本发明属于植物病害生物防治
技术领域：
。具体而言，本发明涉及一株荧光假单胞菌及其在防治核桃黑斑病中的应用，以及采用该荧光假单胞菌制备的生物防治制剂。
背景技术：
：核桃黑斑病[xanthomonasjugandis(pierce)dowson]，又名核桃黑腐病，在欧美一些国家发病率较高。在我国，该病广泛分布于河北、山东、山西、辽宁、河南、江苏、浙江、四川、云南、山西、甘肃等省核桃产区。核桃黑斑病由核桃黄极毛杆菌[xanthomonasjugandis(pierce)dowson]引起，主要危害叶片、嫩枝、幼果及花器，每年4月～8月发病。叶片感病后，在叶片上出现圆形及多角形小褐斑，严重时相连成片，病斑外围有水渍状晕圈；枝梢上病斑长形，黑褐色，稍凹陷，严重时因病斑扩展包围枝条而使上段枯死；花序受侵后，产生黑褐色水渍状病斑；幼果受害时，果面发生黑色小斑点，无明显边缘，逐渐扩大成片变黑，并深入果肉，使整个果实连同核仁全部变黑腐烂脱落。近年来由于我国核桃栽培面积的增大，核桃黑斑病病害问题也日渐突出，在花期降雨偏多的年份更为严重，该病导致落果严重，严重时落果率达60％以上，甚至绝收。目前防治核桃黑斑病主要以化学农药为主，但化学农药的高残留对环境的污染严重。大量农药挥发到空气中、流入水体中、沉降聚集在土壤中，污染农畜渔果产品，并通过食物链的富集作用转移到人体内，对人体产生危害，因而目前化学防治方法仍然不能行之有效地解决核桃细菌性黑斑病问题。生物防治是利用物种间的拮抗作用来减少病害的发生，对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性，因而具有化学杀菌剂不具有的优势，正逐步成为代替化学杀菌剂的最佳方式。而获得高效拮抗菌是生物防治的基础。荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)属革兰氏阴性杆状细菌，常见于植物根围和土壤中，是作为植物根际促生细菌中研究较多的一种细菌，由于其繁殖速度快、适应能力强、易于人工培养、制剂稳定、施用方便、不污染环境、防治多种植物病害等优点，我国农业部已将其列为可注册登记的微生物农药和肥料品种之一，在全国范围内推广使用。由于其能产生一种或多种抗生素，所以对植物病害，尤其是土传病害如猝倒病、根腐病、枯萎病等均有很好的防治作用，是一类重要的有益微生物资源，在农业生产上具有非常重要的意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一株用于高效防治核桃黑斑病的新的微生物——荧光假单胞菌菌株gh2-1。本发明的荧光假单胞菌菌株具有生长速度快、抗逆性强，在核桃表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)菌株gh2-1，是从山东省青岛市莱西市莱西湖泥中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmccno.14743。其具有以下生物学特性：在牛肉膏培养基上菌落微隆起，淡黄色，边缘呈波浪花纹向外扩展状，表面较湿润，易用接种针挑起，产生水溶性黄绿色色素，紫外光斜光照射下可见黄绿色荧光；镜检，菌体细胞呈杆状，具极生鞭毛，能运动；经革兰氏染色呈阴性(以大肠杆菌为对照)；不产芽孢和荚膜。本发明荧光假单胞菌(p.fluorescens)菌株gh2-1的培养方法或繁殖方法包括：(1)普通培养保存采用牛肉膏培养基，配方为：牛肉浸膏3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml，ph调至7.4～7.6；(2)实验室液体培养采用牛肉膏液体培养基，配方为：牛肉浸膏3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，ph调至7.4～7.6；(3)固体培养基配方：固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.8∶1.2；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝55∶25∶17∶2；所述无机盐按质量百分比计为，20％磷酸二氢钾，5％硫酸镁，10％硫酸铵，65％轻质碳酸钙。(4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方本发明还提供一种用于防治核桃黑斑病的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的荧光假单胞菌(p.fluorescens)菌株gh2-1。并且，本发明还提供了一种用于防治核桃黑斑病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有黑斑病病的核桃植株施用上述荧光假单胞菌(p.fluorescens)菌株gh2-1或者上述生物防治制剂。本发明也提供了上述荧光假单胞菌菌株或者上述生物防治制剂在防治核桃黑斑病中的用途。本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：(1)制备所述荧光假单胞菌菌株gh2-1的种子液；(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，25～27℃下恒温培养；(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温25～27℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：(1)将所述荧光假单胞菌菌株gh2-1移植到牛肉膏液体培养基，25～27℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，25～27℃下振荡培养3～5d；(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至大量发酵培养基，室温25～27℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养5～6d。其中，步骤(1)中的牛肉膏液体培养基，配方为牛肉浸膏3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，ph调至7.4～7.6。步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐组成，所述固料和无机盐的质量比为98.8∶1.2；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝55∶25∶17∶2；所述无机盐按质量百分比计为，20％磷酸二氢钾，5％硫酸镁，10％硫酸铵，65％轻质碳酸钙。步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。实验表明，本发明的荧光假单胞菌菌株具有生长速度快、抗逆性强，在核桃表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该荧光假单胞菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治核桃黑斑病害，还能有效促进核桃生长，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治核桃黑斑病。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围内。实施例11、荧光假单胞菌(p.fluorescens)gh2-1的分离与纯化本发明的荧光假单胞菌(p.fluorescens)gh2-1是于2013年5月从山东省青岛市莱西市莱西湖湖泥中采用稀释平板法和平板划线法于分离获得的，分离方法为：(1)荧光假单胞菌的分离泥样的采集，在山东省莱西市采集莱西湖湖泥，混匀，带回室内暂存于4℃温箱中。称10g泥样于90ml无菌水中，置于28℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于30℃水浴锅中孵育30min，取100μl10-2、10-3、10-4稀释液涂布于牛肉膏培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在26℃培养2d后挑取牛肉膏培养基上的不同形态的微生物菌落于牛肉膏培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化荧光假单胞杆菌，分别编号保存。(2)核桃黑斑病高效拮抗荧光假单胞菌的筛选①初筛：采用对峙培养法，制备pda(potatodextroseagar)平板，用打孔器在荧光假单胞菌、核桃黑斑病原菌边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，28℃恒温培养，逐日观察荧光假单胞菌对病原菌的抑制作用。②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的荧光假单胞菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的荧光假单胞菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治核桃黑斑病的荧光假单胞菌(p.fluorescens)gh2-1。实验证明，该荧光假单胞菌原粉在防治核桃黑斑病中显示出非常高效的防治效果，使得核桃长势良好。因而，本发明的荧光假单胞菌是具有广泛应用前景的荧光假单胞菌新菌株，可以用于制备防治核桃黑斑病病害的生物防治制剂。2、菌株鉴定(1)微生物学特性：在牛肉膏培养基上菌落微隆起，淡黄色，边缘呈波浪花纹向外扩展状，表面较湿润，易用接种针挑起，产生水溶性黄绿色色素，紫外光斜光照射下可见黄绿色荧光；镜检，菌体细胞呈杆状，具极生鞭毛，能运动；经革兰氏染色呈阴性(以大肠杆菌为对照)；不产芽孢和荚膜。(2)分子生物学特性荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)菌株gh2-1的16srrna基因序列测定结果如下：tagactagctacttctggtgcaacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgacattctgattcgcgattactagcgattccgacttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccggactacgatcggttttatgggattagctccacctcgcggcttggcaaccctttgtaccgaccattgtagcacgtgtgtagcccaggccgtaaggggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctccttagagtgcccaccattacgtgctggtaactaaggacaagggttgcgctcgttacgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtctcaatgttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttcattggatgtcaaggcctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcaacttaatgcgttagctgcgccactaagagctcaaggctcccaacggctagttgacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagtgtcagtatcagtccaggtggtcgccttcgccactggtgttccttcctatatctacgcatttcaccgctacacaggaaattccaccaccctctaccatactctagcttgtcagttttgaatgcagttcccaggttgagcccggggatttcacatccaacttaacaaaccacctacgcgcgctttacgcccagtaattccgattaacgcttgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacagagttagccggtgcttattctgtcggtaacgtcaaaattgcagagtattaatctacaacccttcctcccaacttaaagtgctttacaatccgaagaccttcttcacacacgcggcatggctggatcaggctttcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcagttccagtgtgactgatcatcctctccggcccagttacggatcgtcgccttggtgagccattacctcaccaactagctaatccgacctaggctcatctgatagcgcaaggcccgaaggtcccctgctttctcccgtaggacgtatgcggtattagcgttcctttcgaaacgttgtcccccactaccaggcagattcctaggcattactcacccgtccgccgctgaatccaggagcaagctcctt。(3)细胞形态和理化实验结果表1荧光假单胞菌(p.fluorescens)gh2-1的细胞形态和理化实验结果实验项目结果实验项目结果革兰氏染色-碳水化合物产酸+细胞形状杆状葡萄糖+细胞直径﹥1μm-木糖+鞭毛染色+l-阿拉伯糖+运动性+甘露醇-类脂粒染色-乳糖-荧光色素+发酵葡萄糖产气+接触酶+利用柠檬酸盐+氧化酶+50℃生长+厌氧生长-ph5.7生长+vp试验+7％nacl生长+vp﹤ph6+淀粉水解-vp﹥ph7-分解酪素+硝酸盐还原+水解明胶+实施例21、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)菌株gh2-1发酵过程牛肉膏液体培养基配方为：牛肉浸膏3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，ph调至7.4～7.6。固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝55∶25∶17∶2；无机盐溶液为按质量百分比，20％磷酸二氢钾，5％硫酸镁，10％硫酸铵，65％轻质碳酸钙；固液比为98.8∶1.2(质量比)。荧光假单胞菌(p.fluorescens)菌株gh2-1大量固体发酵过程：①菌种种子液培养将荧光假单胞菌菌株(p.fluorescens)gh2-1从试管斜面中挑取少量细菌，移至牛肉膏液体培养基中，26℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液。②固体生产菌种的培养将种子液按10％的比例接种到固体培养基(500ml三角瓶)中，26℃恒温培养3～5d，中间多次振荡。③大量固体发酵将②中固体培养的培养物用无菌水按1∶15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，出去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1∶6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(26℃和相对湿度85％以上)中发酵培养5～6d，得到发酵液，发酵液活性菌可达到30～40亿/克(活菌数cfu/g)。进一步制成荧光假单胞菌原粉，活性菌可达到200～250亿/克(cfu/g)。为了明确荧光假单胞菌(p.fluorescens)菌株gh2-1发酵液对核桃黑斑病的防治效果，为其推广应用提供依据。我们于2016年4月～7月在济南市长清区双泉镇刀山峪村进行试验，现将试验结果报告如下：1供试材料及方法1.1供试药剂按本发明实施例1发酵方法生产的荧光假单胞菌(p.fluorescens)菌株gh2-1发酵液，活性菌为35亿/克；72％农用硫酸链霉素可湿性粉剂(成都惠普生物工程有限公司生产，市售)。1.2试验材料与防治对象试验材料为核桃；防治对象为核桃黑斑病[xanthomonasjugandis(pierce)dowson]。1.3试验地情况试验地设在济南市长清区双泉镇刀山峪村费县芍药山核桃产区。在该地区，一般植株核桃黑斑病受害率在60％～70％，果实受害率10％～30％，严重时在60％以上，造成果实变黑早落，出仁率含油量均降低，严重影响核桃的产量和品质；苗期叶片受害比大树重，病苗率往往高达80％。试验土壤类型为褐土，有机质含量为0.75％，ph值为6.8，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时核桃黑斑病处于发病初期。1.4试验设计及安排本试验共3个处理，分别为荧光假单胞菌(p.fluorescens)菌株gh2-1发酵液10倍、72％农用硫酸链霉素可湿性粉剂4200倍液、不施药清水作对照，每个处理4次重复，每个处理60株。于2016年4月11日、5月16日、6月15日和7月10日各喷洒一次，喷药器械为工农—16型喷雾器。1.5试验调查及计算方法1.5.1气象条件第1次施药(4月11日)当日多云，风力3级，最高气温为21℃，最低气温为9℃，相对湿度为55％。第2次施药(5月16日)，当日晴，风力3级，最高气温为26℃，最低气温为13℃，相对湿度为60％；第3次施药(6月15日)当日晴，风力3级，最高气温为32℃，最低气温为20℃，相对湿度为67％；第4次施药(7月10日)当日多云，风力3级，最高气温为31℃，最低气温为22℃，相对湿度为80％。1.5.2药效及安全性调查药效调查：最后一次施药后14d进行调查。每个处理调查50株，调查植株叶片，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察核桃的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。核桃黑斑病分级标准：0级：叶片无病斑。1级：病斑面积占叶片面积的10％以下。2级：病斑面积占叶片面积的10％～20％。3级：病斑面积占叶片面积的20％～50％。4级：病斑面积占叶片面积的50％～80％。5级：病斑面积占叶片面积的80％以上，枯死。1.5.3药效计算方法防治效果按式(1)、(2)计算：式中：ck0——空白对照区施药前病情指数；ck1——空白对照区施药后病情指数；pt0————药剂处理前施药前病情指数；pt1————药剂处理后施药后病情指数。1.5.4对核桃的直接影响观察药剂对核桃有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对核桃长势的影响。用下列方式记录药害：(a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高、结实率。(b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：①按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以—、+、++、+++、++++表示。药害分级方法：—：无药害；+：轻度药害，不影响植物生长；++：中度药害，可复原，不会降低植物生物量；+++：中度药害，影响植物正常生长，对植物生物量造成一定程度的降低；++++：严重药害，植物生长受阻，植物生物量降低严重。②将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。同时，要准确描述植物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)。2结果2.1供试药剂对核桃黑斑病的防治效果三种药剂处理前核桃黑斑病病害情况如表2所示，三种药剂处理后对核桃黑斑病的防治效果如表3所示。表3结果显示，荧光假单胞菌(p.fluorescens)菌株gh2-1发酵液和72％农用硫酸链霉素可湿性粉剂对核桃黑斑病均具有较好的防治效果，其中前者的防治效果达到70％以上。从核桃黑斑病田间试验的病情指数来看(表3)，最后一次施药后14d，荧光假单胞菌(p.fluorescens)gh2-1防治效果为76.70％，明显高于72％农用硫酸链霉素可湿性粉剂55.66％的防治效果。表2三种药剂处理前核桃黑斑病病害情况表3三种药剂处理后对核桃黑斑病的防治效果2.2核桃安全性调查经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，核桃生长正常，无药害产生，说明荧光假单胞菌发酵液供试浓度对核桃安全。3小结3.1从病情指数和防治效果来看，荧光假单胞菌(p.fluorescens)菌株gh2-1(保藏号cgmccno.14743)对核桃黑斑病具有较好的防治效果，最后一次施药后14d70％以上，明显好于对照药剂，差异显著。3.2从核桃长势看，荧光假单胞菌(p.fluorescens)菌株gh2-1对核桃具有明显的促进生长效果，没有药害，安全可靠。sequencelisting<110>山东省林业科学研究院<120>一株荧光假单胞菌及其在防治核桃黑斑病中的应用<130>0<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1370<212>dna<213>荧光假单胞菌（pseudomonasfluorescens）菌株gh2-1的16srrna基因序列<400>1tagactagctacttctggtgcaacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggc60ccgggaacgtattcaccgcgacattctgattcgcgattactagcgattccgacttcacgc120agtcgagttgcagactgcgatccggactacgatcggttttatgggattagctccacctcg180cggcttggcaaccctttgtaccgaccattgtagcacgtgtgtagcccaggccgtaagggg240ccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctccttaga300gtgcccaccattacgtgctggtaactaaggacaagggttgcgctcgttacgggacttaac360ccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtctcaatgttcccgaa420ggcaccaatccatctctggaaagttcattggatgtcaaggcctggtaaggttcttcgcgt480tgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagt540tttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcaacttaatgcgttagctgcgccactaag600agctcaaggctcccaacggctagttgacatcgtttacggcgtggactaccagggtatcta660atcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagtgtcagtatcagtccaggtggtcgcct720tcgccactggtgttccttcctatatctacgcatttcaccgctacacaggaaattccacca780ccctctaccatactctagcttgtcagttttgaatgcagttcccaggttgagcccggggat840ttcacatccaacttaacaaaccacctacgcgcgctttacgcccagtaattccgattaacg900cttgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacagagttagccggtgcttattctgtcg960gtaacgtcaaaattgcagagtattaatctacaacccttcctcccaacttaaagtgcttta1020caatccgaagaccttcttcacacacgcggcatggctggatcaggctttcgcccattgtcc1080aatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcagttccagtgtgact1140gatcatcctctccggcccagttacggatcgtcgccttggtgagccattacctcaccaact1200agctaatccgacctaggctcatctgatagcgcaaggcccgaaggtcccctgctttctccc1260gtaggacgtatgcggtattagcgttcctttcgaaacgttgtcccccactaccaggcagat1320tcctaggcattactcacccgtccgccgctgaatccaggagcaagctcctt1370当前第1页12