一种快速测定IL‑6/IL‑6受体抗体药物生物学活性的方法与流程

本发明涉及生物药物活性检测领域，针对il-6/il-6r单克隆抗体药物生物学活性测定建立了更加快速、准确的定量检测方法。
背景技术：
：单克隆抗体已经成为全球医药市场的重要组成部分，并贡献了主要的市场扩容力量，2016年全球畅销药排名前十的重磅药中以阿达木单抗为首的单克隆抗体药物占据半壁江山。面对抗体类药物的快速发展，迫切需要建立相应的抗体药物质量评价技术体系，而活性测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。目前活性检测方法多采用基于细胞的生物活性测定方法，包括细胞增殖抑制法、细胞毒性法、补体依赖的细胞毒法、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性法和细胞elisa法。托珠单抗(tocilizumab，商品名雅美罗)是一种il-6受体阻断剂，于2010年1月8日获fda批准上市，用于治疗对抗风湿药物(dmards)应答不足的中度至重度活动性类风湿关节炎的成年患者。托珠单抗与膜型或者可溶性il-6受体结合，阻断其与il-6的结合，使il-6信号通路不能被激活，从而抑制多种免疫反应相关的机制，包括b细胞的活化和t细胞分化成炎性细胞等，可以有效改善类风湿性关节炎的症状。目前托珠单抗的生物学活性测定方法主要是细胞增殖抑制的方法，该方法依据对il-6有生长依赖性的人白血病细胞系kt-3/ds-1，加入托珠单抗和il-6，两者竞争性结合细胞表面il-6受体，孵育72小时后，通过测定细胞的数量来定量托珠单抗的细胞增殖抑制作用。该方法实验周期长(托珠单抗作用时间72小时，加入底物后孵育时间3小时)，变异较大。本发明采用转基因细胞测活方法，实验当天即可获得结果，实验周期短，操作简便，并且避免了长时间孵育所带来的细胞污染可能性等客观因素的问题。技术实现要素：本发明提供了一种快速测定il-6/il-6r抗体药物生物学活性的方法，所述方法包括构建得到稳定表达sie报告基因的效应细胞，用il-6刺激激活报告基因表达，并用il-6/il-6r抗体药物阻断il-6信号通路，根据测定的报告基因信号值拟合四参数曲线确定抗体生物学活性。本发明的目的在于提供一种快速测定il-6/il-6r抗体药物生物学活性的方法，所述方法包括：(1)构建得到稳定表达sie报告基因的效应细胞；(2)将il-6加至(1)所述细胞中刺激激活报告基因表达；(3)将il-6/il-6r抗体药物样品及参比品等比例稀释，将稀释后的抗体分别转移至步骤(2)中的细胞和il-6混合物中，在37℃培养箱中进行孵育；(4)加入荧光素酶底物，根据测定的报告基因信号值拟合四参数曲线确定抗体生物学活性。ds-1细胞属于il-6依赖小鼠b淋巴细胞，其表面表达有il-6受体(由配体结合链α链和信号转导链gp130组成)，il-6与il-6r结合，活化与gp130偶联的jak蛋白并激活stat3，stat3蛋白形成二聚体，进入细胞核识别并结合gas或者sie序列，从而维持ds1细胞的存活和增殖。将sie-luciferase序列导入ds-1细胞内，il-6与il-6r结合后激活jak-stat信号通路，并启动与sie序列连接的荧光素酶报告基因的表达。抗il-6r抗体与il-6竞争性结合il-6受体，阻断il-6信号通路，因此抗il-6r抗体浓度与效应细胞中的荧光素酶表达量成反比。在本发明的实施方案中，稳定表达sie报告基因的效应细胞选自ds-1细胞、mh60.bsf2细胞、b9细胞293细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、nso、sp2细胞、hela细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人肝癌细胞、549a细胞、3t3细胞中的任一种，优选为稳定表达sie报告基因的ds-1细胞。在本发明的实施方案中，报告基因为luciferase荧光素酶报告基因。在本发明的实施方案中，所述步骤(1)包括：用包含sie序列的报告基因载体转染ds-1细胞、mh60.bsf2细胞、b9细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、nso、sp2细胞、hela细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人肝癌细胞、549a细胞或3t3细胞，并加入相应抗生素筛选得到稳定表达报告基因的单克隆细胞株。在本发明的实施方案中，稳定表达sie-luciferase的ds-1/sie-luc细胞的制备方法为，将含有sie-luciferase序列的载体导入ds-1细胞内。更优选的，有sie-luciferase序列的载体为市售的pgl4.47[luc2p/sie/hygro]质粒。在本发明的实施方案中，制备效应细胞悬液，按照2.5×104-2×105个/孔，优选为5×104个/孔的细胞密度。在本发明的实施方案中，加入il-6激活报告基因表达，il-6浓度为10pg/ml-2μg/ml，优选il-6浓度为100ng/ml。在本发明的实施方案中，il-6/il-6r抗体药物为市售及在研的针对il-6或il-6受体的单克隆抗体，更优选的，托珠单抗(tocilizumab)、sarilumab、siltuximab、杰瑞单抗、药明康德的wbp216(medi5117)、迈博太科的cmab806、海正药业批件号为2016l09574的单克隆抗体。在本发明的实施方案中，托珠单抗样品及参比品稀释起始浓度为1pg/ml-1mg/ml，优选为125μg/ml。在本发明的实施方案中，托珠单抗样品及参比品等比例稀释的比例为1:2-1:5，优选为1:3。在本发明的实施方案中，培养时间为4-22小时，优选为6小时。在本发明的实施方案中，使用荧光素酶试剂盒检测化学发光值，优选为，使用promega公司的bio-glo荧光素酶试剂盒(产品货号g7940)、biovision公司的luciferase荧光素酶报告基因检测试剂盒(产品货号k801-200)、碧云天公司的荧光素酶报告基因检测试剂盒等检测化学发光值。荧光素酶(luciferase)来自于自然界能够发光的生物，是在生物体内能够催化荧光素(luciferin)或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。根据来源生物种类的不同，可将荧光素酶分为萤火虫荧光素酶(fl)和细菌荧光素酶(bl)。目前，以北美萤火虫来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码产生550个氨基酸的荧光素酶蛋白。fl基因来自萤火虫，在mg2+、atp、o2的参与下，催化d-荧光素(d-luciferin)氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550-580nm的荧光。荧光素酶报告基因检测是现代分子生物学研究领域中分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具。荧光素酶报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物，来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)然后通过化学发光仪或液闪测定仪测定。在本发明的实施方案中，在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值(relativelightunit,rlu)通过数据处理拟合倒s型四参数曲线。倒s型四参数曲线，可反映出上下渐近线、ic50值和斜率等指标。优选的，使用softmaxpro5.4进行数据处理拟合倒s型四参数曲线。在本发明的实施方案中，通过比较样品与参比品四参数曲线的半抑制浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration，ic50)值，得出样品的相对效价。计算公式为：相对效价＝参比品ic50/样品ic50×100％。附图说明图1是不同克隆的效应细胞荧光素酶活性测定结果图2是ds-1/sie-luc细胞不同孵育时间下四参数曲线图图3是ds-1/sie-luc细胞不同il-6浓度下四参数曲线图图4是ds-1/sie-luc细胞不同抗体浓度下四参数曲线图图5是ds-1/sie-luc细胞不同细胞密度下四参数曲线图图6是本发明检测方法测定四种单抗药物活性图图7是本发明检测方法和增殖抑制法比较图具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。实施例1稳定表达sie-luciferase的ds-1细胞株筛选1.1实验材料ds-1细胞来源于atcc；pgl4.47[luc2p/sie/hygro]质粒购买于promega公司；培养用重组人白介素-6(il-6)购买于prospec公司；活性实验用重组人白介素-6(il-6)购买于南京诺艾新生物技术有限公司；bio-glo荧光素酶试剂盒购买于promega公司。1.2质粒转染采用neontm电穿孔转染系统(invitrogen)对ds-1细胞进行pgl4.47[luc2p/sie/hygro]质粒转染。转染24小时后，加入100ug/mlhygromycinb进行加压筛选。待细胞密度和活力恢复后，通过有限稀释法，按照0.5个/孔的密度，铺96孔板筛选单克隆。在细胞生长期间，观察并标记哪些孔是单克隆，当单克隆孔内ds-1细胞汇合度达到30％以上时，将此孔内细胞转移至24孔板，逐步扩大培养。1.3ds-1/sie-luc细胞株筛选初筛：每孔10000个细胞铺至384孔板，il-6稀释至50ng/ml、5ng/ml、0.5ng/ml、0ng/ml，37℃，5％co2培养过夜，第二天每孔加入40μlsteady-glo，检测化学发光值。表1ds-1/sie克隆初筛化学发光值con(ng/ml)ds-1/sie-6ds-1/sie-7ds-1/sie-8ds-1/sie-13ds-1/sie-275082801160355388212591534125932075391417020.5739159687958490018139185284275信噪比463019319选取ds-1/sie-6、7、8、13、27等信噪比较高的克隆进入复筛。复筛：每孔10000个细胞铺至384孔板，il-6稀释至初始浓度50ng/ml，1:2稀释11个浓度梯度，37℃，5％co2培养过夜，第二天每孔加入40μlsteady-glo，检测化学发光值。经过复筛，ds-1/sie-13细胞对il-6的刺激有较好荧光素酶表达反应性(见图1)，选取ds-1/sie-13细胞为试验用细胞，并命名为ds-1/sie-luc细胞。实施例2检测方法优化2.1孵育时间优化由于ds-1/sie-luc细胞为il-6依赖细胞，缺乏il-6细胞不能生长，因此要探索一个较为合适的孵育时间避免ds-1/sie-luc细胞由于缺乏il-6而死亡。方法：将ds-1/sie-luc细胞按5×104个/孔加入到96孔白板中；il-6初始浓度2μg/ml，1:3稀释10个浓度梯度；37℃，5％co2培养。分别在4h、6h、8h、10h、12h和22h加入bio-glo，检测化学发光值，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线以及信噪比，确定一个较为合适的孵育时间。结果：随着孵育时间的增长，四参数曲线下平台逐渐降低(见图2)，推测是因为il-6缺少，细胞死亡，因此我们选择6h作为孵育时间，既能保证信噪比，也能避免细胞死亡导致的信噪比虚高。2.2浓度优化根据实施例2.1的il-6激活实验结果，il-6设置250ng/ml、100ng/ml、25ng/ml、10ng/ml四个不同的浓度，分别进行il-6r单抗的抑制实验，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线确定il-6的使用浓度。方法：将ds-1/sie-luc细胞按5×104个/孔加入到96孔白板中；托珠单抗(由中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室留存)初始浓度为125μg/ml，1:3梯度稀释10个浓度点，加入上述细胞板中；il-6分别稀释至250ng/ml、100ng/ml、25ng/ml、10ng/ml，分别转移到上述细胞板中；37℃，5％co2培养。6h后加入bio-glo，检测化学发光值。结果显示，il-6浓度选择100ng/ml，此时能够达到很好的信噪比(见图3)，也能节省il-6用量。2.3抗体量效范围优化将托珠单抗稀释到较高的浓度1mg/ml，1：3稀释，20个浓度点，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线确定托珠单抗的作用范围。方法：将ds-1/sie-luc细胞按5×104个/孔加入到96孔白板中；il-6稀释至100ng/ml，转移到上述细胞板中；托珠单抗稀释至1mg/ml，1:3梯度稀释20个浓度点，将稀释后的抗体转移至细胞板中；37℃，5％co2培养。6h后加入bio-glo，检测化学发光值。结果见图4：根据ic50值及上下平台计算，确定托珠单抗起始点终浓度为125μg/ml，1:4稀释，设十个浓度点，能够保证上下平台各有两个浓度点，线性部分至少三个点。2.4细胞密度优化设置2.5×104个/孔、5×104个/孔、1×105个/孔、1×105个/孔四个不同的细胞密度，分别进行il-6r单抗的抑制实验，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线确定最优细胞密度。方法：将ds-1/sie-luc细胞分别按2.5×104个/孔、5×104个/孔、1×105个/孔、2×105个/孔加入到96孔白板中；加入100ng/ml的il-6；托珠单抗初始浓度为125μg/ml，1:4稀释10个浓度梯度，转移至上述细胞板中；37℃，5％co2培养。6h后加入bio-glo，检测化学发光值。结果：根据上下平台计算得出的信噪比，ds-1/sie-luc细胞密度5×104个/孔至2×105个/孔范围内时，信噪比相差不多，细胞密度对信噪比影响不大(见图5)。选择细胞密度5×104个/孔进行后续实验。实施例3检测方法的验证3.1专属性验证本方法是针对抗il-6/il-6r抗体的生物学活性方法，因此，对其专属性的验证采用了不同靶点的单抗药物：托珠单抗(tocilizumab，靶点为il-6r)利妥昔单抗(rituximab，靶点为cd20)、西妥昔单抗(cetuximab，靶点为egfr)和贝伐珠单抗(bevacizumab，靶点为vegf)。在相同的实验条件下，利用我们的ds-1/sie-luc报告基因测活体系，测定这四种单抗药物的活性。方法：将ds-1/sie-luc细胞按5×104个/孔加入到96孔白板中；加入100ng/ml的il-6；将四种单抗分别稀释至初始浓度125μg/ml，1:4稀释10个浓度梯度，分别转移至上述细胞板中；37℃，5％co2培养。6h后加入bio-glo，检测化学发光值。结果见图6：本方法对cd20、egfr、vegf靶点的抗体药物均没有剂量效应曲线，说明本方法不适于除了il-6/il-6r靶点以外的其他药物，证明本方法专属性较好。3.2与传统方法的方法学比较目前托珠单抗的生物学活性测定方法主要是细胞增殖抑制的方法，该方法依据对il-6有生长依赖性的人白血病细胞系kt-3/ds-1，加入托珠单抗和il-6，两者竞争性结合细胞表面il-6受体，孵育72小时后，通过测定细胞的数量来定量托珠单抗的细胞增殖抑制作用。我们分别使用传统方法和ds1-sie报告基因法测定同一批样品的相对效价，每个实验重复6次。转基因细胞法：将ds-1/sie-luc细胞按5×104个/孔加入到96孔白板中；加入100ng/ml的il-6；托珠单抗初始浓度为125μg/ml，1:4稀释10个浓度梯度，转移至细胞板中；37℃，5％co2培养。6h后加入bio-glo，检测化学发光值。增殖抑制法：将ds-1细胞按2×104个/孔接种于96孔板中；加入10ng/ml的il-6；托珠单抗初始浓度为400μg/ml，1:4稀释10个浓度梯度，转移至细胞板中；37℃，5％co2培养72小时。将cck8显色液以20μl/孔加入细胞板，继续培养3小时，检测450nm/650nm波长测其吸光度。结果显示(见图:7)：转基因细胞法测定结果与传统方法增殖抑制法测定结果具有很好的一致性，且转基因细胞法的相对变异系数要低于传统方法。转基因细胞法大大减少了实验时长，能够极大的提高工作效率。当前第1页12