一种特异性检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的RNA探针及其制备方法与流程

本发明涉及植物病毒检测技术领域，尤其涉及一种特异性检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的rna探针及其制备方法。

背景技术：

我国西瓜产业近年来发展迅速，已成为世界上西瓜栽培面积最大的国家。黄瓜绿斑驳花叶病毒(cgmmv)世界各地均有分，主要危害西瓜以及西瓜黄瓜等葫芦科作物，引起西瓜倒瓤(血瓤)症状，食用过多可导致腹泻发热等症状。现有的cgmmv的主要检测手段主要包括酶联免疫吸附测定(elisa)、反转录pcr(rt-pcr)。但是上述方法对病毒基因组rna(grna)、亚基因组rna(sgrna)进行定性以及定量分析时，对rna的积累量和完整度有较高的要求。

故有必要研究一种新型特异性检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的rna的方法，从而提高检测特异性和灵敏性。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种特异性检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的rna探针，该探针可特异性的和黄瓜绿斑驳花叶病毒正义链rna相结合，进而通过northernblot杂交的方式检测出来。

本发明的技术方案如下：

引物设计

从genbank获取cgmmv基因组全长序列(genbankid：nc_001801)，设计特异性引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司(以下简称上海生工)合成(表1)。

表1：扩增目的片段所需引物列表

一种特异性检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的rna探针，如seqidno.1所示。

一种特异性检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的rna探针，其rna探针表达载体序列如seqidno.2所示。

一种特异性检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的rna探针的制备方法，包括以下步骤：

a、按照m-mulvfirststrandcdnasynthesiskit说明书方法可得到cdna，通过特异性引物cgmmvpp+和cgmmvpp-进行pcr反应；

b、将上述pcr产物经纯化后与puc119质粒载体同时进行saci和bamhi双酶切，用dnaligationkit，16℃连接4h，热激法导入dh5α感受态大肠菌细胞，培养后采用菌落pcr筛选，引物采用为cgmmvcp+和载体通用引物pmd19t+进行扩增阳性克隆；

c、送至测序并确定表达载体puc-cgmmv-pp构建成功；

d、通过dignorthern标记以及杂交检测试剂盒，对线性化的puc-cgmmv-pp进行探针转录，即可。

检测时，对西瓜叶片通过trizol提取总rna后，通过甲醛变性胶电泳后转到尼龙膜上，进行northernblot杂交检测。

优选的，所述的特异性引物cgmmvpp+为：acgcggatcctaatacgactcactatagggcccctacccggggaaaagg。

优选的，所述的特异性引物cgmmvpp-为：atcgtgagctcatggcttacaatccgatcacacc。

优选的，所述的cgmmvcp+为：atggcttacacagtttccagtgc。

所述的载体通用引物pmd19t+为gagcggataacaatttcacacagg。

本发明的有益之处在于：

本发明的特异性检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的rna探针，将rna探针可特异性的和黄瓜绿斑驳花叶病毒正义链rna相结合，进而通过northern杂交的方式检测出来。本文设计的特异性探针检测病毒基因组rna(grna)、亚基因组rna(sgrna)以及defectiveinterfering(di)rna以及其他病毒由来的rna片段的积累量和完整度。northern杂交检测体系通过凝胶电泳再转膜杂交，优点是可对病毒的grna以及sgrna等进行分别定量检测，同时可判断核酸是否发生降解。

附图说明

图1：实施例中cgmmv正义链探针表达载体的构建，其中，a：maker，cgmmvpp+和cgmmvpp-扩增的pcr产物；b：maker，泳道1-3cgmmvcp+和pmd19t+进行菌落pcr结果；c：maker，puc119空载体，泳道1-3：cgmmv-pp质粒。

图2：应用实例中northern杂交检测结果；其中，泳道1～3：感染cgmmv烟草叶片总rna稀释1倍、10倍、100倍；泳道4：健康对照；泳道5：感染tmv烟草rna；泳道6：感染pmmov辣椒rna。

具体实施方式

下面以具体的实施例对本发明的应用原理作详细的描述。

实施例

主要试验材料

cgmmv毒源采自辽宁省凤城市；m-mulvfirststrandcdnasynthesiskit反转录试剂盒购自上海生工生物技术有限公司；gxldnapolymerase、载体puc119、内切酶sacⅰ和bamhⅰ均购自takarabioinc.(大连宝生物工程有限公司)；trizonreagent购自康为世纪生物科技有限公司；dignorthernstartkit、dighighprimerdnalabelinganddetectionstarterkitii购自德国罗氏生物试剂有限公司；尼龙膜为美国ge公司产品；cdp-starreagent为美国neb公司产品；其他均为国产或进口分析纯。

引物设计

从genbank获取cgmmv基因组全长序列(genbankid：ay859497)，设计特异性引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司(以下简称上海生工)合成(见表1)。

探针的制备

按照m-mulvfirststrandcdnasynthesiskit说明书方法可得到cdna，通过特异性引物cgmmvpp+和cgmmvpp-进行pcr反应，反应为25μl体系：5×primestargxlbuffer5μl；dntpmixture2μl；cgmmvpp+、cgmmvpp-(2.5mm)各2μl；模板cdna1μl；dnapolymerase0.5μl；超纯水补足至25μl。反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸4min，循环30次，得到长约750bp的pcr产物(图1，a)，上述pcr产物经纯化后与puc119质粒载体同时进行saci和bamhi双酶切，用dnaligationkitver.2.1(takara)16℃连接4h，热激法导入dh5α感受态细胞，培养后采用菌落pcr筛选，引物采用为cgmmvcp+(atggcttacacagtttccagtgc)和载体通用引物pmd19t+(gagcggataacaatttcacacagg)进行扩增阳性克隆(图1，b)，送至测序(上海生工公司)并确定表达载体puc-cgmmv-pp构建成功(提取质粒后的电泳图1，c)。接下来，通过dignorthern标记以及杂交检测试剂盒，对线性化的puc-cgmmv-pp进行探针转录。

检测方法

对现有的感染cgmmv的西瓜叶片通过trizon提取总rna后，通过甲醛变性胶电泳后转到尼龙膜上，进行northernblot杂交检测。

应用实例和对比测试

待测样品rna为trizonreagent从感染cgmmv的西瓜及阴性对照的rna，同时采用同为烟草花叶病毒属的烟草花叶病毒(tmv)以及辣椒轻斑驳(pmmov)作为对照。检测本文构建的rna探针的特异性和灵敏性。采用虹吸法对样品进行northernblot杂交及dot-blot检测：将rna固体样品用上样缓冲液溶解，65℃金属浴变性10min，由2％的甲醛凝胶电泳分离后，甲醛凝胶中的rna由虹吸法转移到尼龙膜上，室温过夜，取出尼龙膜于120℃干热箱中处理1h后，进行杂交和免疫反应，之后于膜上滴2-3滴cdp-starreagent使膜润湿，由bio-radchemidocxrs+化学发光成像系统曝光30s观察结果。提取cgmmv感病西瓜叶片总rna，northern杂交检测结果方面：cgmmv感病样品所提取的rna显阳性，能同时检测到基因组rna(grna)和亚基因组rna(sgrna)两条条带(图2，泳道1)。在同样品稀释到10％以及1％后仍能微弱检测到grna和sgrna的信号(图2，泳道2、泳道3)，且对于同cgmmv亲缘关系较近的tmv感病样品和pmmov感病样品无检测信号。

综上结果，本文构建的rna探针对于cgmmv的核酸rna具有良好的检测特异性和灵敏性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。