本发明涉及医药技术领域，具体涉及从中国波状网翼藻dictyopterisundulataholmes中提取分离得到的、具有抗肿瘤作用的新天然药物，该药物为新甾体类化合物网翼藻素j(dictyopterisinj)。
背景技术：
随着社会的进步，由此造成的工作压力不断加大以及全球环境不断恶化，恶性肿瘤的发病率呈逐年上升趋势，恶性肿瘤已成为危害人类健康的重大疾病之一。据世界卫生组织(who)最新公布数据表明，全球每年有880万人死于癌症，占全球每年死亡总人数近六分之一。每年有1400多万新发癌症病例，预计到2030年这一数字将增加到2100多万，癌症将超越心血管疾病成为人类的头号杀手。寻找和开发高效低毒的抗肿瘤药物已成为世界医药界最重大的研究课题之一。
海洋生物基于其特殊的生态环境，从而成为发现具有新颖结构、显著生物活性天然药物先导化合物的重要源泉。据marilet数据库记载，目前已从种类繁多的海洋生物中发现了22000余种新的海洋天然产物，其中具有显著特殊生理活性和临床应用前景的海洋药物先导化合物就有数百种。我国拥有极其丰富的海洋生物资源，其中已查明的生物种类就达2万余种，这为我国海洋创新药物研究提供了丰富的物质基础。因此，从我国海洋生物资源中寻找创新药物先导化合物具有巨大的潜力。
网翼藻属(dicyopteris)海藻为网地藻科(dictyotaceae)海洋植物(褐藻门，网地藻目)，全球约有35余种，其中我国海域已查明的有5种，分布于从潮间带到深达数百米的海底，以及从炎热的热带海域到寒冷的两极海区。在过去的六十多年中，国内外科研工作者已对二十余种网翼藻属海藻进行了系统的化学成分及其生物活性研究，从中发现了倍半萜、降倍半萜、倍半萜酚类、c11碳水化合物、c11含硫化合物、甾体及脂肪酸等七种结构类型的化合物。其中倍半萜是该属海藻最主要的化学成分。现代药理活性研究表明，网翼藻属海藻中发现的部分化合物还具有抗炎、抗菌、拒食、杀虫、神经损伤保护及细胞毒等多样的生物活性。
波状网翼藻dictyopterisundulataholmes为网翼藻属海藻，主要分布于我国辽宁、福建、台湾及广东沿海，对其化学成分及药理作用研究报道较少。近年来我们一直致力于从我国海洋生物中寻找生物活性物质，网翼藻素j(dictyopterisinj)是从波状网翼藻中分离得到一种豆甾烷型甾体类化合物。网翼藻素j是新化合物，其抗肿瘤活性未见报道。
技术实现要素：
本发明提供了一种从中国波状网翼藻(d.undulata)中提取分离得到的、具有抗肿瘤作用的新甾体类化合物——网翼藻素j(dictyopterisinj)。经药理试验研究表明，该化合物对人急性早幼粒白血病细胞(hl-60)和人肺癌细胞(a-549)显示了明显的细胞毒活性，其ic50值分别为1.17和1.60μm。
本发明的目的之一是提供新的甾体类化合物网翼藻素j。
本发明的目的之二是提供所述网翼藻素j的制备方法。
本发明的目的之三是提供所述网翼藻素j的用途。具体地说，所述网翼藻素j可用于制备抗肿瘤药物，可与其他药物制成抗肿瘤药物组合物，可与药学可以接受的辅料制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂和乳剂等剂型；其给药途径可为经口服、静脉、肌肉或皮肤给药。
根据本发明的第一个目的，本发明首次从波状网翼藻中发现了网翼藻素j，其化学结构如下所示：
根据本发明的第二个目的，本发明提供所述网翼藻素j的制备方法，它是从波状网翼藻中分离得到的，具体步骤如下：
1)制备提取物浸膏
将冷冻的波状网翼藻(d.undulata)用乙醇按常规渗漉提取，得提取液，将提取液减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏；
2)分离纯化
(1)将上述粗浸膏分散于水中成混悬液，将混悬液用乙醚萃取，所得萃取液浓缩得到乙醚提取浸膏；
(2)将乙醚浸膏进行硅胶柱层析，依次以石油醚/丙酮和二氯甲醇/甲醇梯度洗脱，根据tlc显色合并相似流份得到12个组分(a–l)；其中组分g即石油醚/丙酮体积比8:2洗脱部分经sephadexlh-20凝胶柱层析，以二氯甲烷/甲醇体积比1:1洗脱；根据tlc显色合并相似流份得到4个组分(g1-g4)，组分g2(即二氯甲烷/甲醇体积比1:1洗脱体积为75～90ml洗脱部分)再经硅胶柱层析，以石油醚/丙酮体积比8:2洗脱，最后经半制备型hplc，以甲醇/水90:10体积比洗脱，得到本发明化合物网翼藻素j。
在上述制备方法中，在制备提取物浸膏步骤中，所述提取采用的乙醇为95％乙醇。
在上述制备方法中，在分离步骤中，石油醚/丙酮梯度洗脱的浓度依次为体积比100:0、90:10、80:20、70:30、50:50和40:60。二氯甲醇/甲醇梯度洗脱的浓度依次为体积比70:30、60:40和50:50。
在上述制备方法中，在分离步骤中，所述半制备型hplc的色谱柱的填料为rp-18。
根据本发明的第三个目的，本发明提供了所述网翼藻素j可用于制备抗肿瘤药物，可与其他药物制成抗肿瘤药物组合物。
为了达到应用目的，可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂和乳剂等形式。其给药途径可为经口服、静脉、肌肉或皮肤给药。
具体实施方式
在如下的实施例中所指的网翼藻素j的化学结构式(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)：
实施例1：所述网翼藻素j的制备
1.制备波状网翼藻提取物浸膏
(1)制备提取液
将冷冻的中国波状网翼藻(d.undulata)(采自广东湛江沿海)1.8kg(湿重)分别用5l95％乙醇渗漉提取三次，每次渗漉2天，合并提取液；
(2)制备提取物浸膏
将上述提取液在温度≤45℃减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏174.5g；
2.分离纯化
1)将上述粗浸膏分散于2l水中成混悬液，将混悬液用乙醚(1.5l)萃取四次，所得萃取液减压浓缩得到乙醚提取浸膏(54.3g)；
2)将乙醚浸膏进行硅胶柱层析，依次以石油醚/丙酮和二氯甲醇/甲醇梯度洗脱；石油醚/丙酮梯度洗脱的浓度依次为体积比100:0、90:10、80:20、70:30、50:50和40:60，二氯甲醇/甲醇梯度洗脱的浓度依次为体积比70:30、60:40和50:50。根据tlc显色合并相似流份得到12个组分(a–l)；
3)组分g即石油醚/丙酮体积比8:2洗脱部分经sephadexlh-20凝胶柱层析【层析柱规格：3.1(直径)×120(长度)cm；sephadexlh-20凝胶干重：150g】，以二氯甲烷/甲醇体积比1:1洗脱，根据tlc显色合并相似流份得到4个组分(g1-g4)；
4)组份g2，即二氯甲烷/甲醇体积比1:1洗脱体积为75～90ml洗脱部分，再经硅胶柱层析，以石油醚/丙酮体积比8:2洗脱，最后经半制备型hplc(色谱柱的填料为rp-18)，以甲醇/水体积比90:10洗脱，流速为3.5ml/min，保留时间为16.8min，得到本发明化合物网翼藻素j，经鉴定为新化合物。
3.结构鉴定
按常规经nmr、hresims、uv及ir等多种现代光谱技术，确定了化合物网翼藻素j的化学结构，其理化性质如下：
白色粉末,分子式为c29h46o3；
比旋光度
紫外光谱uv(meoh)λmax(logε):234(3.88)nm；
红外光谱ir(kbr)νmax:3550,1687,1598,1512,1345,1202,1030,988cm–1；
高分辨质谱hr-esi-msm/z465.3346[m+na]+(calcdforc29h46o3na,465.3345)；
核磁共振氢谱1hnmr(600mhz)及核磁共振碳谱13cnmr(150mhz)数据见表1。
表1所述网翼藻素j的1h和13cnmr(ppmincdcl3)
实施例2：所述网翼藻素j的体外抗肿瘤活性试验
细胞株：人急性早幼粒白血病细胞(hl-60)和人肺癌细胞(a-549)。
试验方法：采用芬丹明b法(srb)测定细胞生长抑制率。具体为取对数生长期的hl-60和a-549细胞株，用含50u/ml苄青霉素钠、50μg/ml链霉素和10％fcs的dmem/f12培养基配制成3.0×105/ml的细胞悬液，接种到96孔板中，每孔100μl。在37℃细胞培养箱中过夜培养后加入含抗生素无血清dmem/f12培养基稀释的不同浓度的待测样品溶液100μl，继续培养30分钟后，将细胞移入5％co2/95％空气的培养箱中孵育48小时。将96孔板各孔接种细胞加100μl20％tca溶液，在4℃固定1小时，去除上清液，细胞水洗4遍，干燥后加100μl0.4％srb，室温下染色12分钟，1％醋酸洗涤4遍，干燥后加入200μltris溶液(10nm,ph7.4)溶解，使细胞中的srb全部溶出，室温下充分振摇5分钟后使用酶标仪在波长490nm下测定给药孔和空白孔od值。细胞生长抑制率＝(1－用药组平均od值/对照组孔od值)×100％
试验结果的评判与解释：细胞半数生长抑制时的药物浓度ic50按照量效数据进行换算。每个实验重复三次，吸收值差异小于5％，ic50差异小于30％。以ic50≤20μg/ml为有效标准。
试验结果：结果如表2所示，本发明化合物网翼藻素j对人急性早幼粒白血病细胞(hl-60)和人肺癌细胞(a-549)显示了明显的细胞毒活性，其ic50值分别为1.17和1.60μm。
试验结论：通过分子生物学试验，可以看出化合物网翼藻素j对人急性早幼粒白血病细胞(hl-60)和人肺癌细胞(a-549)显示了明显的细胞毒活性。因此，本发明的网翼藻素j可用于制备抗肿瘤药物，可与其他药物制成抗肿瘤药物组合物。
表2网翼藻素j的细胞毒试验结果(ic50值，μm)
*阳性对照药。