秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估实验装置及评估方法与流程

本发明涉及一种秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估实验装置，本发明还涉及秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估方法，属于实验设备领域。

背景技术：

秀丽线虫，亦称秀丽隐杆线虫，以细菌为食,其生命周期大约为3d,平均寿命为3周。成虫体长约1.0-1.5mm，体表有一层角质层覆盖物。作为一种模式动物,已广泛应用于当前生命科学研究的各个领域。

秀丽线虫对各种生物、化学刺激物会产生趋化作用，通过线虫对各种刺激物的反应特性加以鉴别可以实现生物检测。早先的秀丽线虫生物检测研究方法是先使用叠氮化钠将培养基上的线虫麻痹使之少动或者不动，然后再对刺激物所在的培养基材料各个区域中线虫的数量进行计数分析，以判断线虫对不同刺激物产生的趋化作用。但这种方法有很多重复性的人工操作，需要肉眼通过显微镜观察判断线虫是否死亡，耗费很多人力和时间。近年来国外学者提出了另一种方法是对整个生物活动过程进行测定，特别是秀丽线虫在培养基上活动的详细运动轨迹，例如通过显微镜记录虫体蠕动速度和虫体扭转频率等参数。moy等随后对方法进行了改进，建立了更加微型化和全自动化的高通量筛选系统，该系统主要由复杂对象分类筛选系统copas和自动图像获取处理系统biosort。使用这个系统，可以实现微型化和全自动化的384孔板采集分析的高通量筛选。但此系统价格昂贵，而且上述方法受限于摄像显微镜的数量和视野，通常只能用384孔板的微量培养基做短时间观察，而难以使用其他培养皿进行不同分组之间的秀丽线虫的大面积、长时间观察。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估实验装置及评估方法，以达到大面积长时间观察的目的。

本发明采用了如下技术方案：

本发明提供一种秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估实验装置，其特征在于，包括：观察箱体；多个摄像头，设置在所述观察箱体的顶端；多孔培养板，设置在所述观察箱体内部的底面上，所述摄像头与所述多孔培养板上的培养孔位置一一对应；中空遮光板设置在所述多孔培养板的上方，所述中空遮光板与所述观察箱体的底部之间形成光线散射腔；灯带，设置在所述光线散射腔中，环绕在所述观察箱体的底部四周。

进一步本发明的秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估实验装置，还可以具有这样的特征，还包括：遮光纸，设置在所述多孔培养板的下方。

本发明还提供一种秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估的方法，包括如下步骤：

步骤一：利用如权利要求1或2所述的丽线虫抗菌药物筛选实时评估实验装置连续拍摄线虫的形态和运动轨迹，得到原始图像；

步骤二：将原始图像转换为灰度图像；

步骤三：将灰度图像二值化；

步骤四：对二值化的图像进行降噪处理；

步骤五：对得到的一系列图像进行分析计算，得到虫卵、l1-l4期线虫数量、死亡和存活线虫数量。

进一步，本发明的秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估的方法，还可以具有这样的特征：步骤五中，通过计算图片中的曲线偏心率来判断是虫卵、死体还是活体。

进一步，本发明的秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估的方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤五中，对同一个秀丽线虫的连续图片进行偏心率的计算，排除在个图片中秀丽线虫的形态运动成直线形的干扰。

进一步，本发明的秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估的方法，还可以具有这样的特征：偏心率门限通过算法训练得到，取值范围从1～无穷大，1代表虫子正好蠕动成一个圆形，算法通过和人工观测结果的成功率对比，自动调整门限，直到识别率接近人工识别结果。

进一步，本发明的秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估的方法，还可以具有这样的特征：步骤五中，还对虫体扭动频率，虫体累计移动路程以及线虫存活率进行计算和统计。

发明的有益效果

本发明的秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估实验装置及评估方法，可实现对六孔板中线虫的运动轨迹进行清晰、连续地采集记录。并可以实现对线虫长时间、大范围运动轨迹自动化统计分析。

附图说明

图1是秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估实验装置的整体结构示意图；

图2是本发明的装置记录的存活线虫的运动形态；

图3是本发明的装置记录的死亡线虫的运动形态；

图4是对线虫的图像进行处理的流程；

图5是使用本发明的装置和方法对秀丽线虫进行抗菌药物筛选的结果图。

具体实施方式

以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。

秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估实验装置的结构如图1所示。

1.秀丽线虫抗菌药物筛选实时评估实验装置包括：

观察箱体1，使用不锈钢板焊接成型，顶部开有6个直径32毫米的观察孔，在观察孔上使用热熔胶固定了六根pvc管，以利于安装摄像头。该观察记录装置由图1所示的304不锈钢板焊接、装配制成。

观察箱体1的底部下面设置有电源6和散热风扇7，为观察箱体1的光源提供稳定的低纹波直流电源。

上层结构的正中放置六孔板5，六孔板5内含有培养基和秀丽线虫。

六孔板侧壁四周围绕一排带有发光二极管的灯带4，灯带4背面的胶水紧贴不锈钢外壳对外散热，六孔板底部也放置有一块平面光源。

遮光板3，设置在所述多孔培养板的上方，遮光板3与观察箱体1的底部之间形成光线散射腔。不锈钢遮光板3中间带有孔洞31。遮光板3与六孔板相对应的位置开有方形的孔洞31。

灯带4，设置在光线散射腔中，环绕在观察箱体的底部四周。由于灯带4为散射光源，部分光线会散射到六孔板5上方造成损失，孔洞31稍大于六孔板的外缘，该遮光板3可以将散射的光线重新聚集到六孔板的侧壁，引导光线从侧面射入六孔板5。

在六孔板5下方安装有黑色的遮光纸，下面设置有平面光源8，遮光纸的大小比六孔板略大，能够挡住平面光源8从六孔板下方直接射入的光线，未被遮光纸挡挡住的光线照射到遮光板3上，经过漫反射后从侧面照射六孔板5。侧面漫反射照明能够提高拍摄的图像质量，并且减少摄像头的镜头本身对光线的反射作用，使线虫的图像更清楚。

在观察箱的顶部，用不锈钢开孔器开6个直径φ32mm孔，开孔距离与六孔板的孔距保持一致，取φ32*1mm的pvc电工管，截取12cm左右插入开孔处，用热熔胶枪初步固定pvc管。拆除外固定装置后将摄像头2插入pvc管中。本实施方式中的摄像头采用微软lifecamcinemahd高清摄像头，由于该摄像头2具有自动对焦和录音功能，因此其麦克风部分有一定突起，正好卡住pvc管壁固定，缓慢调节摄像头、pvc管高度，使其视野完全覆盖六孔板，此时六孔板培养基距离摄像头2约5cm，摄像头自动对焦后即可成像并开始记录，最后用热熔胶枪将pvc管和摄像头固定完全。

2.进行线虫筛选实验所需的材料如下：

2.1线虫、菌株n2野生型秀丽隐杆线虫(c.elegans，bristolstrainn2)和e.coliop50由中国科学院遗传发育所惠赠。

2.2试剂、ngm培养基、m9缓冲液，叠氮钠、蛋白胨、琼脂粉(sgima公司)，其余试剂为国产分析纯。

2.3ngm培养基1000ml的ngm培养基含17g琼脂，2.5g蛋白胨，3gnacl，1mol·l^-1pbs液(ph＝6.0)25ml，入975ml蒸馏水，灭菌后加入滤膜除菌的1ml胆固醇溶液(5mg·ml^-1乙醇)，1mol·l–1cacl21ml，1mol·l^-1mgso41ml。

2.4m9缓冲液1000ml的m9缓冲液含15.12gna2hpo4·12h2o，5gnacl，3gkh2po4，0.25gmgso4·7h2o。

3.培养条件

秀丽隐杆线虫细菌感染方法。从怀孕成虫分离虫卵，在m9缓冲液中孵化过夜，得到l1期幼虫，将幼虫转移到ngm培养基的e.coli菌苔上在20℃培养箱中继续生长48h，用m9缓冲液洗脱虫体并反复清洗后，将虫体分别转移到普通琼脂平板的铜绿假单胞菌的菌苔上，在20℃培养箱中培养8h进行感染，感染后转移到六孔板的m9缓冲液中(缓冲液中加入2％蛋白胨，25m5-氟脱氧尿苷(5-fudr)，1×抗生素，以防止自我繁殖和污染)继续培养，观察记录每日死亡情况。培养板边缘用胶带密封，以防止干燥，系统可记录线虫自发活动超过21天。

4.视频记录装置的环境控制

由于线虫合适的生存温度为12-22℃，最佳培养温度为18℃，视频跟踪记录装置的温度控制显得尤为重要。上述装置的电源部分带有散热风扇，由于灯带4的发热，实测观察箱内温度较环境温度高8℃左右，为了控制温度使实验，可以将箱体放入2～8℃的冷藏冰箱内，微调冰箱温控器。经适当措施后实测观察箱内温度17±2℃，使用达到线虫培养的理想温度。六孔板的盖子在记录前应喷涂防雾液并等其干燥成膜，以防止培养基水分蒸发在盖子上凝结造成视频图像模糊。

5.数据采集与分析

线虫被培养在5的六孔微量滴定板(u型)，根据不同的实验目的加入测试物，然后放入摄影灯箱，开启光源和摄像头，使用计算机录制线虫的的自发活动视频，通常记录24小时或更长时间，并加工研究昼夜活动节律，并绘制成图。

使用两个计算机程序分别用于记录和分析视频，记录软件选用debutvideocapturesoftwareprofessional,分析软件采用labview以及matlab脚本进行视频分析，提取线虫的活动记录信息。

6.线虫运动轨迹的观察

微软摄像头自带的记录软件能够以30帧/秒的速率记录高清运动图像，因此选用了自带核心显卡的inteli5-2400处理器的笔记本电脑作为记录硬件。线虫在培养基中的移动速度是缓慢的，而且考虑到usb总线的带宽以及cpu视频压缩能力，记录线虫运动轨迹并不需要那么高的帧率，特别是以30帧/秒默认帧率存储的视频文件体积较为庞大，因此使用了录像软件debutvideocapturesoftwareprofessional进行记录。选择合适的分辨率960*720，勾选changeframerate并设置为5帧/秒，再点击设置压缩格式为h.264。图2和图3显示的是本观察箱采集线虫运动轨迹原始录像截图。如图2和图3所示，存活的线虫与死亡的线虫在形态方面有明显差异，存活的线虫形态多为s型游动的正弦状态，死亡的线虫形态多为直线型僵直状态。

通过计算照片中线虫曲线的偏心率来判断是虫卵，死体还是活体，并通过视频中提取的连续图像对比，通过相关算法提高识别精度。

偏心率门限是通过算法训练的，取值范围从1～无穷大，1代表虫子正好蠕动成一个圆形，算法通过和人工观测结果的成功率对比，可以自动调整门限，直到识别率接近人工识别结果。

连续图片中虫子的相对位置固定，但对于活体虫子由于蠕动，虫子在不同图片中的形态，即弯曲程度会不同，通过对同一个虫子的连续图片的偏心率计算，避免一幅图片中活体虫子蠕动刚好成一直线而被误判成死体。

实际使用中，可以通过外部光照刺激，促进活体虫子的蠕动，这样连续照片中更加容易捕获到同一虫子不同形态(偏心率)的照片，从而提高识别的准确率。

如图4所示，图像分析过程如下：

步骤一：利用如权利要求1或2所述的丽线虫抗菌药物筛选实时评估实验装置连续拍摄线虫的形态和运动轨迹，得到原始图像；

步骤二：将原始图像转换为灰度图像；

步骤三：将灰度图像二值化；

步骤四：对二值化的图像进行降噪处理；

步骤五：对得到的一系列图像进行分析计算，得到虫卵、l1-l4期线虫数量、死亡和存活线虫数量。

7.以铜绿假单胞菌感染对秀丽线虫生存率为例进行图像的采集和分析。

铜绿假单胞菌感染对秀丽线虫生存率的影响及药物的治疗效果，从图5可以看到，秀丽隐杆线虫被细菌感染1d后没有发现死亡，随后开始出现死亡，多次实验表明，被细菌感染后的线虫均在7d内死亡。实验结果表明，与op-50菌处理的线虫相比，铜绿假单胞菌感染线虫的生存期限明显缩短。而美罗培南药物治疗(100ug/ml)可以改善铜绿假单胞菌感染造成的线虫的生存期缩短。

8.本实施方式的作用与效果：

制作黑色背景的时候线虫对比度可以大幅提升，观察箱光源选用12v直流供电的led灯带，排除频闪干扰；灯箱内壁喷黑漆，减少箱内杂散光散射；φ32*1mm的pvc管、摄像头的正面部分涂黑漆，避免摄像头、pvc管倒映在培养基的表面上形成镜像干扰。摄像头选用带有自动对焦功能的光学玻璃镜摄像头，获得最佳观测效果。使用摄像头录像软件debutvideocapturesoftwareprofessional进行记录，以30帧/秒默认帧率记录存储。

现有的线虫培养技术主要以lb培养基为基础，六孔板由于线虫数目多，对培养基的透明度要求高，难于实时观察计数。本实验在半透明培养基配制时适当更改配方，减少半透明物质如蛋白胨的用量，并过滤除去杂质。经上述多项参数优化措施，可实现对六孔板中线虫的运动轨迹进行清晰、连续地采集记录。并可以实现对线虫长时间、大范围运动轨迹自动化统计分析。

matlab编写的图像处理程序主要用于提取线虫的运动活跃程度的数据，包括存活与否的判断、虫体扭动频率，虫体累计移动路程，以及线虫存活率的自动统计。本文通过对秀丽线虫行为模式的视频内容进行采集、记录、智能理解与统计分析，建立病原菌/药物/生物体三位一体的多重视频指标的耐药菌敏感的药物筛选评估研究体系。通过对秀丽线虫感染铜绿假单胞菌后的致死率进行评估，将此药物筛选评估研究体系，应用于敏感药物快速简便筛选，及相应的抗菌作用机制研究，具有较好的前景和临床应用价值。