本发明涉及一种自组装硅质体静电纺丝纤维膜固定化细胞生产虫草素的方法，属于生物化工领域。
背景技术：
虫草素是虫草中主要的活性成分之一。虫草素具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗增殖、抗转移、抗菌、抗病毒、免疫调节和抗炎等。虫草素的制备主要有化学合成和生物合成两种方式。由于目前化学合成虫草素生产成本高，合成工艺复杂，收率低，产物纯化比较难，所以虫草素主要由生物合成法制备。生物合成法制备虫草素有两种途径：一是固体发酵获得虫草子实体，再从中提取；二是通过虫草液体发酵，从发酵液中直接提取。由于液体发酵比固体发酵在发酵规模、菌体生长速率、生长密度以及可控性上的优势，虫草液体发酵提取虫草素成为主要的虫草素制备方法。
硅质体是一种类脂质体，是由一个分子连接两个疏水性的碳链和一个亲水性的有机硅烷分子组成的新型脂质分子，这种分子在水中通过自组装过程形成囊泡，囊泡表面覆盖有纳米级厚度的无机硅酸盐壳层，用稳定的si-c键将无机层和有机层二分子体连接在一起。硅质体与传统的脂质体囊泡相比，是一种非常稳定的囊泡结构，是有机-无机的杂化材料。与传统的常规脂质体相比，硅质体表面的硅氧烷网络显著增加了脂质体及固定化细胞的稳定性，对表面活性剂、酸碱都有很好的耐受性。硅质体作为固定化细胞的载体，与其他常规载体相比，可以一个硅质体就装载一个细胞，细胞被束缚在硅质体内，获得极大的机械强度，极大的比表面积和抗污染能力。
静电纺丝纳米纤维膜比常规的固定化载体，具有孔隙率高，比表面积大，孔洞连通性好的特点，能够降低底物的扩散阻力，有利于提高固定化细胞的反应活性。
技术实现要素：
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种具有高效、抗染菌、产率高、产物浓度高的固定化细胞方法生产虫草素，并便于后续产物分离和纯化。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种自组装硅质体静电纺丝纤维膜固定化细胞生产虫草素的方法，包括如下步骤：
步骤一：制备蛹虫草原生质体硅质体：称取质量比为0.1～0.2:1～3的有机-无机复合脂质与蛹虫草原生质体，优选0.15:2；将有机-无机复合脂质溶于三氯甲烷中，蒸发除去三氯甲烷得到类脂质薄膜；蛹虫草原生质体悬浮于甘露醇水溶液中，然后加入到所得类脂质薄膜中，搅拌混匀并迅速加热到45～50℃，优选48℃，热激10～30s同时水浴超声，冷却至4℃后静置，经脂质体挤出器挤出，得到粒径均一的蛹虫草原生质体硅质体悬液；
步骤二：制备纳米纤维膜：取壳聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯溶解于乙酸水溶液中，加入甘油，再加入步骤一制得的蛹虫草原生质体硅质体悬液，搅拌混匀，通过静电纺丝制得纳米纤维膜，将其成卷填入层析柱中，层析柱中心留空，用于无菌空气通过；
步骤三：配制葡萄糖、核糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母粉和腺嘌呤的混合水溶液，经过滤除菌后，流经步骤二制备的层析柱，收集流出液，即得。
步骤一中，所述蛹虫草原生质体通过如下步骤获得：
步骤a：取蛹虫草菌体用无菌水充分洗涤，离心取沉淀；
步骤b：配制酶解液：分别取步骤a沉淀质量2～4％的溶壁酶、蜗牛酶、纤维素酶和崩溃酶，以质量体积比0.1:5～10g/ml加入到含有0.3～0.5mol/lkcl和0.2～0.4mol/lmgso4的水溶液中，搅拌充分溶解，再经过滤除菌，制得酶解液；
步骤c：将步骤a得到的沉淀加入到步骤b得到的酶解液中，涡旋混匀，25～30℃下水浴酶解3～8h后，离心取沉淀即得蛹虫草原生质体。
步骤一中，所述有机-无机复合脂质的结构式如下：
该结构在硅质体中形成一层稳定的极薄且具有一定刚性的致密网状膜，可以约束原生质体，使原生质体不会因为环境渗透压的改变而破裂，极大的延长了原生质体的作用时间；另外，由于有机-无机复合脂质于磷脂结构相似，因此，硅质体结合了脂质体和二氧化硅纳米颗粒的双重优点，避免了脂质体和二氧化硅纳米颗粒各自的缺陷，能够最大限度地减少对原生质体的毒性，保证原生质体内蛋白和酶的正常生理功能，同时不会阻碍小分子物质的进出细胞。
步骤一中，所述有机-无机复合脂质与三氯甲烷的混合质量体积比为100-200:10mg/ml，优选150:10mg/ml；所述甘露醇水溶液的浓度为100-180g/l，蛹虫草原生质体与甘露醇水溶液的混合质量体积比为1～3:10g/ml，优选2:10g/ml；所述脂质体挤出器采用聚碳酸酯滤膜，滤膜的孔径为0.5～1.0μm，优选1.0μm。
步骤二中，所述壳聚糖的粘均分子量为5.0×105，脱乙酰度为80～85％，优选85％；所述聚乙烯醇重均分子量为180000～200000，优选200000；所述聚氧化乙烯重均分子量为1×106～1×107，优选1×107；所述乙酸水溶液体积浓度为1～2％；所述壳聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯的质量比为1～2:2～4:7～9，优选2:3:8，壳聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯以总的质量浓度1.5～2％溶解于乙酸水溶液中，优选1.8％；所述甘油的加入量与乙酸水溶液的质量体积比为1～2g/l，优选1.5g/l；所述蛹虫草原生质体硅质体悬液的加入量与乙酸水溶液的体积比为1:100～500，优选1:400。
步骤二中，所述静电纺丝的接收装置采用铝箔，喷头到接收装置的距离为5～30cm，优选20cm；电压为3～30kv，优选20kv；喷射流量为1～5ml/h，优选1ml/h。
步骤三中，所述混合水溶液中葡萄糖浓度为10～15g/l，优选10g/l；核糖浓度为20～30g/l，优选25g/l；磷酸二氢钾浓度为0.5～1g/l，优选0.5g/l；硫酸镁浓度为0.5～0.8g/l，优选0.8g/l；酵母粉浓度为5～8g/l，优选5g/l；腺嘌呤浓度为4～8g/l，优选4g/l；所述混合水溶液的ph值调至5.0～5.8，优选5.8。
步骤三中，所述混合水溶液的流速为0.2～0.5ml/h，优选0.2ml/h；层析柱中无菌空气的通气量为1.0～2.0v/v·min，优选2.0v/v·min；层析柱夹套温度控制在25～27℃，优选27℃。
有益效果：
1、本申请的方法采用连续操作，操作简单，原材料转化效率高，耗时较少，可连续生物合成虫草素。
2、本申请采用硅质体作为细胞的直接载体，有效的束缚住细胞，并通过高渗溶液制备原生质体减小细胞体积，这有利于细胞在硅质体中的装载率和保持硅质体的稳定性，自组装的蛹虫草原生质体硅质体，能持久保持细胞的活性，提高生产效率，降低细胞的损失率。
3、本申请采用静电纺丝做成反应介质，利用其孔隙率大，扩散阻力小的优势和硅质体组合，能够获得最大的反应接触面积，发挥最大的反应效率。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1是本申请方法装置的侧视效果示意图。
图2是本申请方法装置的俯视效果示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中，虫草素的hplc检测方法如下：
色谱柱采用ultimateaq-c18(4.6×250mm，5μm)，流动相为10mmol/lkh2po4溶液和甲醇，流速比为85:15，流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长为260nm。
孔隙率测试：取样品，精确称量其干重w0，在称量瓶中加入一定量的无水乙醇，放入样品，待乙醇充分浸入后称量瓶和样品的总重量w1，然后取出湿样品，再称得称量瓶的重量w2；将比重瓶中装满无水乙醇，称重w3，将湿样品放入比重瓶，装满乙醇到规定刻度后称重为w4。
按照以下公式计算孔隙率。
式中，p为孔隙率，％。
实施例1
蛹虫草原生质体的制备，步骤如下：
(1)取3g蛹虫草菌体用无菌水充分洗涤，离心取沉淀。
(2)配制酶解液：取溶壁酶0.1g，蜗牛酶0.1g，纤维素酶0.1g，崩溃酶0.1g，加入到含有0.3mol/lkcl和0.4mol/lmgso4的10ml水溶液中，充分溶解，再经过滤除菌，制得酶解液。
(3)将沉淀加入到酶解液中，涡旋混匀，30℃水浴酶解8h后，离心，沉淀即为蛹虫草原生质体。
实施例2
蛹虫草原生质体的制备，步骤如下：
(1)取4g蛹虫草菌体用无菌水充分洗涤，离心取沉淀。
(2)配制酶解液：取溶壁酶0.1g，蜗牛酶0.1g，纤维素酶0.1g，崩溃酶0.1g，加入到含有0.5mol/lkcl和0.2mol/lmgso4的5ml水溶液中，充分溶解，再经过滤除菌，制得酶解液。
(3)将沉淀加入到酶解液中，涡旋混匀，25℃水浴酶解3h后，离心，沉淀即为蛹虫草原生质体。
实施例3
(1)称取150mg有机-无机复合脂质溶于10ml三氯甲烷中，旋转蒸发除去三氯甲烷，圆底烧瓶瓶底形成一层透明的类脂质薄膜；将2g蛹虫草原生质体用10ml180g/l甘露醇水溶液悬浮，加入到所得的类脂质薄膜中，充分搅拌混匀并迅速加热到48℃，热激20s同时水浴超声；迅速冷却至4℃，静置12h后，经脂质体挤出器(聚碳酸酯滤膜孔径为1.0μm)挤出，得到粒径均一的蛹虫草原生质体硅质体悬液。
(2)按照质量比为2:3:8称取壳聚糖(粘均分子量5.0×105，脱乙酰度85％)、聚乙烯醇(重均分子量为200000)和聚氧化乙烯(重均分子量为1×107)以总质量浓度1.8％完全溶解于体积溶度为2％的乙酸水溶液中，加入乙酸水溶液质量体积比为1.5g/l的甘油，再按照蛹虫草原生质体硅质体悬液与乙酸水溶液的体积比1:400加入步骤(1)中制得的硅质体悬液，4℃搅拌至完全混匀，采用静电纺丝法，利用铝箔作为接收装置，接收距离设置为20cm，电压为20kv，以1ml/h的喷射流量制得纳米纤维膜，测定其孔隙率为97.8％，将其成卷填入层析柱中，见图2；
(3)按照10g/l葡萄糖，25g/l核糖，0.5g/l磷酸二氢钾，0.8g/l硫酸镁，5g/l酵母粉，4g/l腺嘌呤的浓度配制混合水溶液，将溶液ph值调至5.8，经过滤除菌后，以0.2ml/h的流速流经步骤(2)的层析柱，见图1，同时在层析柱中以2.0v/v·min速率通入无菌空气，夹套水温控制在27℃，收集流出液利用hplc测定虫草素浓度。
连续操作30d，虫草素平均浓度达到1.68g/l，即该方法的生产率为1.68g/(l·h)。
实施例4
(1)称取100mg有机-无机复合脂质溶于10ml三氯甲烷中，旋转蒸发除去三氯甲烷，圆底烧瓶瓶底形成一层透明的类脂质薄膜；将3g蛹虫草原生质体用10ml100g/l甘露醇水溶液悬浮，加入到所得的类脂质薄膜中，充分搅拌混匀并迅速加热到45℃，热激10s同时水浴超声；迅速冷却至4℃，静置12h后，经脂质体挤出器(聚碳酸酯滤膜孔径为0.5μm)挤出，得到粒径均一的蛹虫草原生质体硅质体悬液；
(2)按照质量比为1:2:7称取壳聚糖(粘均分子量5.0×105，脱乙酰度80％)、聚乙烯醇(重均分子量为180000)和聚氧化乙烯(重均分子量为1×106)以总质量浓度1.5％完全溶解于体积浓度为2％的乙酸水溶液中，加入乙酸水溶液质量体积比为1g/l的甘油，再按照蛹虫草原生质体硅质体悬液与乙酸水溶液的体积比为1:100加入步骤(1)中制得的硅质体悬液，4℃搅拌至完全混匀，采用静电纺丝法，利用铝箔作为接收装置，接收距离设置为5cm，电压为3kv，以1ml/h的喷射流量制得纳米纤维膜，测定其孔隙率为95.8％，将其成卷填入层析柱中；
(3)按照10g/l葡萄糖，20g/l核糖，0.5g/l磷酸二氢钾，0.5g/l硫酸镁，5g/l酵母粉，4g/l腺嘌呤的浓度配制混合溶液，将溶液ph值调至5.0，经过滤除菌后，以0.2ml/h的流速流经步骤(2)的层析柱，同时在层析柱中以1.0v/v·min速率通入无菌空气，夹套水温控制在25℃，收集流出液利用hplc测定虫草素浓度。
连续操作30d，虫草素平均浓度达到1.08g/l，即该方法的生产率为1.08g/(l·h)。
实施例5
(1)称取200mg有机-无机复合脂质溶于10ml三氯甲烷中，旋转蒸发除去三氯甲烷，圆底烧瓶瓶底形成一层透明的类脂质薄膜；将1g蛹虫草原生质体用10ml180g/l甘露醇水溶液悬浮，加入到所得的类脂质薄膜中，充分搅拌混匀并迅速加热到50℃，热激30s同时水浴超声；迅速冷却至4℃，静置12h后，经脂质体挤出器(聚碳酸酯滤膜孔径为0.8μm)挤出，得到粒径均一的蛹虫草原生质体硅质体悬液；
(2)按照质量比为2:4:9称取壳聚糖(粘均分子量5.0×105，脱乙酰度80％)、聚乙烯醇(重均分子量为180000)和聚氧化乙烯(重均分子量为1×106)以总质量浓度为2％完全溶解于体积溶度为2％的乙酸水溶液中，加入乙酸水溶液质量体积比为2g/l的甘油，再按照蛹虫草原生质体硅质体悬液与乙酸水溶液的体积比为1:500加入步骤(1)中制得的硅质体悬液，4℃搅拌至完全混匀，采用静电纺丝法，利用铝箔作为接收装置，接收距离设置为30cm，电压为30kv，以5ml/h的喷射流量制得纳米纤维膜，测定其孔隙率为92.8％，将其成卷填入层析柱中；
(3)按照15g/l葡萄糖，30g/l核糖，1.0g/l磷酸二氢钾，0.8g/l硫酸镁，8g/l酵母粉，8g/l腺嘌呤的浓度配制混合溶液，将溶液ph值调至5.6，经过滤除菌后，以0.5ml/h的流速流经步骤(2)的层析柱，同时在层析柱中以1.5v/v·min速率通入无菌空气，夹套水温控制在26℃，收集流出液利用hplc测定虫草素浓度。
连续操作30d，虫草素平均浓度达到1.02g/l，即该方法的生产率为1.02g/(l·h)。对比例1
(1)将3g蛹虫草原生质体用5ml180g/l甘露醇水溶液悬浮，制得蛹虫草原生质体悬液；
(2)按照质量比为1:2:7称取壳聚糖(粘均分子量5.0×105，脱乙酰度85％)、聚乙烯醇(分子量为200000)和聚氧化乙烯(分子量为1×107)以总质量浓度为1.8％完全溶解于体积溶度为2％的乙酸水溶液，加入乙酸水溶液质量体积比为2g/l的甘油，再按照蛹虫草原生质体悬液与乙酸水溶液的体积比为1:400加入步骤(1)中制得的蛹虫草原生质体悬液，4℃搅拌至完全混匀，采用静电纺丝法，利用铝箔作为接收装置，接收距离设置为20cm，电压为20kv，以1ml/h的喷射流量制得纳米纤维膜，测定其孔隙率为97.8％，将其成卷填入层析柱中；
(3)按照10g/l葡萄糖，25g/l核糖，0.5g/l磷酸二氢钾，0.8g/l硫酸镁，5g/l酵母粉，4g/l腺嘌呤的浓度配制混合溶液，将溶液ph值调至5.8，经过滤除菌后，以0.2ml/h的流速流经步骤(2)的层析柱，同时在层析柱中以2.0v/v·min速率通入无菌空气，夹套水温控制在27℃，收集流出液利用hplc测定虫草素浓度。
连续操作30d，虫草素平均浓度为0.08g/l，即该方法的生产率为0.08g/(l·h)。对比例2
(1)将3g蛹虫草菌体用5ml水溶液悬浮，制得蛹虫草菌体悬液；
(2)按照质量比为1:2:7称取壳聚糖(粘均分子量5.0×105，脱乙酰度85％)、聚乙烯醇(分子量为200000)和聚氧化乙烯(分子量为1×107)以总质量浓度为1.8％完全溶解于体积溶度为2％的乙酸水溶液，加入乙酸水溶液质量体积比为2g/l的甘油，再按照蛹虫草菌体悬液与乙酸溶液的体积比为1:400加入步骤(1)中制得的蛹虫草菌体悬液，4℃搅拌至完全混匀，装入注射器，滴入1mol/lnaoh溶液中成微球，将微球用水洗至中性，测定微球孔隙率为82.3％，装入层析柱中；
(3)按照10g/l葡萄糖，25g/l核糖，0.5g/l磷酸二氢钾，0.8g/l硫酸镁，5g/l酵母粉，4g/l腺嘌呤的浓度配制混合溶液，将溶液ph值调至5.8，经过滤除菌后，以0.2ml/h的流速流经步骤(2)的层析柱，同时在层析柱中以2.0v/v·min速率通入无菌空气，夹套水温控制在27℃，收集流出液利用hplc测定虫草素浓度。
连续操作30d，虫草素平均浓度为0.12g/l，即该方法的生产率为0.12g/(l·h)。
本发明提供了一种自组装硅质体静电纺丝纤维膜固定化细胞生产虫草素的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。