本发明属于化学制药领域，具体涉及一种具有ns3丝氨酸蛋白酶抑制活性的化合物及其应用。
背景技术：
黄病毒属(flaviviridea)是一类具有包膜的单正链rna病毒，包括丙型肝炎病毒(hcv)、登革热病毒(denv)、黄热病毒(yfv)、西尼罗病毒(wnv)、流行性乙型脑炎病毒(jev)和森林脑炎病毒(tbev)，可在世界范围内引起多种流行性感染疾病。在我国主要流行的黄病毒有乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒和登革热病毒。
黄病毒属病毒的基因组具有相似的结构，均由一段非编码区和开放阅读框组成。开放阅读框架编码的多聚蛋白前体由不同的结构蛋白和相似的非结构蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5)组成，非结构蛋白(ns3)在病毒多聚蛋白裂解和病毒基因组的复制中发挥着重要的作用。ns3蛋白由位于n末端区的ns3蛋白酶(serineprotease)，也称丝氨酸蛋白酶区域(ns3p)，以及c末端的解旋酶区域(ns3h)组成。ns3p与ns3h在病毒基因组复制的不同阶段起到了不同的作用，而且可以增强彼此的作用。ns3p丝氨酸蛋白酶由180-200个氨基酸构成，是一种序列相对保守的多功能蛋白酶；当ns3p与位于ns4a的21-34位区域结合时，可形成活性的ns3/ns4a丝氨酸蛋白酶复合物，裂解多聚蛋白间形成的连接。
研究表明，抑制ns3/ns4a丝氨酸蛋白酶的结合活性可以有效的抑制黄病毒属病毒的复制与增殖，因此，ns3丝氨酸蛋白酶成为了抗丙型肝炎病毒药物研发的热点。然而迄今为止，仍无令人满意的能有效抑制ns3丝氨酸蛋白酶活性的化合物被合成出来。
目前已开发的ns3/ns4a丝氨酸蛋白酶抑制剂，可根据其与ns3/ns4a丝氨酸蛋白酶的结合模式分为共价结合与非共价结合两类抑制剂。本发明提供一种新型的非共价结合的ns3/ns4a丝氨酸蛋白酶，并发现该类结构具有良好的活性。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种具有ns3丝氨酸蛋白酶抑制活性的苯并二氢吡喃类化合物，以开发成为一种新型的ns3丝氨酸蛋白酶抑制剂，应用于因丙型肝炎病毒、登革热病毒或西尼罗河病毒等病毒感染引起的相关疾病治疗的领域中。
本发明的具体技术方案如下：
如通式(ⅰ)所示的一种具有ns3丝氨酸蛋白酶抑制活性的化合物，或其药学上可接受的盐、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或其混合物：
其中，
d、e、f和g各自独立地选自ch或n；
x选自氢原子或卤素；
y选自杂原子；
n为0或1；
r1选自r4、-c(o)-r4、-c(s)-r4、-s(o)-r4或-s(o)2-r4；
r2选自氢原子、卤素、硝基、氰基、烯基、炔基、烷基、卤代烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；
r3选自芳基或杂芳基；
r4选自芳基、杂芳基、烯基、炔基、烷基、卤代烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基。
如上所述的化合物，包括其通式如式(ⅱ)或(ⅲ)所示的化合物，或其药学上可接受的盐、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或其混合物：
其中，x为卤素。
优选的：
所述卤素选自f、cl、br或i；
所述杂原子选自氧原子、氮原子或硫原子；
所述烷基、烯基、炔基各自独立地选自含1-16个碳原子组成的直链、支链、单环状、双环状或螺环状的脂肪族烃基团；
所述杂烷基选自包含氮、氧和硫中的一个原子或多个原子组合成的芳烷基或烷基；
所述芳基选自苯环、萘环及其取代衍生物，或者选自饱和环与芳环的衍生环状取代基；
所述杂芳基选自包含氮、氧和硫中的一个原子或多个原子组合成的含5-12个原子的芳环，或者选自饱和环与杂芳环的衍生环状取代基；
所述芳基、杂芳基、烯基、炔基、烷基、杂烷基各自独立地任选被一个或多个选自氢原子、卤素、硝基、氰基、羟基、＝o、＝s、烷基、杂烷基、烯基、炔基、卤代烯基、卤代炔基、卤代烷基、杂烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、环烷基烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基杂烷基、杂环烷基杂烷基、芳基杂烷基、羟基烷基、烷氧基、烷氧烷基、烷氧芳基、烯氧基、炔氧基、环烷氧基、杂环烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、芳烷氧基、羧基、酰基、磺酰基、-c(o)or5、-oc(o)r5、-cor5、-nhs(o)r5、-nhs(o)2r5、-nhc(o)r5、-nhc(o)or5、-sh、-sr5、-nr6r7、-oc(o)nr6r7所取代；
r5、r6、r7各自独立地选自氢原子、芳基、杂芳基、烯基、炔基、烷基、卤代烷基或杂烷基，其中所述芳基、杂芳基、烯基、炔基、烷基、卤代烷基或杂烷基任选被一个或多个选自卤素、烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羟基、羟烷基、烷氧基、酰基所取代；
r6、r7为独立取代，或者连接成环。
更优选的，r1选自-c(o)me、
更优选的，其特征在于，r2选自h、f、cl或br。
更优选的，r3选自
更优选的，x为cl，y为o。
更优选的，上述化合物为以下任意一个化合物：
本发明还提供了一种药物组合物，包括所述的化合物，或其药学上可接受的盐、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或其混合物。
本发明还提供了上述化合物和/或上述药物组合物在制备用于预防、处理、治疗由黄病毒属病毒引起的病毒感染性疾病的药物中的应用。
优选的，所述黄病毒属病毒选自丙型肝炎病毒、登革热病毒、西尼罗病毒中至少一种。
本发明还涉及了如通式(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示化合物的制备、分离和纯化的方法。
前面所述内容只概述了本发明的某些方面，但并不限于这些方面。这些方面及其他方面将在下面做更加具体完整的描述。
本发明将会把确定的具体化的内容所对应的文献详细列出，实施例都伴随有结构式和化学式的图解。本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能像权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所述领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。有很多文献和相似的物质与本发明申请相区别或抵触，其中包括但绝不限于术语的定义，术语的用法，描述的技术，或像本发明申请所控制的范围。
像本发明所描述的，本发明的化合物可以任选地被一个或多个取代基所取代，如上面的通式化合物，或者像实施例里面特殊的例子，子类，和本发明所包含的一类化合物。应了解“任选取代的”这个术语与“取代或非取代的”这个术语可以交换使用。一般而言，术语“任选地”不论是否位于术语“取代的”之前，表示所给结构中的一个或多个氢原子被具体取代基所取代。除非其他方面表明，一个任选的取代基可以有一个取代基在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构式不只一个位置能被为具体基团的一个或多个取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各个位置取代。其中所述的取代基可以是，但并不限于，卤代烷基、羟基、氨基、卤素、氰基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷氨基、烷硫基、烷基、烯基、炔基、杂环基、巯基、硝基、芳氧基、杂芳氧基、氧代(＝o)、硫代(＝s)、羧基、羟基取代的烷氧基、羟基取代的烷基、羰基等等。
本发明使用的术语“脂肪族基团”，表示直链、支链、单环状、双环状或螺环状，取代或非取代的完全饱和或含有一个或多个不饱和度的烃链或烃环。除非另外详细说明，脂肪族基团含有1-16个碳原子，其中一些实施例是，脂肪族基团含有1-10个碳原子，另外一些实施例是，脂肪族基团含有1-8个碳原子，另外一些实施例是，脂肪族基团含有1-6个碳原子，另外一些实施例是，脂肪族基团含有1-4个碳原子，另外一些实施例是，脂肪族基团含有1-3个碳原子。合适的脂肪族基团包括，但不限于，直链、支链、单环状、双环状或螺环状，取代或非取代的烷基、烯基或炔基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、已基、异丁基、仲丁基、乙烯基等。
本发明使用的术语“烷基”包括1-20个碳原子，或1-10个碳原子，或1-6个碳原子，或1-4个碳原子，或1-3个碳原子的单价烃基，其中烷基可以独立任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。烷基更进一步的实例包括，但并不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、正庚基、正辛基等等。术语“烷基”在此处使用，表示从直链、支链或环状的饱和碳链。
本发明使用的术语“环烯基”，或“烯基”表示2-12个碳原子，或2-8个碳原子，或2-6个碳原子，或2-4个碳原子直链或支链的一价烃基，其中至少一个位置为不饱和状态，即一个c-c为sp2双键，其中“烯基”可以独立任选的被一个或多个本发明所描述的取代基所取代，包括基团有“反”“正”或“e”“z”的定位，其中具体的实施例包括，但并不限于，乙烯基(-ch＝ch2)、丙烯基(-ch＝ch2ch3)、烯丙基(-ch2ch＝ch2)等等。
本发明使用的术语“炔基”表示2-12个碳原子，或2-8个碳原子，或2-6个碳原子，或2-4个碳原子直链或支链的一价烃基，其中至少一个位置为不饱和状态，即一个c-c为sp双键，其中炔基基团可以独立任选的被一个或多个本发明所描述的取代基所取代，具体的实施例包括，但并不限于，乙炔基(-ch≡ch2)、炔丙基(-ch2ch≡ch2)等等。
本发明使用的术语“卤代烷基”，或“卤代烯基”，或“卤代炔基”表示脂肪族基团，或烯基，或炔基被一个或多个相同或不同的卤原子所取代，其中烷基、烯基和炔基均具有本发明所述的含义，卤原子即f、cl、br或i，这样的实例包括，但并不限于三氟乙基、三氟甲氧基、2-氯-乙烯基、2-溴炔丙基等等。
本发明使用的术语“烷氧基”，涉及到烷基，像本发明所定义的，通过氧原子(“烷氧基”)连接到主要的碳链上，这样的实例包括，但并不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。并且所述烷氧基可以是取代或非取代的，其中取代基可以是，但并不限于，羟基、氨基、卤素、氰基、烷氧基、烷基、烯基、炔基、巯基、硝基等等。
本发明使用的术语“芳基”可以单独使用或作为“芳烷基”“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”的一大部分，表示共含有6-14元环的单环、双环和三环的碳环体系，其中，至少一个环体系是芳香族的，其中每一个环体系包含3-7元环，且至少一个附着点与分子的其余部分相连。术语“芳基”可以和术语“芳香环”交换使用，如芳香环可以包括苯基、萘基和蒽。并且所述芳基可以是取代或非取代的，其中取代基可以是，但并不限于，卤代烷基、羟基、氨基、卤素、氰基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基、烯基、炔基、杂环基、巯基、硝基、芳氧基、羟基取代的烷氧基、羧基烷氧基等等。
本发明使用的术语“杂芳基”可以单独使用或作为“杂芳基烷基”或“杂芳基烷氧基”的一大部分，表示共含有5-14元环的单环、双环和三环体系，其中，至少一个环体系是芳香族的，且至少一个环体系包含一个或多个杂原子，其中每一个环体系包含3-7元环，且至少一个附着点与分子的其余部分相连。术语“杂芳基”可以和术语“芳杂环”或“杂芳族化合物”交换使用。并且所述杂芳基可以是取代或非取代的，其中取代基可以是，但并不限于，卤代烷基、羟基、氨基、卤素、氰基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基、烯基、炔基、杂环基、巯基、硝基、芳氧基、羟基取代的烷氧基、羧基烷氧基等等。
本发明使用的术语“芳氧基”或“芳烷氧基”，包括任选取代的芳基，如本发明所定义的，连接到氧原子上，并且由氧原子与分子其余部分相连，其中芳基基团具有如本发明所述的含义，这样的实例包括，但并不限于苯氧基、甲苯氧基、乙苯氧基等等。
本发明使用的术语“羧基”，无论是单独使用还是和其他术语连用，如“羧烷基”，表示-co2h；术语“羰基”或“酰基”，无论是单独使用还是和其他术语连用，如“氨基羰基”、“酰胺基”或“酰氧基”，表示-(c＝o)-。
本发明使用的术语“磺酰基”，无论是单独使用还是和其他的术语如“烷基磺酰基”连用，分别表示二价的基团-so2-；术语“烷基磺酰基”是指烷基取代的磺酰基基团，形成烷基磺酰基(-so2ch3)；术语“胺磺酰”、“胺基磺酰基”表示氨基取代的磺酰基基团，形成胺磺酰基(-so2nh2)。
本发明的有益效果是：本发明提供的化合物是一类新型的具有ns3丝氨酸蛋白酶抑制活性的化合物，制备过程操作简单安全；经过抗病毒活性实验测定，表明该类化合物具有良好的ns3丝氨酸蛋白酶抑制活性，具有开发成为一种新型的ns3丝氨酸蛋白酶抑制剂的潜力，可应用于预防、处理和治疗因丙型肝炎病毒、登革热病毒或西尼罗河病毒等黄病毒属病毒感染引起的相关疾病。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。
在下列实施例中，除非另有指明外，所有温度单位为摄氏度。使用的各种起始原料和试剂均来自市售，除非另有指明，市售原料和试剂均不经进一步纯化直接使用；玻璃器皿用烘箱干燥和/或加热干燥。
薄层层析用硅胶板规格为0.15-0.2mm，柱层析用硅胶的规格为200-300目；质谱是用ms仪测定得到，离子化方式可为esi或apci。
一般地，本发明的化合物可以通过本发明所描述的方法制备得到，也通过本领域技术人员的常用技术手段制备得到，除非有进一步的说明，其中取代基的定义如式(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示。下面的反应方案和实施例用于进一步说明本发明的内容。
所属技术领域人员将认识到：本发明所描述的化学反应可以用来合适地制备许多本发明的其他化合物，且用于制备本发明的化合物的其他方法都被认为是在本发明的范围之内。例如，根据本发明那些非例证的化合物的合成可以成功地被所属技术领域人员通过修饰方法完成，如适当的保护干扰基团，通过利用其他已知的试剂除了本发明所描述的，或将反应条件做一些常规的修改。另外，本发明所公开的反应或已知的反应条件也公认地适用于本发明其他化合物的制备。
实施例1
合成路线：
第一步：中间体1c的合成
往250ml的圆底烧瓶中加入化合物1a(3g，0.022mol)、化合物1b(2.36g，0.022mol)、30％(mg/vol)氢氧化钠乙醇溶液50ml，室温搅拌反应8h；反应完毕后，将反应液倒入冰水中，用盐酸将反应液的ph调节至2-3，过滤，收集固体；将固体溶于二氯甲烷中，依次用饱和碳酸钠水溶液、饱和食盐水洗涤，然后加入无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液减压浓缩，再用乙醇进行重结晶，得到3.5g化合物1c。
第二步：中间体1d的合成
往100ml的圆底烧瓶中加入化合物1c(3g，0.013mol)、醋酸30ml，120℃搅拌反应24h后，减压浓缩，得到固体；将固体溶于二氯甲烷中，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，然后加入无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液减压浓缩；进行硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯(1:1)，得到2.1g化合物1d。
第三步：产物ni-h-0461的合成
往100ml的圆底烧瓶中加入化合物1d(200mg，0.89mol)、化合物1e(162mg，0.98mol)和乙醇8ml，于75℃反应过夜；反应完毕后，待反应液温度降到室温，过程中有固体析出，过滤，收集固体并用冰乙醇重结晶，得198mg化合物ni-h-0461。
实施例2
按照实施例1所述方法合成的化合物，如表1所示。
表1合成的化合物
实施例3
合成路线：
第一步：中间体2a的合成
往100ml的圆底烧瓶中加入化合物1d(1g，0.0044mol)，无水dmf10ml，混匀，然后往里面缓慢滴加三氯氧磷(1.68g，0.011mol)，在室温下搅拌反应过夜；反应完毕后，将反应液倒入冰水中，过滤，收集固体；将固体溶于二氯甲烷中，依次用饱和碳酸钠水溶液、饱和食盐水洗涤，然后加入无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液减压浓缩，再用乙醇进行重结晶，得到841mg化合物2a。
第二步：产物ni-h-00576的合成
于微波反应瓶中加入化合物2a(200mg，0.738mol)、2b(158mg，0.738mol)和3ml乙醇，在90℃下微波反应30min；反应完毕后，过滤，收集固体，再用乙醇进行重结晶，得到231mg化合物ni-h-00576。
实施例4
按照实施例3所述方法合成的化合物，如表2所示。
表2合成的化合物
实施例5ns3丝氨酸蛋白酶抑制活性实验
1、配制反应缓冲液，反应缓冲液成分为：hepes50mm,nacl150mm,甘油15％，tritonx-1000.15％，dtt10mm，peg80000.1％,ph7.5。
2、用dmso将受试化合物稀释成10μm及100μm。
3、然后在96孔板中加入ns3丝氨酸蛋白酶、缓冲液和上述配置好的受试化合物，使反应终体积为100ul。混匀，室温预孵30min；设2组反应体系，每组设三次重复，并设空白对照。
4、在上述反应体系中分别加入hcvns3/ns4特异性荧光多肽底物或wnv(西尼罗河病毒)ns3/ns4特异性荧光多肽底物，使其终浓度为100nm，混匀后在室温下孵育1h，再加入100μl,500mm的吗啉乙磺酸终止反应。
5、采用酶标仪检测反应体系中的荧光信号，激发波长设为340nm，发射波长设为615nm，记录实验结果。
表3部分受试化合物对hcvns3丝氨酸蛋白酶的抑制活性
注：受试化合物对hcvns3丝氨酸蛋白酶的抑制活性用抑制率表示
如表3结果显示，当受试化合物的浓度设为10μm时，表格中所示化合物对hcvns3丝氨酸蛋白酶的抑制率为5％～65％；当受试化合物的浓度设为100μm时表格所示化合物对hcv的ns3丝氨酸蛋白酶的抑制率均有所增强，抑制率达31％～100％。其中，编号为ni-h-00509、ni-h-00514和ni-h-0528的抑制活性最好。
表4部分受试化合物对wnvns3丝氨酸蛋白酶的抑制活性
注：受试化合物对wnvns3丝氨酸蛋白酶的抑制活性用抑制率表示
如表4结果显示，当受试化合物的浓度设为10μm时，表格中所示化合物对wnvns3丝氨酸蛋白酶的抑制率均低于20％；当受试化合物的浓度设为100μm时，表格中所示化合物对wnvns3丝氨酸蛋白酶具有较强的抑制活性，抑制率为49％～55％。其中，编号为ni-h-00504的化合物抑制活性最好。
表1以及表2中其他化合物在浓度为100μm时，对hcv以及wnvns3蛋白酶的抑制率均低于20％。
实施例6抗病毒活性实验
1、抗丙型肝炎病毒(hcv)活性实验
(1)将含有hcvgenotype2(jfh1)的亚基因组rna复制子的细胞株huh7.5.1接种于96孔板中，每孔细胞数量为2×104个，置于co2培养箱中培养24h后，加入dmso溶解的受试化合物，置于co2培养箱中孵育48h后，测定化合物的ec50值。表4为部分化合物的ec50值。
(2)将含有hcvgenotype1的亚基因组rna复制子的bm4-5细胞系细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为2×104个，置于co2培养箱中培养24h后，加入采用dmso梯度稀释后的受试化合物，置于co2培养箱中孵育48h后，测定化合物的ec50值。表4为部分化合物的ec50值。
2、抗登革热病毒(denv)活性实验
将bhk-21细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为5×104个，置于co2培养箱中培养24h后，加入含有海肾荧光素酶(rluc)报告基因的denv基因转染bhk-21细胞，加入dmso溶解的受试化合物，置于co2培养箱中孵育48h后，测定化合物的ec50。表4为部分化合物的ec50。
3、抗西尼罗河病毒(wnv)活性实验
将vero细胞系细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为8×104个，置于co2培养箱中培养6h后，加入含有海肾荧光素酶(rluc)报告基因的复制子全长wnv基因转染vero细胞，加入dmso溶解的受试化合物，置于co2培养箱中孵育24h后，测定化合物的ec50。表4为部分化合物的ec50。
4、受试化合物对病毒孵育细胞的毒性实验
将细胞株huh7.5.1、bm4-5细胞系细胞、bhk-21细胞和vero细胞系细胞分别接种于96孔板中，每孔细胞数量依次设为2×104个、2×104个、5×104个和8×104个，置于co2培养箱中培养6h后，将96孔板内的细胞培养基吸去，加入用培养基梯度稀释后的受试化合物，将细胞放回培养箱，继续培养48h后进行mtt细胞活性测试，测定化合物的cc50值。cc50为50％的细胞发生病变时的药物浓度，部分化合物的cc50值见表4。
表5通式ⅱ部分化合物针对bm4-5的ec50及cc50值
如表5结果显示，受试化合物对hcvgenotype1基因型具有一定的抑制作用(ec50<10μm),但其对bm4-5的细胞毒性较大。
表6通式ⅲ部分化合物在不同细胞系中的活性数据
注：n/d为尚未检测；
如表6结果显示，受试化合物抑制丙肝病毒的ec50<50μm，而对西尼罗河病毒以及登革热病毒具有较好的抑制活性，可以在极低浓度(纳摩尔级别)抑制病毒的复制且对病毒转染细胞的细胞毒活性较小(cc50>600μm)，具有进一步研究的价值。