本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效无偏差构建小鼠tcrbeta的cdr3区高通量测序文库的所需的引物和文库制备方法。
背景技术：
淋巴细胞通过其表面抗体识别特异性抗原来发挥免疫功能。其对抗原识别的特异性体现在克隆水平，即同一克隆的淋巴细胞能识别具有相同的抗原受体，识别同一抗原表位。t细胞抗原受体(tcr)是t细胞特异识别和结合抗原肽-mhc分子的结构，t细胞受体是异源二聚体，由两个不同的亚基所构成。95％的t细胞的受体由α亚基和β亚基构成，另外5％的受体由γ亚基和δ亚基构成，其比例会因为个体发育或疾病而变化。
trb是编码tcrbeta的基因座，其包含可变段(v)、多变段(d)、连接段(j)和恒定区(c)4个基因片段，而v，d，j，c又分为若干等位基因，t细胞发育过程中trb基因座内发生基因重组，为tcrbeta的多样性提供了分子基础，另外通过在基因重组位点附近的碱基的随机插入和缺失等机制，最终产生了多样性的tcr，以满足机体识别多种多样的抗原的需要。
tcrbeta的cdr3区由v基因片段末端、d基因片段、j基因片段前端及v、d、j之间插入的核苷酸序列组成。tcrbeta链按等位排斥的方式优先于tcralpha链的重排，能较好的反应t细胞的tcr特征。因此，对t细胞受体beta链cdr3编码序列进行研究，具有重要意义。
tcrbeta的c区靠近细胞膜，连接跨膜区和胞内的末端，而v区负责识别多肽-mhc复合体。每个亚基的可变区都包含三个高度易变的互补决定区(complementaritydeterminingregions,cdr)，最重要的cdr3负责直接与mhc所呈递的多肽结合，而且序列高度可变，故tcr的多样性主要由cdr3决定。随着高通量技术的发展，对整个t细胞群体tcr的cdr3区进行大规模平行测序已成为可能，通过对tcrbeta的cdr3区进行测序，可以评价免疫组库中tcrbeta的多样性等参数，进一步可以分析免疫系统的应答发生机制及过程。
鉴于传统的扩增cdr3区需要多重pcr进行扩增，存在扩增过程中模板拷贝数和扩增效率难以控制，产物发生偏移，不能反应样本初始tcr分布等问题；同时，多种引物扩增会增加错配及相互干扰，导致扩增背景高，可重复性差等问题，最终导致测序结果不能真实反映样本情况。本发明采用5’race技术可较好避免建库过程中的扩增偏移，可无偏差的对小鼠tcrbeta库。利用tn5酶能将dna打断和接头连接同步完成的功能和使用特异性的引物可对tcrbeta的高度可变区(cdr3区)进行快速富集建库，实现了对样本中t细胞受体库的准确检测，通过标签序列，可增加测序样本数，减少测序成本，可应用各类含t细胞的组织样本的t细胞受体库分析，对了解免疫机制和揭示疾病发生发展机制有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是建立一种高效无偏差的构建小鼠tcrbeta的cdr3区高通量测序文库的方法。
基于高通量测序的5’race结合tn5转座酶技术构建小鼠tcrbetacdr3区文库的方法按如下步骤进行：
1)提取小鼠组织或全血总rna。
2)以步骤1)提取的rna为模板，以seqidno.1为引物逆转录合成cdna，在逆转录酶作用下将seqidno.4连接至cdna的3’端。
3)采用半巢式pcr特异性扩增tcrbeta片段：使用seqidno.2和seqidno.5进行第一轮pcr；使用seqidno.3和seqidno.5进行第二轮pcr；其中seqidno.5作为通用引物，seqidno.3为在tcralpha的c端序列，并带有测序接头。
4)使用磁珠纯化第二轮pcr产物；使用tn5建库试剂盒进行dna打断，使用seqidno.6与seqidno.7进行测序接头连接，建库，质控。
5)文库用于illumina高通量测序平台测序。
序列表
其中，上表seqidno.4的序列中rg代表单脱氧鸟嘌呤(riboguanosine),+g代表锁核苷酸修饰的鸟嘌呤(lna)。
有益效果：
本发明涉及一种基于高通量测序的5’race结合tn5转座酶技术构建鼠tcrbetacdr3区文库的方法。本发明公布了通过5’race技术高效的，无偏差的扩增小鼠tcrbeta的全长序列，利用tn5酶进行快速打断富集cdr3区的建库所需的引物和文库制备方法，实现了对样本中t细胞受体库的准确检测，可应用各类含t细胞的组织样本的t细胞受体库分析，对了解免疫机制和揭示疾病发生发展机制有重要意义。
附图说明：
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1tcrbeta文库图；
图2tcrbeta文库测序统计结果图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述：
基于高通量测序的5’race结合tn5转座酶技术构建鼠tcrbetacdr3区文库的方法，包括以下步骤：
步骤1提取小鼠组织中的总rna
使用trizol法(roche，tripureisolationreagent)提取组织/全血中总rna的提取方法，包括如下步骤：匀浆组织/全血加入trizol后吹打，室温静置5min，直接提取rna或放入-80℃冰箱冻存，加入200ul氯仿/mltrizol，颠倒混匀30s，室温放置3min。4℃，12000g离心15min。尽可能吸取上层水相至另一ep管，注意不要吸到中间层。按0.5ml异丙醇/mltrizol加入异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。4℃，12000g离心10min。按1ml75％乙醇/mltrizol加入体积比为75％的75％乙醇，温和震荡，悬浮沉淀。4℃，8000g离心5min。吸去上清。室温晾干5-10min。用合适体积的无rnase水溶解rna。
将所提取的rna利用nanodropone超微量紫外分光光度计测定浓度，检测结果显示，od260/280在1.8-2.0之间。将所提取的rna利用琼脂糖凝胶电泳检测条带完整性。检测结果显示，28s和18s条带明显，5s条带不明显，28s/18s在2.0左右。
上述检测结果表明步骤1所提取的rna质量满足建库要求，能够用于后续建库。
步骤2逆转录和模板转换：
将步骤1获得的总rna样本使用smartscribereversetranscriptase进行逆转录逆，具体如下体系:总rna0.2-2ng，浓度为10um的逆转录引物c1(5’-tagaactggacttgacagcg-3’,(seqidno.1))1ul，加入无rnase水至12ul，短暂离心，pcr仪中72度孵育3min，迅速冰上5min。再加入5xfirststrandbuffer4ul，dntps2ul，dtt0.5ul，rnainhibitor0.5ul，smartscribereversetranscriptase2ul，浓度为10um的tso(5’-acactctttccctacacgacgcrgrg+g-3’,(seqidno.4))1ul，加水至20ul，短暂离心，pcr仪中42℃孵育90min，70℃10min，4℃保持。
步骤3第一轮pcr反应:
利用步骤2所得到的的产物使用kapahifihotstartreadymix(2x；kapabiosystems,kk2601)进行巢式pcr的第一轮pcr扩增，按如下体系准备1stpcr体系：
2xkapahifihotstartreadymix12.5ul，浓度为1um的sp(5’
-acactctttccctacacgacgc-3’,(seqidno.5))0.5ul，浓度为10um的c2(5’-ttgggtgtgggagatctctgc-3’,(seqidno.2))0.5ul，cdna1ul，补水至25ul,
pcr反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性20s，67℃退火15s，72℃延伸6min，循环15次；72℃延伸5min。
步骤4第二轮pcr反应:
利用步骤3所得到的的产物使用kapahifihotstartreadymix(2x；kapabiosystems,kk2601)进行巢式pcr的第二轮pcr扩增，按如下体系准备2ndpcr体系：2xkapahifihotstartreadymix25ul，浓度为10um的sp(5’-
acactctttccctacacgacgc-3’,(seqidno.5))2ul，浓度为10um的c3(5’-
gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctatctctgcttctgatggctca-3’,(seqidno.3))2ul，第一轮pcr产物2ul，补水至50ul，pcr反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性20s，67℃退火15s，72℃延伸6min，循环20次；72℃延伸5min。
5tn5酶建库：
上述步骤4pcr反应结束后，使用ampurexpmagneticbeads进行dna纯化，具体步骤如下：将磁珠从冰箱拿出，恢复至室温。配制新鲜的体积比为80％的乙醇。吸取50ulbeads加入到50ul2ndpcr产物中，混合均匀，室温孵育5min。置于磁力架上至液体变澄清(约2min)，用移液器吸除上清。将200ul新制备的80％乙醇加入到样本中，磁力架上30s，吸除上清。重复上一步。磁力架上风干约10min，将ep管从磁力架上取下，加入30ul水洗脱磁珠上的dna，室温2min。将ep管从磁力架上至液体变澄清(约2min)，吸取上清至另一ep管即得纯化的pcr产物。
将纯化后的pcr产物使用trueprepdnalibraryprepkitv2forillumina的tn5酶进行建库，使用qubit2.0荧光计对dna进行定量，取1ng产物进行tn5转座酶建库。具体操作按试剂盒说明书进行：室温解冻5×ttbl，上下颠倒混匀后备用；确认5×ts是否处于室温，并轻弹管壁确认有无沉淀；如有沉淀，37℃加热并涡旋振荡充分混匀，沉淀即可溶解。在pcr管中配制如下反应体系：5×ttbl4ul，1ngdna，ttemixv15ul，补水至20ul，轻轻吹打20次至充分混匀。放置在pcr仪中，55度10min；10度，保持。反应完成后立即向产物中加入5ul5xts，轻轻吹打充分，室温5min。在上述体系中加入以下成分：5×tab10ul，ppm5ul，tae1ul，浓度为10um的ip5
(5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacac[acgtcctg]tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag-3’，(seqidno.6))5ul，浓度为10um的ip7
(5’-caagcagaagacggcatacgagat[tcgcctta]gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’，(seqidno.7))5ul，总体积50ul。反应条件为：105℃，热盖；72℃，3min；98℃，30s；98℃，15s，60℃，30s,72℃，3min，10-15循环；72℃，5min；4℃，保持。
其中[acgtcctg]和[tcgcctta]为标签序列，包括但不局限于illumia的测序标签序列，[]内的序列可以为任意经验证的能区分不同样本的8bp的短序列。
上述pcr反应结束后，利用vahtsdnacleanbeads进行文库片段选择纯化，具体步骤如下：将vahtsdnacleanbeads平衡至室温并充分涡旋。配制新鲜的体积比为80％的乙醇。取30ul磁珠加入到50ulpcr产物中，充分混匀，室温静置5min。置于磁力架上至液体变澄清(约5min)。用移液器吸取上清至另一ep管，加入7.5ul磁珠并充分混匀，室温静置5min。置于磁力架上至液体变澄清(约5min)，吸除上清。将200ul新制备的体积比为80％的乙醇加入到样本中，磁力架上30s，吸除上清。重复上一步。磁力架上风干约10min，将ep管从磁力架上取下，加入20ul水洗脱磁珠上的dna，室温2min。将ep管从磁力架上至液体变澄清(约2min)，吸取上清至另一ep管，-20度保存。
文库纯化结束后，利用安捷伦2100生物芯片分析系统检测文库的纯度和大小，检测结果如图1所示：片段分布在300bp-550bp之间，平均长度在400bp，插入片段平均长度在280bp。将所得的文库通过illuminanextseq500平台进行测序，通过生物信息学分析高通量测序结果。
以上是实施例仅用于说明本发明的描述而非限定，基于本发明思想的形式上和细节上做出的各种改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。