TNFSF15蛋白在人脐带血造血干细胞体外扩增中的用途的制作方法

本发明涉及医药领域，特别涉及tnfsf15蛋白在人脐带血造血干细胞体外扩增中的用途。

背景技术：

应用骨髓移植治疗白血病等恶性血液疾病已有50多年的历史，造血干细胞因其具有自我更新及多向分化的能力而成为临床上治疗多种疾病的有效途径之一。但骨髓中造血干细胞数量较低，移植后难以在病人体内有效进行造血重建，这也成为造血干细胞临床应用的瓶颈之一。目前可获取造血干/祖细胞的三种来源(正常人外周血、骨髓、婴儿脐带血)中，造血干细胞的比例较低，并且采用骨髓移植还需供者与患者进行骨髓配型，这些因素都极大地限制了造血干细胞的临床应用。脐带血是一个重要的干细胞来源，因为其采集方便，干细胞含量丰富，移植物抗宿主病发生率低而受到欢迎。但是由于每份脐血的量有限，每份脐血中造血干细胞的绝对数比较低，不能广泛应用于成人以及体重较重的患者。因此体外扩增脐血造血干细胞的数量以改善成人脐血的移植效果是一件十分紧迫的事情，而将脐血中的造血干细胞体外诱导扩增可以解决脐血中干细胞量不足的问题。目前体外培养造血干/祖细胞主要依靠向培养基中添加血清以及scf、tpo、flt3l等细胞因子，但扩增效果仍不理想，造血干/祖细胞在体外很快便发生分化、衰竭。因此寻找新的能够扩增造血干细胞的蛋白是十分重要的课题。

肿瘤坏死因子超家族成员15(tumornecrosisfactorsuperfamily-15,tnfsf15),是主要由已经形成血管中的内皮细胞分泌的，特异性抑制血管内皮细胞增殖的细胞因子。本发明创造性的发现tnfsf15蛋白对人脐带血造血干细胞的体外扩增有显著的作用。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种新的人脐带血造血干细胞的体外扩增方法。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供了tnfsf15蛋白在人脐带血造血干细胞体外扩增中的用途。

具体地，在该用途中，tnfsf15蛋白在扩增培养基中的浓度为:0<浓度≤4μg/ml。

本发明还提供了一种人脐带血造血干细胞体外扩增的方法，该方法包括在人脐带血中的cd34+造血干细胞在包含tnfsf15蛋白的培养基中进行培养的步骤。

进一步，所述的培养基中，tnfsf15蛋白的浓度为：0<浓度≤4μg/ml。

具体地，该方法包括如下步骤：首先采用磁珠分选法分选人脐带血中的cd34+造血干细胞，将cd34+细胞用(imdm+10-15％fbs+10-100ng/mlscf+10-100ng/mltpo+10-100ng/mlflt3+0-100ng/mlil-6+0-4μg/mltnfsf15蛋白，其中tnfsf15蛋白浓度不为零)培养基重悬，调整细胞浓度为50000/ml，每孔200μl，加入孔板(如96孔板)中，于孵箱中(37℃，5％co2)培养5-7天。

优选地，该培养基的组成为：imdm+10％fbs+100ng/mlscf+100ng/mltpo+100ng/mlflt3+100ng/mlil-6+2μg/mltnfsf15蛋白。

本发明还提供了一种扩增人脐带血造血干细胞的培养基，该培养基中包括tnfsf15蛋白。优选地，该tnfsf15蛋白的浓度为0<浓度≤4μg/ml。

优选地，该培养基的组成为：imdm+10-15％fbs+10-100ng/mlscf+10-100ng/mltpo+10-100ng/mlflt3+0-100ng/mlil-6+0-4μg/mltnfsf15蛋白，其中tnfsf15蛋白浓度不为零。

更优选地，该培养基的组成为：imdm+10％fbs+100ng/mlscf+100ng/mltpo+100ng/mlflt3+100ng/mlil-6+2μg/mltnfsf15蛋白。

本发明所具有的有益效果：

本发明tnfsf15蛋白对于人脐带血造血干细胞自我更新具有较好的促进作用，可为日后临床治疗提供新的方法。

附图说明

图1是：不同浓度tnfsf15蛋白处理5天后cd34⁺cd49f⁺比例的变化。

图2是：不同浓度tnfsf15蛋白处理5天后cd34⁺cd49f⁺数量的变化。

图3是：2μg/mltnfsf15蛋白处理5天后造血干细胞的频率。

图4是：2μg/mltnfsf15蛋白处理7天后nod/scid小鼠的造血重建频率。

具体实施方式

为了理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

实施例1

一种扩增人脐带血造血干细胞的培养基，该培养基的组成为：imdm+10％fbs+100ng/mlscf+100ng/mltpo+100ng/mlflt3+100ng/mlil-6+2μg/mltnfsf15蛋白。

实施例2

一种人脐带血造血干细胞体外扩增的方法，该方法包括如下步骤：首先采用磁珠分选法分选人脐带血中的cd34+造血干细胞，将cd34+细胞用(imdm+10％fbs+100ng/mlscf+100ng/mltpo+100ng/mlflt3+100ng/mlil-6+2μg/mltnfsf15蛋白)培养基重悬，调整细胞浓度为50000/ml，每孔200μl，加入96孔板中，于孵箱中(37℃，5％co2)培养5天。

实施例3：tnfsf15蛋白对造血干细胞扩增的影响

1)脐带血造血干细胞分选

(1)取脐带血，用羟乙基淀粉沉淀红细胞。脐血和羟乙基淀粉按照体积比5:1加入。混匀后，室温沉降40分钟。

(2)取沉降后的上清，加入红细胞裂解液裂解红细胞，37℃水浴中裂解20分钟；

(3)1500转离心15分钟后，弃上清。再次加入红细胞裂解液，37℃水浴中裂解20分钟；

(4)1500转离心15分钟后，弃上清。沉淀用30mlpbs重悬。离心洗细胞，并计数。

(5)将沉淀用1ml的pbs重悬，每10⁸细胞各加入100μl磁珠和fcr受体阻断剂。室温避光孵育30分钟；

(6)孵育结束后，加入30ml的pbs，1500转离心8分钟。洗去未结合的磁珠。

(7)用1mlpbs重悬细胞沉淀。

(8)安装ls柱子，用3mlpbs润柱3遍。

(9)逐滴加入细胞悬液，梯度磁场中通过。

(10)用3mlpbs-edta洗柱3遍；

(11)将柱子移出磁场，放在收集管上，加入3-5mlpbs-edta，用活塞快速推出细胞，取10μl进行细胞计数。

2)tnfsf15对造血干细胞的体外扩增作用

(1)将细胞悬液离心，1500转离心8分钟后，弃上清。

(2)细胞沉淀用imdm+10％fbs+100ng/mlscf+100ng/mltpo+100ng/mlflt3+100ng/mlil-6培养基重悬，调整细胞浓度为50000/ml。每孔200μl，加入96孔板中。

(3)实验设置对照组和实验组，实验组在上述培养基中加入0.2μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml的tnfsf15蛋白，对照组在上述培养基中加入相应剂量的buffer。轻轻震荡混匀，放入37℃孵箱中培养。

(4)5天后将培养后的细胞离心，标记抗体。cd34-apc，cd49f-pe。室温孵育30分钟，避光。

(5)离心，弃去未结合的抗体。并用100μl生理盐水重悬，进行流式细胞仪分析。

3)结果分析：

由图1可知，与相应的buffer组相比，tnfsf15蛋白不同的浓度均能提高造血干细胞cd34+cd49f+的比例，并且呈现出浓度依赖性。当蛋白的浓度达到4μg/ml时，cd34+cd49f+的比例达到最大值。同时由图2可知，tnfsf15蛋白不同的浓度均能提高造血干细胞cd34+cd49f+的数量，并且呈现出浓度依赖性。当蛋白的浓度达到4μg/ml时，cd34+cd49f+的数量达到最大值。由此可知，tnfsf15蛋白能够提高脐带血造血干细胞的比例和细胞数量。

实施例4：tnfsf15蛋白对鹅卵石形成区域(cafc)分析

1)基质细胞培养

(1)复苏基质细胞m2-10b4，用传代培养基(高糖1640+10％fbs)重悬细胞，并进行细胞计数。

(2)使用胶原蛋白包被96孔板。每孔约加入50μl胶原蛋白溶液，轻摇孔板使其平铺于板底。半开盖置于超净台内，室温晾干至少1h。

(3)显微镜下观察基质细胞状态良好并达到所需要的细胞数目时消化细胞，使用长周期培养基(h5100+10^-6m氢化可的松)重悬细胞，使细胞浓度约为10⁶-10⁸/ml，照射剂量为8000cgy(x-ray)。

(4)使用pbs缓冲液中和胶原蛋白表面的浮酸。

(5)照射完成后离心收集细胞，并进行细胞计数。使用长周期培养基重悬细胞，使其浓度为1.25×10⁴/ml。

(6)将细胞接种于胶原蛋白已包被的96孔板中，每孔加入100μlm2-10b4细胞悬液，于孵箱(37℃，5％co2)中培养过夜。

2)待检测细胞铺入

(1)实验组：cd34⁺细胞在imdm+10％fbs+100ng/mlscf+100ng/mltpo+100ng/mlflt3+100ng/mlil-6+2μg/mltnfsf15培养基中37℃，5％co2培养5天。对照组：cd34⁺细胞在imdm+10％fbs+100ng/mlscf+100ng/mltpo+100ng/mlflt3+100ng/mlil-6+buffer培养基中37℃，5％co2培养5天。

收集对照组和实验组细胞，进行细胞计数，然后使用长周期培养基(h5100+10^-6m氢化可的松)重悬细胞。

(2)小心地移除孔板内90％的培养基，注意不要吸干或搅动基质细胞层。

(3)每孔按计算浓度加入上层待测细胞，100μl/孔，并设置细胞的浓度梯度。

(4)每周进行一次半量换液，换液时小心不要搅动基质细胞层。5周后计数鹅卵石区域的数量，并进行泊松分布统计。

3)结果分析：

由图3可知，在tnfsf15蛋白处理细胞5天后，造血干细胞的比例得到了明显的提高，根据泊松分布的统计原理，溶剂对照组(buffer组)中平均大约400个细胞中出现一个造血干细胞，而tnfsf15蛋白处理之后，平均大约100个细胞中出现一个造血干细胞。因此可知，tnfsf15蛋白对造血干细胞有明显的扩增作用。

实施例5：tnfsf15蛋白对造血干细胞体内造血重建的影响

1)脐带血造血干细胞分选

(1)取脐带血，用羟乙基淀粉沉淀红细胞。脐血和羟乙基淀粉按照体积比5:1加入。混匀后，室温沉降40分钟。

(2)取沉降后的上清，加入红细胞裂解液裂解红细胞，37℃水浴中裂解20分钟；

(3)1500转离心15分钟后，弃上清。再次加入红细胞裂解液，37℃水浴中裂解20分钟；(4)1500转离心15分钟后，弃上清。沉淀用30mlpbs重悬。离心洗细胞，并计数。

(5)将沉淀用1ml的pbs重悬，每10⁸细胞各加入100μl磁珠和fcr受体阻断剂。室温避光孵育30分钟；

(6)孵育结束后，加入30ml的pbs，1500转离心8分钟。洗去未结合的磁珠。

(7)用1mlpbs重悬细胞沉淀。

(8)安装ls柱子，用3mlpbs润柱3遍。

(9)逐滴加入细胞悬液，梯度磁场中通过。

(10)用3mlpbs-edta洗柱3遍；

(11)将柱子移出磁场，放在收集管上，加入3-5mlpbs-edta，用活塞快速推出细胞，取10μl进行细胞计数。

2)tnfsf15对造血干细胞的体外扩增作用

(1)将细胞悬液离心，1500转离心8分钟后，弃上清。

(2)细胞沉淀用imdm+10％fbs+100ng/mlscf+100ng/mltpo+100ng/mlflt3+100ng/mlil-6培养基重悬，调整细胞浓度为50000/ml。每孔200μl，加入96孔板中。

(3)实验设置对照组和实验组，实验组在上述培养基中加入2μg/ml的tnfsf15蛋白，对照组在上述培养基中加入相应剂量的buffer。轻轻震荡混匀，放入37℃孵箱中培养7天。

3)待检测细胞接种于nod/scid小鼠髓腔中

(1)实验组：cd34⁺细胞在imdm+10％fbs+100ng/mlscf+100ng/mltpo+100ng/mlflt3+100ng/mlil-6+2μg/mltnfsf15培养基中37℃，5％co2培养7天。对照组：cd34⁺细胞在imdm+10％fbs+100ng/mlscf+100ng/mltpo+100ng/mlflt3+100ng/mlil-6+buffer培养基中37℃，5％co2培养7天。其中实验组设置2×10⁴个起始细胞组、1×10⁴个起始细胞组、5000个起始细胞组和2000个起始细胞组。对照组同样设置2×10⁴个起始细胞组、1×10⁴个起始细胞组、5000个起始细胞组和2000个起始细胞组。收集细胞，用pbs将细胞稀释好备用。

(2)取nod/scid小鼠，进行照射。照射剂量为200cgay。

(3)将照射后的小鼠进行麻醉，用微量注射针将不同剂量的细胞注射到小鼠髓腔中。

(4)12周后，检测小鼠骨髓中的cd45+的比例。并对小鼠的移植成功率进行泊松分布分析。

3)结果分析：

由图4可知，在tnfsf15蛋白处理细胞7天后，造血干细胞的比例得到了明显的提高，根据泊松分布的统计原理，溶剂对照组(buffer组)中平均大约11000个细胞可以使一只小鼠进行骨髓重建，而tnfsf15蛋白处理之后，平均大约2000个细胞中可以使一只小鼠进行骨髓重建。因此可知，tnfsf15蛋白对造血干细胞有明显的扩增作用。