一株粘质沙雷氏菌株的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，涉及一株防治柑橘木虱的粘质沙雷氏菌株。

背景技术：

柑橘木虱是柑橘黄龙病的主要媒介昆虫，由于柑橘黄龙会导致柑橘产量和品质的下降严重威胁着柑橘种植户乃至世界柑橘产业的发展。据报道，目前全球共有50多个国家地区遭受了柑橘黄龙病的侵袭，而我国每年也有上千万的柑橘树因为感染了柑橘黄龙病而被砍伐。而作为柑橘黄龙病的主要传播媒介昆虫，对其的防控就显得极为迫切。目前，柑橘木虱的防治还是以化学防治为主，其除了会导致柑橘木虱产生抗药性以外，还会导致柑橘农药的残留限制了我国柑橘的出口以及对人体健康也存在潜在的威胁。而微生物农药源于自然，具有良好的环境兼容性，对人和天敌均安全等特点，同时其来源广，是以后农药的主要开发途径和发展方向。微生物农药在国内外引起了人们广泛的关注，并取得了较大的发展。

粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)，广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群。该菌能产生多种抗菌、抗癌、杀虫的活性物质。据报道，该菌对黄胫小车蝗，菜叶蛾等害虫均有较高的防控效果，由于该菌株能够分泌几丁质酶破坏昆虫的体壁，并分泌对昆虫具有杀灭效果的活性物质，虽然在国内外已经有相当多的这类报道，但是关于用该菌对柑橘木虱的防治却没有。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株粘质沙雷氏菌株，该菌株经过发酵后产生具有高效杀虫活性的代谢产物，该菌株对防治柑橘木虱具有良好的效果。

本发明的目的是通过一下技术方案实现的：

本发明提供的粘质沙雷氏菌株(serratiamarcescenskh-001)，已于2017年9月1日在中国典型培养物保藏中心(cctcc)登记保存，保存编号为cctccm2017465。

本发明提供的粘质沙雷氏菌株是从江西省赣南师范大学脐橙果园中采集的柑橘木虱若虫身体上分离获得的，该菌株的形态特征、生理生化特性、16srdna序列和菌种分类结果如下：

1、菌落的形态特征：本发明所述粘质沙雷氏菌株革兰氏染色为阴性短杆菌，菌落基本上是凸起，中心不透明，边缘不规则，大小为1～2.5mm。

2、菌株的生理生化特性：本发明所述粘质沙雷氏菌株28℃下培养产生红色色素，37℃下培养不产红色色素，而恢复在28℃下培养又产生红色色素。

3、16srdna序列分析：本发明所述粘质沙雷氏菌株16srdna序列如seqidno.1所示。与genbank中相关序列blast的比较结果表明其属于粘质沙雷氏菌属；应用其中的blast软件进行分析，结果表明，本发明所述粘质沙雷氏菌株测得的16srdna序列与粘质沙雷氏菌serratiamarcescens(straind，strainb3r3，strain35dr，strainps1，strainsm2611等)的16srdna序列相似性达99.0％。

与现有技术相比，本发明的优点为：

(1)本发明所述的粘质沙雷氏菌株可被开发为生防菌制剂用于对柑橘木虱的生物防控，较目前防治柑橘木虱的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性的特征；

(2)本发明所述的粘质沙雷氏菌株对柑橘木虱具有强致病力，杀虫致死率可达86.67％；

(3)本发明所述的粘质沙雷氏菌株培养快，操作简单。

附图说明

图1本发明提供的粘质沙雷氏菌株在lb培养基上的培养特征图。

图2本发明提供的粘质沙雷氏菌株菌悬液稀释涂布图。

图3本发明提供的粘质沙雷氏菌对柑橘木虱若虫的致病症状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：昆虫病原菌的分离和筛选

(1)菌株的分离纯化：

从江西省赣州市赣南师范大学病虫害实验室内饲养的柑橘木虱体色全红的自然发病虫体，用体积浓度75％的乙醇水溶液表面消毒5min后，在超净工作台内用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干虫体上的水分，然后将其放于在lb固体培养基上，在28℃培养箱中培养24h后，挑取红色的菌落，在进行分离纯化培养。挑选分离纯化的单一菌落保存在lb培养基上，置于4℃冰箱中保存。

lb固体培养基配置方法：在1000ml蒸馏水中加入蛋白胨10g、酵母提取粉5g、氯化钠10g，调节ph＝7，121℃，高温灭菌20min。

(2)致病菌的筛选

挑选上述分离纯化保存的单一菌落，接种于5ml的液体lb培养基中，在25℃下培养8h后，按5％接种量接种于250ml含50mllb液体培养基中，过夜培养12h。用移液枪取过夜培养的菌液1ml于灭菌的1.5ml离心管内。用毛笔挑取30头健康的五龄柑橘木虱若虫，置于柑橘嫩叶上，嫩叶下垫有用蒸馏水润湿的滤纸。用微量进样器在每头柑橘木虱若虫腹部滴0.4μl离心管内的菌液，以未接菌的lb液体培养基作为对照。以上操作均在超净工作台内进行。将滴加了菌液的柑橘木虱若虫放入培养箱中，25℃下培养24h后，观察木虱的死亡情况，挑选变红的柑橘木虱若虫，比较再分离的病菌与初始病菌的形态特征和培养特征。

通过以上操作，筛选出符合科赫氏法则的对柑橘木虱具致病性的菌株，排除从柑橘木虱虫体上分离到的腐生菌等非致病菌。通过筛选，认证，获得1株菌株，该菌株对柑橘木虱具有强致病力。

实施例2：菌株的鉴定

(1)菌株的生理生化鉴定

将实施例1获得的菌株涂布于lb固体培养基上，28℃恒温培养24h，该菌株平板生长见图1。该菌株的菌落基本上是凸起，中间不透明，边缘不规则，大小为1-2.5mm，均能产生红色色素。该菌株在lb固体培养基上37℃培养，该菌株的菌落为白色。

(2)菌株的序列分析

挑取1个实施例1获得的菌株单菌落接种于5ml的lb液体培养基中，28℃、180rpm过夜培养12h，取新鲜菌液，12000rpm、4℃离心10min，收集湿菌体。按tianampbacteriadnakit细菌基因组dna提取试剂盒的提取方法，提取上述湿菌体基因组dna并用通用的细菌特异引物进行16srdna的pcr扩增。将pcr扩增得到的基因组dna的经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条1500bp左右的特异性片段，测定该片段序列，结果表明，测得实施例1获得的菌株的16srdna为1462bp。测得的16srdna全序列，见seqidno.1，提交genbank，应用其中的blast软件进行分析。结果表明，实施例1获得的菌株测得的16srdna序列与粘质沙雷氏菌serratiamarcescens(straind，strainb3r3，strain35dr，strainps1，strainsm2611)的16srdna序列相似性达99.0％。

根据常见细菌系统鉴定手册(东秀珠，蔡妙英，等.常见细菌系统鉴定手册[m].北京：科学出版社，2001.)中沙雷氏细菌的鉴定方法对实施例1获得的菌株进行了生理生化鉴定。鉴定结果如下：

注：“+”代表阳性反应，“-”代表阴性反应。

结合以上实施例1获得的菌株的生理生化特征及16srdna序列分析，将实施例1获得的菌株鉴定为粘质沙雷氏菌株。

实施例3菌悬液的制备

(1)平板培养

将上述粘质沙雷氏菌株稀释划线接种至lb固体培养基上，28℃恒温培养24h，然后置于4℃保存。

(2)种子液培养：从平板上挑取上述粘质沙雷氏菌株单菌落接种于5mllb液体培养基，28℃、180rpm振荡培养6h，获得种子液。

(3)发酵培养：取500μl种子液接种于50mllb液体培养基中扩大培养，28℃、180rpm振荡培养12h，获得发酵培养液。将发酵培养液在4℃、12000rpm下进行离心，去掉上清，然后用生理盐水进行重悬，并按照上面的步骤重悬2次。通过用0.8％的生理盐水对菌悬液进行梯度稀释，其稀释梯度为10^-1，10^-2，10^-3,10^-4，10^-5，10^-6，10^-7,分别稀释三次，取10^-7稀释倍数的菌液200μl在lb固体培养基上进行涂布，置于28℃下培养24h。粘质沙雷氏菌株的稀释涂布菌落见图2。

实施例4：粘质沙雷氏菌株的菌悬液对柑橘木虱的致病性检测

用毛笔挑取5龄柑橘木虱若虫，将其小心地放在脐橙嫩叶上，脐橙嫩叶放在培养皿中下垫有润湿的滤纸和棉花。利用微量进样器取0.4μl实施例3中制备粘质沙雷氏菌株的菌悬液，滴在柑橘木虱若虫腹部。处理完后用保鲜膜盖好，在膜上用昆虫针扎15-20个小孔。然后，置于温度25±1℃、光照为16h：8h(l:d)的光照培养箱中。每个处理10头柑橘木虱若虫，重复三次。24h后观察记录死亡虫数、活虫数，计算死亡率和校正死亡率，死亡率的计算公式为：死亡率＝(虫数/实验前总虫数)*100；校正死亡率的计算公式为：校正死亡率＝(处理组死亡率-对照组死亡率)/(100-对照组死亡率)*100。柑橘木虱若虫病虫症状见图3所示，死亡率见表1所示。结果表明粘质沙雷氏菌株悬液点滴柑橘木虱若虫24h死亡率为86.67％。

表1粘质沙雷氏菌株处理后柑橘木虱若虫的死亡率

序列表

<110>赣南师范大学

<120>一株粘质沙雷氏菌株

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1462

<212>dna

<213>serratiamarccscens(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

acgacatggcgggggctttaaacatgcaagtctagcggtagcacgggggagcttgctccc60

tgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggata120

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