定方法对临床标本检测的比较方法阳性结果阴性结果阳性率常规pcr2513.8%荧光定量rt-pcr4497.5%sequencelisting<110>华南农业大学<120>一种基于猪非典型瘟病毒e2基因的荧光定量rt-pcr检测试剂盒<130><160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>dna<213>上游引物f<400>1gcagccgataagacagag18<210>2<211>20<212>dna<213>下游引物r<400>2gatagccatacaccttccct20<210>3<211>21<212>dna<213>上游引物f1<400>3atgccacagaagacaagacta21<210>4<211>21<212>dna<213>下游引物r1<400>4tttctgatagggtctcattcg21<210>5<211>21<212>dna<213>上游引物f2<400>5tggcaagtggactgtgataac21<210>6<211>21<212>dna<213>下游引物r2<400>6tagtattgctcttcaaggacg21<210>7<211>141<212>dna<213>扩增产物p<400>7gcagccgataagacagagggggtgcgggcaaactgtaccctattggcctggtgacaacgt60ccttgaagagcaatactacagcacaggttactgggtgaatgcaacaggtggttgccagtt120aagggaaggtgtatggctatc141当前第1页12