细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂的制作方法

本发明属于病毒疫苗技术领域，涉及一种细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂。

背景技术：

麻疹是由麻疹病毒引起，经呼吸道传播的急性传染病，易感人群涵盖了所有无特异性免疫力及免疫力低下的儿童及成人。麻疹发病率及病死率在疫苗使用前位居儿童传染病之首。目前，疫苗接种仍旧是预防麻疹感染和控制其流行的最有效措施。

现阶段，国内外麻疹病毒的培养多使用原代鸡胚细胞转瓶培养技术，转瓶技术为传统的贴壁细胞培养技术，细胞接种在旋转的圆筒形培养器——转瓶中，培养过程中转瓶不断旋转，使细胞交替接触培养液和空气。转瓶培养具有结构简单，投资少，技术成熟，放大只需简单的增加转瓶数量等优点。但也有其缺点：

(1)自动化程度低，人工操作工作量大，虽然有转瓶机辅助，但各个工序操作环节中仍需要大量的手工操作，不能实现自动化和标准化；

(2)大量的清洗验证工作，清洗质量受人为因素的影响、难以保证清洗效果的一致性，人工和清洗验证成本逐年增加；

(3)占用空间大产，在现有的条件下，转瓶本身的局限性难以产业化或规模化生产；

(4)人工操作较繁琐，玻璃易碎，增加人员感染风险及操作环境的污染风险显著增加；

(5)生产工艺可控性差，瓶间差异较大，难以保证制品质量的细胞批间一致性，且细胞生长成单层成纤维细胞的时间较长，需要72-96h；

(6)病毒收获为单次收获，不能完整有效的利用细胞，影响产能的放大。

采用转瓶培养技术2-3次收获病毒原液，但每次收获的单次病毒原液仅为2000-3000ml，且瓶间病毒滴度差异较大，多次打开瓶口也会造成污染的风险升高。

目前，应用生物反应器进行大规模细胞培养亦称为国内外各个生产研究机构的关注重点，vero细胞、人二倍体细胞应用生物反应器进行细胞培养已获得成功。但鸡胚、地鼠肾等原代细胞采用生物反应器进行培养还未有成功的报道。理论上讲，原代细胞培养利用生物反应器是可行的，但需进行长期的工艺摸索。

因此，获得高滴度麻疹病毒原液，配制多联多价的含麻疹病毒的系列疫苗，提高产品质量的均一性，扩大麻疹系列疫苗产品的产能，降低污染的风险，进一步复合日益升级的gmp管理的要求，充分满足国家免疫规划的要求是目前亟待解决的技术。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂，从而实现在同等生产规模下，减少细胞消化批数，并获得高滴度的麻疹病毒液，有效提高麻疹系列疫苗产品质量的均一性，扩大制品的产能。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现；

本发明提供一种利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法，其包括以下步骤：

选用spf鸡胚细胞，加入细胞培养液制备成细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入到细胞工厂中；

将麻疹病毒的工作种子与细胞悬浮液按照(0.005-0.05)：1的比例接种于细胞工厂中，于33±1℃的温度下静置培养3-4天，倾去原细胞培养液，换以新鲜的细胞培养液继续培养；

当细胞出现5％-10％的病变时，倾去细胞培养液，用不少于原细胞培养液量的洗液洗涤细胞表面，并换以病毒维持液继续培养；

当细胞出现50％-75％的病变时，收获单次麻疹病毒液。

单次麻疹病毒液即为单批次生产的麻疹病毒原液，将同一细胞批生产收获的单次麻疹病毒液澄清过滤并检测合格后进行合并。

上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述细胞培养液为灭能小牛血清的0.2％乳蛋白的earle’s液。

上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述细胞悬浮液制备方法为：

选用9-11日龄来自spf鸡群的鸡蛋，经消毒后取出鸡胚，去除鸡胚头部及内脏，剪碎；用0.125％的胰蛋白酶于37±1℃温度下对剪碎的鸡胚水浴消化18-22min，然后加入0.2％的乳蛋白earle’s液进行分散处理，最后加入含灭能小牛血清的0.2％的乳蛋白earle’s液作为细胞培养液，得到细胞悬浮液。

上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，当细胞出现50％-75％的病变时，收获单次麻疹病毒液的具体操作为：

当细胞出现50％病变时，进行第一次收获麻疹病毒液，收获后再加入新鲜的病毒维持液继续培养；

继续培养12h后，进行第二次收获麻疹病毒液，收获后若细胞出现大量空洞或大面积拉网，则停止继续培养；否则再加入新鲜的病毒维持液继续培养；

当细胞出现75％病变时，进行第三次收获麻疹病毒液。

上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述麻疹病毒为麻疹病毒减毒株沪191。

上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述洗液为earle’s液。

上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述病毒维持液为不含任何抗生素的m-199培养液。

上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述细胞工厂为cf40。

细胞工厂(cellfactory)是一种设计精巧的细胞培养装置，在有限的空间内利用了最大限度的培养表面，从而节省了大量的厂房空间，无需进行任何厂房改造即可实现扩大产能的目的。可用于疫苗、单克隆抗体或生物制药等工业规模生产，特别适合于贴壁细胞，也可用于悬浮培养，在从实验室规模进行放大时不会改变细胞生长的动力学条件，目前市售细胞工厂有1、2、10和40层的规格，使工艺研究和工艺放大变得简单易行，污染风险大大降低，节省空间，有效的保证操作的无菌性，最大限度降低细胞批间差异，实现操作规程化，且培养表面有利于细胞贴附和生长。同时，细胞工厂自动化操作设备可全面实现细胞培养的标准化，从而大大地减低劳动强度和密集度，替代传统的转瓶培养技术，实现大规模的细胞培养。

本发明所采用的细胞工厂为cf40(40层细胞工厂细胞培养容器)，通过细胞工厂操作器完成细胞所需的液体洗换和多层细胞工厂显微观察系统，完成细胞生长情况观察和cpe的判定。

本发明采用的spf鸡胚细胞源于spf(specificpathogenfree)鸡胚蛋，意指无特定病原。鸡胚细胞应选取30-60周龄的spf鸡群所产的蛋，经37℃孵化9-11日，采取无菌操作技术取出鸡胚，并去除头及内脏，保留其组织，并将鸡胚组织剪成均一的组织块，经胰酶消化后制备成鸡胚细胞悬液。鸡胚细胞悬液按比例加入细胞生长液后分装至细胞培养容器中，在适宜的温度环境下培养2-3天即制备成成纤维状的原代鸡胚细胞。

本发明采用的麻疹病毒为麻疹病毒减毒株沪191，经减毒获得沪191减毒株，经传代稳定性试验确定工作种子代次为鸡胚细胞的第16代至第32代。

本发明还提供一种麻疹减毒活疫苗制剂，其是按照包括以下步骤的方法制备得到的：

采用上述的方法制备的麻疹病毒原液，按照麻疹病毒滴度为5.11gccid50/ml的配制点，加入保护剂混合，配制得到麻疹减毒活疫苗制剂。

本发明还提供一种麻风联合减毒活疫苗制剂，其是按照包括以下步骤的方法制备得到的：

采用上述的方法制备的麻疹病毒原液，与风疹病毒原液按照麻疹病毒和风疹病毒滴度均为5.11gccid50/ml的配制点等比例混合，加入保护剂混合，配制得到麻风联合减毒活疫苗制剂。

本发明还提供一种麻腮风联合减毒活疫苗制剂，其是按照包括以下步骤的方法制备得到的：

采用上述的方法制备的麻疹病毒原液，与风疹病毒原液和腮腺炎病毒原液按照麻疹病毒和风疹病毒滴度均为4.51gccid50/ml的配制点、腮腺炎病毒滴度为6.11gccid50/ml的配制点进行稀配，并加入保护剂，混合后，配制得到麻腮风联合减毒活疫苗制剂。

所述风疹病毒原液是采用cf402bs细胞通过常规方法培养制备得到的；所述腮腺炎病毒原液是采用cf40鸡胚细胞通过常规方法培养制备得到的。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用细胞工厂制备麻疹病毒原液，相对于转瓶培养方式，细胞工厂为静置培养，有利于细胞贴附和生长，细胞质量更加可控，获得的麻疹病毒原液质量稳定，在后期疫苗稀配、分装冻干以及保存的过程中，病毒滴度下降的幅度减小，质量可控性良好，能够提高免疫效果；

(2)本发明采用细胞工厂制备麻疹病毒原液的产量数倍于转瓶工艺，能够减少细胞制备批数，缩小病毒原液批间差异，产品质量更加趋于一致性；

(3)本发明制备的麻疹减毒活疫苗制剂、麻疹风疹联合减毒活疫苗制剂(mr)和麻腮风联合减毒活疫苗制剂(mmr)质量更加可控，安全性好，批间差异小，能够极大提升产品市场竞争力；

(4)本发明制备的麻腮风联合减毒活疫苗制剂(mmr)中，麻疹、腮腺炎、风疹病毒含量比例能够达到1：≥20：1。

附图说明

图1为实施例2的麻疹减毒活疫苗制剂病毒原液、半成品及成品检测与转瓶工艺检测结果对比图；

图2为实施例4的麻腮风联合减毒活疫苗制剂(mmr)半成品及成品的病毒滴度检测与转瓶工艺mmr检测结果对比图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1

本实施例提供一种利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法，其包括以下步骤：

选用9-11日龄来自spf鸡群的鸡蛋，经消毒后取出鸡胚，去除鸡胚头部及内脏，剪碎；用0.125％的胰蛋白酶于37±1℃温度下对剪碎的鸡胚水浴消化18-22min，然后加入0.2％的乳蛋白earle’s液进行分散处理，最后加入含灭能小牛血清的0.2％的乳蛋白earle’s液作为细胞培养液，得到细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入到细胞工厂cf40中；

将麻疹病毒减毒株沪191的工作种子与细胞悬浮液按照(0.005-0.05)：1的比例接种于细胞工厂cf40中，于33±1℃的温度下静置培养3-4天，倾去原细胞培养液，换以新鲜的细胞培养液(0.2％的乳蛋白earle’s液)继续培养；

当细胞出现5％-10％(此范围是通过显微镜观察多个视野的综合判定)的病变时，倾去细胞培养液，用不少于原细胞培养液量的洗液(earle’s液)洗涤细胞表面，并换以病毒维持液(不含任何抗生素的m-199培养液)继续培养；

当细胞出现50％病变时，进行第一次收获麻疹病毒液，收获后再加入新鲜的病毒维持液(不含任何抗生素的m-199培养液)继续培养；

继续培养12h后，进行第二次收获麻疹病毒液，收获后若细胞出现大量空洞或大面积拉网，则停止继续培养；否则再加入新鲜的病毒维持液(不含任何抗生素的m-199培养液)继续培养；

当细胞出现75％病变时，进行第三次收获麻疹病毒液。

将同一细胞批生产收获的单次麻疹病毒液澄清过滤并检测合格后合并得到麻疹病毒原液。

采用本实施例细胞工厂cf40培养方式能够连续3次收获病毒原液，从而使病毒收率从转瓶培养的3000ml/瓶提高至24000ml/瓶，减少细胞消化批数，能够获得高质量的病毒原液，病毒滴度从5.2lgccid50/ml提高至5.6lgccid50/ml，产品质量更加均一。增加产量，单个cf40产能是10l转瓶单次收获的8倍，是10l转瓶多次收获的2-3倍。

对多次收获的麻疹病毒原液进行全基因组测序，疫苗病毒代次与工作代毒种基因序列完全一致。

实施例2

本实施例提供一种麻疹减毒活疫苗制剂，其采用实施例1制备的麻疹病毒原液，按照麻疹病毒滴度为5.11gccid50/ml的配制点，加入保护剂，混合后得到麻疹减毒活疫苗制剂的半成品；经合格检定后，得到麻疹减毒活疫苗制剂。

实施例3

一种麻疹风疹联合减毒活疫苗制剂，其采用实施例1制备的麻疹病毒原液，与风疹病毒原液等比例混合，加入保护剂，混合后得到麻疹风疹联合减毒活疫苗制剂的半成品，经合格检验后，得到麻疹风疹联合减毒活疫苗制剂。

实施例4

一种麻腮风联合减毒活疫苗制剂，其采用实施例1制备的麻疹病毒原液，与风疹病毒原液和腮腺炎病毒原液，按照麻疹病毒和风疹病毒滴度均为5.11gccid50/ml的配制点、腮腺炎病毒滴度为6.11gccid50/ml的配制点进行稀配，加入保护剂，混合后得到麻腮风联合减毒活疫苗制剂的半成品，经合格检验后，得到麻腮风联合减毒活疫苗制剂。

实施例2-4制备的麻疹减毒活疫苗制剂、麻疹风疹联合减毒活疫苗制剂(mr)和麻腮风联合减毒活疫苗制剂(mmr)病毒分型滴度控制在3.3-4.51gccid50/ml区间，37℃温度下放置7天后，病毒含量不低于上述标准，滴度下降不高于1.01gccid50/ml。

麻疹风疹联合减毒活疫苗制剂(mr)中麻疹和风疹病毒含量比例接近于1：1；麻腮风联合减毒活疫苗制剂(mmr)中麻疹、腮腺炎和风疹病毒含量比例由目前的1：＞5：1提升到1：≥20：1。采用细胞工厂工艺生产麻疹减毒活疫苗，成品病毒滴度在4.4-5.1lgccid50/ml范围内，热稳定性在4.2-5.1lgccid50/ml范围内，其基础到热稳的滴度下降控制在0-0.4lg区间内，病毒滴度下降值低于转瓶工艺(0.4lg)的水平，病毒稳定性良好。本发明制备的麻疹系列疫苗产能达到5000-6000万人份/年。

图1为实施例2的麻疹减毒活疫苗制剂病毒原液、半成品及成品检测与转瓶工艺检测结果对比图。

在配制和冻干工艺一致的条件下，cf40细胞工厂制备麻风病毒原液稀配的麻风联合疫苗与转瓶工艺制备的对照疫苗半成品基本保持在同一水平，均为4.6-4.8lgccid50/ml。cf40干后麻风联合减毒活疫苗中麻疹、风疹病毒分型滴度保持在4.0-4.8lgccid50/ml的水平，略优于转瓶工艺对照疫苗(3.8-4.6lgccid50/ml)。说明cf40细胞工厂制备麻疹、风疹病毒原液病毒稳定性良好，且麻风成品病毒滴度比维持在1：1的水平。

图2为实施例4的麻腮风联合减毒活疫苗制剂(mmr)半成品及成品的病毒滴度检测与转瓶工艺mmr检测结果对比图。

由图2检测结果可知，运用cf40制备的麻疹、风疹、腮腺炎病毒原液配制的联合疫苗检测结果符合2015版药典规定，其中麻疹热稳滴度下降值为0-0.1lg(转瓶工艺为0.3lg)；腮腺炎热稳滴度下降值为0.2-0.7lg(转瓶工艺为0.6lg)；风疹热稳滴度下降值为0-0.3lg(转瓶工艺为0.1lg)；与转瓶工艺制备的mmr比较病毒稳定性良好。

对本发明生产的麻疹减毒活疫苗制剂、麻风联合减毒活疫苗制剂(mr)和麻腮风联合减毒活疫苗制剂(mmr)进行长期稳定性观察，检测指标均符合cfda颁布中国药典所规定的标准。

综上所述，本发明技术方案能够实现在同等生产规模下，减少细胞消化批数，并获得高滴度的麻疹病毒液，有效提高麻疹系列疫苗产品质量的均一性，扩大制品的产能。