检测甜菜雄蕊育性的SSR分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子标记技术领域，涉及一种检测甜菜雄蕊育性的ssr分子标记及其应用。

背景技术：

甜菜(betavulgaris)具有风媒与虫媒双重授粉途径，非常容易发生杂交，因此，鉴定雄蕊的育性，获得雄性不育种质，对甜菜的杂交育种非常重要，以雄性不育系为母本进行杂交，可保证杂交结果的准确性，同时节约劳动量、提高成功率。然而，甜菜雄性不育系及相应的保持系的获取费时费力且种质资源缺乏。我国的雄性不育材料主要来源于5个途径：国外引进、自然突变的雄性不育植株、杂种后代分离、化学诱变及物理诱变。

随着雄性不育种质的获取，雄性不育的遗传机理也在研究中。雄性不育按形成原因分为2种类型：细胞核型雄性不育与质核互作型雄性不育(也称细胞质型雄性不育)。在应用中，质核互作型雄性不育通过与保持系配套，理论上更易于操作。而对甜菜而言，不育系与保持系的种质仍比较缺乏，而且目前鉴定雄蕊育性的方法仍然以经典的形态学观察为主，难度大，效率低，且受到植株生长阶段的限制，甜菜大都是二年生的生长习性，育性鉴定工作量大、周期长。

owen和bliss相继提出了甜菜质核互作型雄性不育的遗传机制假说，认为甜菜的细胞质与细胞核内均有控制育性的等位基因，不同等位基因的存在和互作影响着甜菜雄蕊的育性，并存在着不同程度的影响，使甜菜出现可育、不育、半可育、半不育等不同类型。然而这些控制育性的编码基因至今未被鉴定出来，分子机制尚不明确。

在性状检测周期长、难度大、控制性状的分子机制未知的情况下，分子标记对甜菜育性的研究有着双方面的重要作用：一方面是可以直接作为工具，用于甜菜育性的预测，通过分子标记辅助选择来提高结果准确性并减少工作量；另一方面是作为序列信息和起始材料，通过基因组步移等方法进行育性相关基因的挖掘。

目前甜菜中已开发的与育性相关的分子标记非常少，大部分研究围绕一个等位基因座位rf1展开，且研究侧重于对已有不育系、保持系的遗传机制研究，对育性鉴定的辅助作用非常有限。因此，自主开发育性相关的分子标记，有利于我国甜菜雄性不育种质的开发与利用。

技术实现要素：

本发明是要解决现有缺乏甜菜雄蕊育性相关的分子标记，不易于鉴定甜菜雄蕊育性的问题，提供一种检测甜菜雄蕊育性的ssr分子标记及其应用。

本发明利用高通量测序技术开发了简单序列重复(simplesequencerepeat,ssr)候选标记，利用f2分离群体从中筛选出了与甜菜雄蕊育性相关的ssr分子标记bvre051，获得了标记扩增区域的序列并进行了基因组定位。该分子标记可用于检测甜菜雄性不育个体。

本发明检测甜菜雄蕊育性的ssr分子标记，用于pcr扩增该分子标记的引物对为bvre051-s和bvre051-a，具体序列为：

bvre051-s：5'-tccaactttgggactctaaattaac-3'

bvre051-a：5'-gaaagtgacggcgagaatgt-3'。

上述检测甜菜雄蕊育性的ssr分子标记的应用，它用于鉴定甜菜雄蕊育性。

具体鉴定方法为：

一、从甜菜幼嫩叶片中分离提取总dna，若叶片的获取有困难，也可以用其它部位代替；

二、以步骤一得到的dna为模板，采用引物bvre051-s和bvre051-a进行pcr扩增，

三、将步骤二得到的pcr扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,page)进行分离，根据扩增产物大小判定结果，如果只检测到172bp的条带，则判定为雄蕊不育；如果除了检测到172bp的条带外，还检测到232bp的条带和274bp的条带，则判定为雄蕊可育。

步骤二所述引物bvre051-s为5'-tccaactttgggactctaaattaac-3'，引物bvre051-a为5'-gaaagtgacggcgagaatgt-3'。

进一步的，步骤二所述的pcr扩增反应的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃再延伸5min。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种用于鉴定甜菜雄蕊育性的ssr分子标记，实现了快速、准确的鉴定甜菜雄蕊育性，克服了现有技术的不足，pcr反应体系及反应条件的重复性高，稳定性好，有效的缩短了鉴定时间，鉴定方法准确。

本发明的ssr分子标记检测结果与甜菜雄蕊育性性状表现的一致性达70％，在可育与不育个体中分别达63.33％和76.67％。表明标记与雄蕊育性有连锁关系，可用于雄蕊育性的检测。

将标记扩增区域的序列与甜菜基因组进行比对，对标记进行基因组定位。结果表明本发明分子标记bvre051定位于甜菜基因组中6号染色体的56139357-56139534区域。

该分子标记用于甜菜雄性不育或者保持系的辅助选择和甜菜种质的育性潜力的预测，并辅助甜菜雄性不育机理的研究及甜菜育性相关基因的挖掘。

附图说明

图1为甜菜可育个体的基因分型结果；

图2为甜菜不育个体的基因分型结果。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式检测甜菜雄蕊育性的ssr分子标记，用于pcr扩增该分子标记的引物对为bvre051-s和bvre051-a，具体序列为：

bvre051-s：5'-tccaactttgggactctaaattaac-3'

bvre051-a：5'-gaaagtgacggcgagaatgt-3'。

本实施方式获得了与甜菜雄蕊育性相关的ssr分子标记，单独使用或者与其它引物联合使用，可通过pcr检测对甜菜的雄蕊育性进行预先判断，可在甜菜任何生长时期提取基因组dna作为材料，减少工作量，缩短育性判断的周期。

标记可用于判断种质或个体的育性。用于判断整个种质的育性时，可直接根据pcr结果结合统计学分析进行判断，或对其中重点个体进行性状调查作为补充，而不需要对全部个体进行耗时两年的播种-母根培育-母根栽植-雄蕊育性的性状调查-个体淘汰；用于判断甜菜个体的育性时，也可根据pcr结果在开花散粉之前进行预判，缩小性状调查个体的范围。

标记的定位信息可用于育性基因的挖掘。

具体实施方式二：本实施方式检测甜菜雄蕊育性的ssr分子标记的应用，它用于鉴定甜菜雄蕊育性。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：具体鉴定方法为：

一、从甜菜幼嫩叶片中分离提取总dna；

二、以步骤一得到的dna为模板，采用引物bvre051-s和bvre051-a进行pcr扩增，

三、将步骤二得到的pcr扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据扩增产物大小判定结果，如果只检测到172bp的条带，则判定为雄蕊不育；如果除了检测到172bp的条带外，还检测到232bp的条带和274bp的条带，则判定为雄蕊可育。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：步骤二所述引物bvre051-s为5'-tccaactttgggactctaaattaac-3'，引物bvre051-a为5'-gaaagtgacggcgagaatgt-3'。其它与具体实施方式三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三或四不同的是：步骤二所述的pcr扩增反应的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃再延伸5min。其它与具体实施方式或四相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

通过高通量测序获得了大量甜菜序列，从中挖掘出了未经报道的ssr标记，筛选出质量与多态性良好的候选标记一百余个，同时构建了甜菜雄蕊育性的f2分离群体。

自分离世代中选取可育与不育个体构建混池，用集团混合分离分析(bulkedsegregationanalysis,bsa)的方法对候选标记进行筛选，获得了在混池间表现出多态性的ssr标记8个。并从中选择出了与甜菜雄蕊育性相关的ssr分子标记，命名为bvre051。

对分离世代雄蕊育性进行调查后，分别对可育与不育个体各30株甜菜进行了标记的基因分型，发现以上标记中，

一、分别提取30株甜菜幼嫩叶片的dna；

二、以步骤一得到的dna为模板，采用引物bvre051-s和bvre051-a进行pcr扩增，pcr反应体系如表1所示：

表1

pcr扩增反应的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃再延伸5min。

三、结果的检测方法：将步骤二得到的pcr扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，凝胶交联度8％，电泳时电压100v，时间4～5h。电泳后用10mg/l溴化乙锭(eb)溶液染色15～20min。

可育个体的基因分型结果如图1所示，其中m表示dna50bpmarker，p1表示母本(雄性不育)，p2表示父本(雄性可育)，编号1-30为30个可育个体。不育个体的基因分型结果如图2所示，其中m表示dna50bpmarker，p1表示母本(雄性不育)，p2表示父本(雄性可育)，编号1-30为30个不育个体。

分别对分离世代可育与不育个体进行基因分型，验证标记与育性性状表现的一致性。发现分子标记bvre051在所有个体中，标记检测结果与雄蕊育性性状表现的一致性达70％，在可育与不育个体中分别达63.33％和76.67％。表明标记与雄蕊育性有连锁关系，可用于雄蕊育性的检测。

表2雄蕊育性相关标记对不同育性植株的检测结果

经测序，bvre051扩增序列如下(划线部分为ssr重复单元)：

不育相关条带(172bp)：

gaaagtgacggcgagaatgtcgccggaaagtgcagcggcattcgccggaaaagaggagagagaaagtagaaagcaggagagagagagtgaggagagagagtgtaaaaatgggggagaatttgtatttgtatagttgtaaattaataagttaatttagagtcccaaagttgga

可育相关条带1(232bp)：

gaaagtgacggcgagaatgtcgccggaaagtgcagcggcattcgccggaaaagaggagagagaaagtagaaagcaggagagagagagtgaggagagagagtgtaaaaatgggggagaatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatagttgtaaattaataagttaatttagagtcccaaagttgga

可育相关条带2(274bp)：

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根据扩增产物大小判定结果，如果只检测到172bp的条带，则判定为雄蕊不育；如果除了检测到172bp的条带外，还检测到232bp的条带和274bp的条带，则判定为雄蕊可育。

将扩增产物与植物非冗余核酸数据库进行blastn比对分析，结果表明bvre051的扩增产物与甜菜一个“预测为亮氨酸受体的丝-苏氨酸激酶mrna”相似，序列相似部分为扩增片段的第1-135bp，该部分的序列相似性为100％。

根据序列相似性对标记进行定位，该标记定位于甜菜基因组中6号染色体的56139357-56139534区域。

序列表

<110>黑龙江大学

<120>检测甜菜雄蕊育性的ssr分子标记及其应用

<160>5

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物bvre051-s

<400>1

tccaactttgggactctaaattaac25

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物bvre051-a

<400>2

gaaagtgacggcgagaatgt20

<210>3

<211>172

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>不育相关条带序列

<400>3

gaaagtgacggcgagaatgtcgccggaaagtgcagcggcattcgccggaaaagaggagag60

agaaagtagaaagcaggagagagagagtgaggagagagagtgtaaaaatgggggagaatt120

tgtatttgtatagttgtaaattaataagttaatttagagtcccaaagttgga172

<210>4

<211>232

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>可育相关条带1序列

<400>4

gaaagtgacggcgagaatgtcgccggaaagtgcagcggcattcgccggaaaagaggagag60

agaaagtagaaagcaggagagagagagtgaggagagagagtgtaaaaatgggggagaatt120

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<210>5

<211>274

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>可育相关条带2序列

<400>5

gaaagtgacggcgagaatgtcgccggaaagtgcagcggcattcgccggaaaagaggagag60

agaaagtagaaagcaggagagagagagtgaggagagagagtgtaaaaatgggggagaatt120

tgtatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatttgtatt180

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