本发明属于天然产物化学的技术领域，具体涉及一种从橄榄叶中分离提取高纯度橄榄苦甙和东莨菪素的方法。
背景技术：
油橄榄又称洋橄榄、齐墩果，为木犀科木犀榄属植物，昌世界名贵常绿木本油料和果用树种。油橄榄以叶和果实入药用于治疗多种疾病，橄榄叶的煎剂或浸剂在地中海国家常作为糖尿病的民间用药，有一定的疗效。油橄榄叶提取可用做膳食补充剂以增强免疫功能。现有资料表明油橄榄具有抗心率不齐，抗真菌，抗高胆固醇，降血糖，降血压，抗炎，抗氧化，抗病毒，利尿等多种药理活性。从油橄榄叶中分离得到的化学成分可分为：黄酮类、糖类、萜类、有机酸类及其它化合物。橄榄苦昔的药理作用主要有降血压、抗氧化、抗微生物和抗癌等作用。
橄榄叶中还含有东莨菪素，依赖性地清除二苯代苦味酰肼(dpph)自由基，并能显著减轻溶血性磷脂酰胆碱(lpc)所致的ecv304细胞损伤。东莨菪素可通过抑制转录因子nf～κb的活化，抑制一氧化氮合酶的诱导生成，从而发挥抗炎活性，另外还具有体外降糖的效果。
目前国内有报道用橄榄叶提取加工橄榄叶提取物，但大多采用简单水提或醇提后直接喷雾干燥成分，产品中橄榄苦甙、总酚及黄酮含量低。在2007年《青橄榄叶的化学成分研究》文献中报道了从橄榄叶分离到了东莨菪素。王成章也报道了橄榄苦甙在橄榄叶中比果实和树皮中含量要高得多。
公开号为cn101955503a的中国专利介绍了一种橄榄苦甙的制备方法，取多花素馨花作为原料，采用超临界co2萃取技术进行提取，有机溶剂萃取，大孔树脂吸附分离，浓缩过滤，结晶重结晶得到橄榄苦甙。此方法因为原材料是花部分，对大规模制备橄榄苦甙有一定难度，另外，在目前生产过程中超临界co2萃取技术很少应用，主要是一次投料生产量小，生产设备成本过高，所以这一技术很难应用于生产。
公开号为cn102060893a的中国专利介绍了一种从油橄榄叶中同步制备橄榄苦苷和橄榄总黄酮的工艺方法，虽然采用了大孔吸附树脂串联吸附、梯度解吸附，分离开了大部分的物质，但将解吸液回收有机溶剂后直接喷雾干燥，分别得到较高含量的橄榄苦苷和橄榄总黄酮提取物产品。此方法分离过程太长，造成其有效成分得率过低，另外将解吸液直接喷雾干燥，解吸液中金属离子以盐的形式存在于产品中，其它杂质也会降低其有效成分含量。
技术实现要素：
本发明采用的技术方案包括：干燥过后的油橄榄叶先发酵，再经乙醇提取、过滤、减压浓缩，萃取，然后用树脂吸附、乙醇洗脱、将洗脱液浓缩，结晶与重结晶制得橄榄苦甙和东莨菪素纯品。
本发明采用的微生物菌种为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号分别为cgmccno.1.943；木霉(trichodermasp.)来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号分别为cgmccno.3.3006。
因此，本发明提供一种从橄榄叶提取橄榄苦甙和东莨菪素的方法，步骤包括：
(1)粉碎橄榄叶，加入10～25％枯草芽孢杆菌液和20～35％木霉发酵液，25～35℃保温2～6h，再向其中加入50％乙醇后搅拌混合，加热至50～70℃进行回流提取，其中橄榄叶重量kg与50％乙醇体积l比为1:3～8；
(2)过滤除渣后，在50℃减压浓缩至无乙醇味；
(3)将浓缩液用两倍至四倍体积的氯仿进行萃取，得水层和氯仿层溶液，再将氯仿层溶液进行减压浓缩，直至获得干燥物ⅰ，水层用两倍至四倍体积的乙酸乙酯分三次进行萃取，分离得到三次乙酸乙酯层萃取液，合并其萃取液，并在50℃将其萃取液进行减压浓缩，直至获得干燥物ⅱ；
(4)干燥物ⅰ加入水进行溶解，上硅胶柱进行层析分离，用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱，收集洗脱液ⅰ，其中石油醚与乙酸乙酯体积l比为1∶1，加入水体积l与干燥物ⅰ重量kg比为2～5∶1；
(5)将干燥物ⅱ用乙醇进行溶解，上h-103大孔树脂进行吸附，用40％～65％乙醇进行洗脱，收集洗脱液ⅱ，其中干燥物ⅱ重量kg与乙醇体积l比为1∶0.5～3；
(6)将洗脱液ⅰ进行减压浓缩至原有体积的1/5～1/6，加入两倍至四倍体积的石油醚进行结晶和重结晶，得东莨菪素；
(7)将洗脱液ⅱ进行减压浓缩至原有体积的1/4～1/5，加入两倍至四倍体积的乙酸乙酯进行结晶和重结晶，得橄榄苦甙。
上述枯草芽孢杆菌液可以通过常规枯草芽孢杆菌培养方法发酵获得，10％枯草芽孢杆菌液是指10l枯草芽孢杆菌液加入到100kg橄榄叶中；木霉发酵液可以通过常规木霉菌培养方法发酵获得，30％木霉发酵液是指30l木霉发酵液加入到100kg橄榄叶中。
在一个实施方案中，步骤(1)的回流提取时间为5h～36h。
在一个实施方案中，步骤(2)的过滤过程是纱布过滤、陶瓷膜过滤。其中，优选是三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次。
在一个实施方案中，步骤(6)、(7)中进行结晶和重结晶时结晶温度在低温下进行，优选是在4℃左右。
技术效果：
1、本发明采用混合菌种发酵，使活性物质快速释放，极大提高了产率，大大地降低了生产成本；
2、本发明确定了采用高浓度乙酸乙酯在低温条件下进行结晶，橄榄苦甙的纯度是最高，可达到97.37～98.23％。
3、由于能同时提取出橄榄苦甙和东莨菪素，极大地降低了其生产成本，又节约了橄榄叶资源。
具体实施方式
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
实施例1
称取100kg橄榄叶，普通粉碎机进行粉碎，加入15l枯草芽孢杆菌液和35l木霉发酵液，30℃保温3h，加入400l的50％乙醇进行混合，加热至50℃左右进行回流提取10小时后，采用三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次；进行过滤除渣后，在50℃减压浓缩至无乙醇味，得浓缩液80l；将浓缩液用200l氯仿进行萃取，得水层和氯仿层溶液，再将氯仿层溶液进行减压浓缩，直至获得2.15kg干燥物ⅰ，水层用200l乙酸乙酯分三次进行萃取，分离得到三次乙酸乙酯层萃取液，合并其萃取液，并在50℃将其萃取液进行减压浓缩，直至获得3.26kg干燥物ⅱ；将干燥物ⅰ加入6l水进行溶解，上硅胶柱进行层析分离，用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(体积l比1∶1)进行洗脱，收集30l洗脱液ⅰ。
将干燥物ⅱ用5l乙醇进行溶解，上h-103大孔树脂进行吸附，用55％乙醇进行洗脱，收集40l洗脱液ⅱ；将洗脱液ⅰ进行减压浓缩至5l，加入10l的石油醚在4℃进行结晶和重结晶，得东莨菪素0.36kg；将洗脱液ⅱ进行减压浓缩至8l，加入24l的乙酸乙酯在4℃进行结晶和重结晶，得橄榄苦甙1.17kg。所得重结晶样品进行纯度，其检测仪器为agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，色谱柱为shim～packodsc18柱(4.6×150mm，5μm)，流动相为甲醇，检测波长：254nm；柱温30℃；流速：1.0ml/min；上样量为10μl，检测所得到橄榄苦甙的纯度为98.43％。流动相为乙酸乙酯-甲醇(40:60，v/v)，检测波长：330nm；柱温30℃；流速：1.0ml/min；上样量为10μl，检测所得到东莨菪素的纯度为97.68％。
实施例2
称取200kg橄榄叶，普通粉碎机进行粉碎，加入35l枯草芽孢杆菌液和60l木霉发酵液，35℃保温3h，加入600l的50％乙醇进行混合，加热至50℃左右进行回流提取9小时后，采用三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次；进行过滤除渣后，在50℃减压浓缩至无乙醇味，得浓缩液150l；将浓缩液用350l氯仿进行萃取，得水层和氯仿层溶液，再将氯仿层溶液进行减压浓缩，直至获得4.63kg干燥物ⅰ，水层用350l乙酸乙酯分三次进行萃取，分离得到三次乙酸乙酯层萃取液，合并其萃取液，并在50℃将其萃取液进行减压浓缩，直至获得6.85kg干燥物ⅱ。
将干燥物ⅰ加入10l水进行溶解，上硅胶柱进行层析分离，用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(体积l比1∶1)进行洗脱，收集45l洗脱液ⅰ。将干燥物ⅱ用8l乙醇进行溶解，上h-103大孔树脂进行吸附，用55％乙醇进行洗脱，收集60l洗脱液ⅱ。
将洗脱液ⅰ进行减压浓缩至8l，加入16l的石油醚在4℃进行结晶和重结晶，得东莨菪素0.84kg；将洗脱液ⅱ进行减压浓缩至12l，加入36l的乙酸乙酯在4℃进行结晶和重结晶，得橄榄苦甙2.35kg。按实施例1中检测方法进行检测所得到橄榄苦甙的纯度为98.26％，东莨菪素的纯度为98.25％。
实施例3
称取500kg橄榄叶，普通粉碎机进行粉碎，加入120l％枯草芽孢杆菌液和150l木霉发酵液，25～35℃保温2h，加入2000l的50％乙醇进行混合，加热至50℃左右进行回流提取8小时后，采用三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次；进行过滤除渣后，在50℃减压浓缩至无乙醇味，得浓缩液300l；将浓缩液用800l氯仿进行萃取，得水层和氯仿层溶液，再将氯仿层溶液进行减压浓缩，直至获得12.48kg干燥物ⅰ，水层用800l乙酸乙酯分三次进行萃取，分离得到三次乙酸乙酯层萃取液，合并其萃取液，并在50℃将其萃取液进行减压浓缩，直至获得16.77kg干燥物ⅱ；将干燥物ⅰ加入30l水进行溶解，上硅胶柱进行层析分离，用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(体积l比1∶1)进行洗脱，收集150l洗脱液ⅰ。
将干燥物ⅱ用20l乙醇进行溶解，上h-103大孔树脂进行吸附，用55％乙醇进行洗脱，收集120l洗脱液ⅱ；
将洗脱液ⅰ进行减压浓缩至20l，加入40l的石油醚在4℃进行结晶和重结晶，得东莨菪素1.95kg；将洗脱液ⅱ进行减压浓缩至30l，加入90l的乙酸乙酯在4℃进行结晶和重结晶，得橄榄苦甙5.74kg。按实施例1中检测方法进行检测所得到橄榄苦甙的纯度为98.78％，东莨菪素的纯度为97.83％。