一种检测铁皮石斛的核酸组合、试剂盒以及方法与流程

本发明涉及分子生物学
技术领域：
，具体而言，涉及一种检测铁皮石斛的核酸组合、试剂盒以及方法。
背景技术：
：铁皮石斛(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)属兰科石斛属，俗称铁皮兰、黑节草，是我国传统名贵中药。现代药理研究表明，铁皮石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用，因此在临床中被广泛应用。铁皮石斛是中国药典记录加工枫斗的唯一来源，是石斛类药材中一个较为著名的商品，常被视为价格昂贵的极品。在《中华人民共和国药典》2015年版中更是被单独分列出来。但目前市场上流通的商品铁皮石斛中混杂较多，民间用于枫斗加工的材料也是五花八门。市场上有30余种石斛属及部分石仙桃属、金石斛属和石豆兰属植物在市场上冒充铁皮石斛和其它药用石斛。对于石斛干品而言，加工后的干品外形非常相似，依靠经典的鉴定方法则更难鉴别。此外，来源不同的铁皮石斛在化学成分上也有较大差异，严重影响了商品铁皮石斛质量的稳定性。近年来发展的以分子生物学为基础的检测方法如dna条形码、位点特异性pcr等尽管克服了传统鉴别方法准确度不高、主观性大等缺点，在实验室条件下实现了铁皮石斛的准确检测，但是由于常规pcr需要昂贵的pcr仪或测序仪以及凝胶电泳以及成像系统等，大大限制了这些检测方法的推广应用。因此，建立适用于铁皮石斛的准确、快速、低成本的检测方法一直是中药鉴定领域中亟待解决的问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测铁皮石斛的核酸组合，该核酸组合可快速、特异、灵敏、简便的鉴别铁皮石斛真伪。本发明的另一目的在于提供上述核酸组合的应用。本发明的另一目的在于提供一种检测铁皮石斛的试剂盒。本发明的另一目的在于提供一种检测铁皮石斛的方法，该方法可实现在药市、药房、产地等快速、特异、灵敏、简便的鉴别出铁皮石斛真伪的目的。本发明是这样实现的：一种检测铁皮石斛的核酸组合，其包括seqidno.1-2所示的内引物组和seqidno.3-4所示的外引物组。上述的核酸组合在检测铁皮石斛中的应用。上述的核酸组合在制备用于检测铁皮石斛的试剂盒中的应用。一种检测铁皮石斛的试剂盒，其包括上述的核酸组合。一种检测铁皮石斛的方法，其包括：采用上述的核酸组合对待测样品进行lamp反应。本发明具有以下有益效果：本发明的提供的核酸组合，其包括seqidno.1-2所示的内引物组和seqidno.3-4所示的外引物组。该核酸组合通过lamp技术可快速、特异、灵敏、简便的检测出铁皮石斛；相应地，本发明提供的检测铁皮石斛的方法，具有以下优点：(1)检测时间短，仅40分钟即可获得检测结果，比现有的分子生物学检测方法缩短2-3小时。(2)对仪器设备要求低，不需要普通pcr所用的pcr仪、电泳槽及凝胶成像系统，只要一个水浴锅即可完成检测反应，可实现现场检测。(3)操作简单，整个过程不涉及复杂的仪器设备，检测结果清晰，只用肉眼在日光下观察观察颜色即可判断。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实施例3提供的采用实施例1提供的核酸组合检测不同品种石斛的结果；图2为本发明实施例4提供的对实施例1提供的核酸组合的特异性验证结果。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的一种检测铁皮石斛的核酸组合、试剂盒以及方法进行具体说明。以环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)技术为代表的核酸等温扩增技术的问世，解决了核酸分子标记鉴别方法上的诸多难题，使其作为快速鉴定成为可能。lamp是一种快速的核酸扩增技术，利用特异引物及链置换dna聚合酶在恒温条件下自循环几十分钟，就可完成核酸扩增反应。lamp法操作十分简单，对仪器设备要求低，结果的检测也很简便快捷，十分适合基层快速鉴别。与传统pcr技术相比，核酸恒温扩增具有快速高效，且不需要专用的仪器等优点。lamp方法因其具有高特异性、高灵敏性、简便、快速、低成本等特点，已在病原体检测和疾病的快速基因诊断等诸多领域应用，取得了可喜的成就。但目前尚未见到利用lamp技术鉴别铁皮石斛的报道。一方面，本发明提供了检测铁皮石斛的核酸组合，其包括seqidno.1-2所示的内引物组和seqidno.3-4所示的外引物组。seqidno.1-2所示的内引物组包括：正向内引物和反向内引物；其中，正向内引物(3-tp-fip)碱基序列为：5’-tgggagattaggcacggagagacaaggccaaccggctaag-3’(seqidno.1)；反向内引物(3-tp-bip)碱基序列为：5’-aataaggctcggatgtgcatggagatgacccgcccttcag-3’(seqidno.2)。seqidno.3-4所示的外引物组包括：正向外引物和反向外引物；其中，正向外引物(3-tp-f3)碱基序列为：5’-tcgagtctttgaacgcaagt-3’(seqidno.3)；反向外引物(3-tp-b3)碱基序列为：5’-ccccttattgttggcaacca-3’(seqidno.4)。本发明提供的核酸组合通过生物信息学分析铁皮石斛及同属近缘植物的序列差异，基于铁皮石斛its序列(genbank登录号：hq114245.1)，应用lamp在线设计软件进行引物设计与筛选得到。同时，为了增强该核酸组合的特异性，本发明的发明人选择错配位点集中在b1c区5’端的一套引物(扩增起始位点)，并在反向内引物(3-tp-bip)的b1c区的5’端倒数第二个碱基(如下划线部分所示)处人为引入错配将c改为a，使得该b1c区的5’端与其他种石斛对应位置有5个以上碱基的差异，以增加引物特异性。以增加该引物的特异性，实现该核酸组合对目的片段的特异性扩增效果。采用本发明提供的核酸组合，通过lamp技术，可快速、特异、灵敏、简便的检测出铁皮石斛。另一方面，本发明提供了上述的核酸组合在检测铁皮石斛中的应用。另一方面，本发明提供了上述的核酸组合在制备用于检测铁皮石斛的试剂盒中的应用。另一方面，本发明提供了一种检测铁皮石斛的试剂盒，其包括上述的核酸组合。进一步地，在本发明的一些实施方案中，该试剂盒还包括：用于等温扩增反应的缓冲液、dntps、mg2+、链置换dna聚合酶以及具有与dsdna结合能力的荧光染料中的任意一种或至少二种的组合。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述荧光染料为sybrgreeni。进一步地，在本发明的一些实施方案中，链置换dna聚合酶为bst2.0warmstartdna聚合酶。还有一方面，本发明提供了一种检测铁皮石斛的方法，其包括：采用上述的核酸组合对待测样品进行lamp反应。进一步地，在本发明的一些实施方案中，该lamp反应的反应体系包括：上述核酸组合、用于等温扩增反应的缓冲液、dntps、mg2+、dna聚合酶以及具有与dsdna结合能力的荧光染料。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述荧光染料为sybrgreeni。进一步地，在本发明的一些实施方案中，在反应体系中，核酸组合的外引物组与内引物组的摩尔比为(7.8-8.2):1。进一步地，在本发明的一些实施方案中，在反应体系中，核酸组合的外引物组与内引物组的摩尔比为8:1。优选地，在本发明的一些实施方案中，25μllamp反应体系包括：10×isothermalamplificationbuffer2.5μl、dntps(10mmeach)3.5μl、mgso4(100mmol/l)1.5μl、内引物3-tp-fip(20μmol/l)和3-tp-bip(20μmol/l)各2μl、外引物3-tp-f3(10μmol/l)和3-tp-b3(10μmol/l)各0.5μl、bst2.0warmstartdna聚合酶(8u/μl)1μl、dna模板2μl、1000×sybrgreeni1μl、ddh2o8.5μl。进一步地，在本发明的一些实施方案中，lamp反应的条件为：60-66℃恒温孵育35-45min；94-96℃灭活2-3min。优选地，在本发明的一些实施方案中，lamp反应的条件为：65℃恒温孵育40min；95℃灭活2min。lamp反应结束后瞬时离心混匀，在自然光下观察被检样品lamp反应产物的颜色，如果颜色为绿色或黄绿色则表示检测样品存在铁皮石斛，如果依然为浅黄色则表示检测样品不存在铁皮石斛。本发明所提供的检测铁皮石斛的方法具有以下优点：(1)检测时间短，仅40分钟即可获得检测结果，比现有的分子生物学检测方法缩短2-3小时。(2)对仪器设备要求低，不需要普通pcr所用的pcr仪、电泳槽及凝胶成像系统，只要一个水浴锅即可完成检测反应，可实现现场检测。(3)操作简单，整个过程不涉及复杂的仪器设备，检测结果清晰，只用肉眼在日光下观察观察颜色即可判断。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供的检测铁皮石斛的核酸组合，其包括seqidno.1-2所示的内引物组和seqidno.3-4所示的外引物组。其中，seqidno.1-2所示的内引物组包括：正向内引物和反向内引物；其中，正向内引物(3-tp-fip)碱基序列为：5’-tgggagattaggcacggagagacaaggccaaccggctaag-3’(seqidno.1)；反向内引物(3-tp-bip)碱基序列为：5’-aataaggctcggatgtgcatggagatgacccgcccttcag-3’(seqidno.2)。为了增强该核酸组合的特异性，本发明的发明人在3-tp-bip的b1c区的5’端倒数第二个碱基(如下划线部分所示)处引入错配将c改为a，使得3-tp-bip的b1c区与其他种石斛对应位置有5个以上碱基的差异，以增加该引物的特异性，以实现该核酸组合对目的片段的特异性扩增效果。seqidno.3-4所示的外引物组包括：正向外引物和反向外引物；其中，正向外引物(3-tp-f3)碱基序列为：5’-tcgagtctttgaacgcaagt-3’(seqidno.3)；反向外引物(3-tp-b3)碱基序列为：5’-ccccttattgttggcaacca-3’(seqidno.4)。按照上述序列进行lamp引物合成，即可进行lamp检测。采用本实施例提供的核酸组合，通过lamp技术，可快速、特异、灵敏、简便的检测出铁皮石斛。实施例2本实施例提供的检测铁皮石斛的方法，其包括如下步骤：1模板dna的提取1.1取0.1g待测样品，置于1.5ml离心管中，加入3颗钢珠后置于qiagentissuelyser中研磨，粉碎后加入65℃预热的ctab沉淀液[2％ctab,10mmedta,100nmtris-hcl(ph＝8.0)]750μl，充分震荡混匀，65℃温育40min，5000r·min-1离心5min，弃去上清，重复三次(后两次65℃温育5min)。1.2样品冷却至室温后加酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)600μl，缓慢颠倒混匀约5min；7500r·min-1离心10min，转移上清液至一新管中。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置30min；10000r·min-1离心15min,弃上清液。沉淀用70％乙醇(体积分数)、无水乙醇各洗涤1次,10000r·min-1离心3min，弃上清，室温挥干乙醇。te溶解dna，备用。当然，在其他的一些实施例中，模板dna的提取为可选步骤，可直接采用制备好的dna模板进行检测。2lamp反应2.1取上述制备的dna模板，加入到如下反应体系中，配制成25μllamp反应体系：10×isothermalamplificationbuffer2.5μl、dntps(10mmeach)3.5μl、mgso4(100mmol/l)1.5μl、内引物3-tp-fip(20μmol/l)和3-tp-bip(20μmol/l)各2μl、外引物3-tp-f3(10μmol/l)和3-tp-b3(10μmol/l)各0.5μl、bst2.0warmstartdna聚合酶(8u/μl)1μl、dna模板2μl、1000×sybrgreeni1μl、ddh2o8.5μl。其中，外引物组与内引物组的摩尔比为8:1。2.2按照如下程序进行lamp反应：65℃恒温孵育40min；95℃灭活2min。2.3产物鉴定：lamp反应结束后瞬时离心混匀，在自然光下观察被检样品lamp反应产物的颜色。如果颜色为绿色或黄绿色则表示检测样品存在铁皮石斛，如果是依然为浅黄色则表示检测样品不存在铁皮石斛。实施例3采用实施例2提供的检测方法对不同品种的石斛进行鉴定，以水作为阴性对照，不同品种的石斛的信息见表1，检测结果如图1所示(图中：1：铁皮石斛、2：流苏石斛、3：金钗石斛、4：鼓槌石斛、5：叉唇石斛、6：反瓣石斛、7：红头金石斛、n：阴性对照)。表1no.物种拉丁名采集地1铁皮石斛dendrobiumofficinale昆明2流苏石斛dendrobiumfimbriatum.普洱3金钗石斛dendrobiumnobile普洱4鼓锤石斛dendrobiumchrysotoxum普洱5叉唇石斛dendrobiumstuposum普洱6反瓣石斛dendrobiumellipsophyllum云南7红头金石斛flickingeriacalocephala普洱利用实施例2提供的检测方法检测铁皮石斛、流苏石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、叉唇石斛、反瓣石斛、红头金石斛样品，图1结果显示，仅铁皮石斛样品颜色变为黄绿色，其他均为浅黄色，与阴性对照颜色一致，说明本发明实施例2提供的检测方法能够特异性地对铁皮石斛进行鉴别，将其从其他同属近缘植物中检测处理。实施例4对实施例1提供的核酸组合的进行特异性验证。方法：lamp反应在abi7500荧光定量pcr仪上进行，检测反应过程中的荧光信号。25μl荧光定量lamp反应体系包括:2.5μl10×isothermalamplificationbuffer、3.5μl10mmol/ldntps、1.5μlmgso4(100mmol/l)、正向内引物和反向内引物各1.6μmol/l，正向外引物3-tp-f3和反向外引物3-tp-b3各0.1μmol/l、1μlbstdna聚合酶大片段、2μldna模板，并加入1μl20×sybrgreeni及0.05μlrox校正液。反应在abi7500荧光定量pcr仪上进行。反应程序为65℃恒温孵育40min，95℃灭活2min。以实施例1提供的核酸组合作为实验组，以seqidno.5-8所述的核酸组合作为对照组，两个组均以水作为空白对照，分别对表1中所示的不同品种石斛进行荧光检测。其中，对照组的引物为针对its序列其他位点设计的特异性引物，此序列设计上未考虑错配，具体序列如下：正向内引物1-fip(seqidno.5)：acgctgcgccgattttagggatcccctctatggggtgtg；反向内引物1-bip(seqidno.6):aatgggttttgtgggatggggttccattgccgagagtcgt；正向外引物1-f3(seqidno.7):ccactggagtcatcgcct；反向外引物1-b3(seqidno.8):atttcgctgcgctcttca。结果如图2所示(图中：1：铁皮石斛、2：流苏石斛、3：金钗石斛、4：鼓槌石斛、5：叉唇石斛、6：反瓣石斛、7：红头金石斛、8：空白对照)。根据图2的结果显示，对照组中铁皮石斛、流苏石斛、金钗石斛以及鼓槌石斛具有较强的荧光信号，而实验组中仅有铁皮石斛具有较强的荧光信号，由此说明，针对its序列特定位点设计的特异性引物，并通过在反向内引物(3-tp-bip)的b1c区的5’端的倒数第二个碱基处引入错配碱基即将c改为a，有效地增加了本发明提供的核酸组合的特异性。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>广州中医药大学<120>一种检测铁皮石斛的核酸组合、试剂盒以及方法<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>40<212>dna<213>人工序列<400>1tgggagattaggcacggagagacaaggccaaccggctaag40<210>2<211>40<212>dna<213>人工序列<400>2aataaggctcggatgtgcatggagatgacccgcccttcag40<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3tcgagtctttgaacgcaagt20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ccccttattgttggcaacca20<210>5<211>39<212>dna<213>人工序列<400>5acgctgcgccgattttagggatcccctctatggggtgtg39<210>6<211>40<212>dna<213>人工序列<400>6aatgggttttgtgggatggggttccattgccgagagtcgt40<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<400>7ccactggagtcatcgcct18<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列<400>8atttcgctgcgctcttca18当前第1页12