本发明涉及生物技术及临床分子诊断技术领域，具体涉及一种轴抑制蛋白(axin2)基因s464f突变检测试剂盒。
背景技术：
wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。wnt信号通路包括经典的wnt信号通路与非经典的wnt信号通路，在经典通路即wnt-β-catenin信号通路中，wnt因子通过激活细胞膜上的frizzle/lrp5/6协同受体后抑制细胞内游离β-catenin蛋白的磷酸化和降解，细胞质中的β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能够联合pygo2、bcl-9以及foxm1蛋白共同与tcf/lef-1转录因子家族形成复合体并激活wnt信号通路下游靶基因的转录激活。
axin2蛋白是wnt信号通路中β-catenin上游重要成员之一。其主要作用是能够与apc(adenomatouspolyposiscoli)、gsk3β、ck1等蛋白结合形成复合体，促进细胞质中β-catenin的降解。目前越来越多的研究已经发现，在很多肿瘤中axin2蛋白均呈现不同程度的突变。
目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段，虽然近年来wnt信号通路在癌症中的研究，以及axin2蛋白作为wnt信号通路重要成员其突变水平的研究，已经成为研究开发肿瘤药物急需解决的重要问题，尤其是在axin2-β-catenin结合结构域中发生的突变，对axin2蛋白发挥功能启动非常重要的作用，例如在非小细胞肺癌细胞中检测出s464f突变等。
肽核酸(peptidenucleicacids，pna)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的dna类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的dna类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了dna中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与dna相同，pna可以通过watson-crick碱基配对的形式识别并结合dna或rna序列，形成稳定的双螺旋结构。由于pna不带负电荷，与dna和rna之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于dna或dna、rna间的杂交，pna与dna或rna的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与dna或rna分子的杂交能力远优于dna/dna或dna/rna，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。
本发明采用特异序列的pna寡聚物作为探针。由于pna是一种人工合成的核酸的类似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶基因结合时因电荷相互排斥所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优势，大大提高了检测灵敏度。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中如何确定wnt信号通路中核心的信号分子axin2基因突变情况，以及如何解释核心分子axin2在肿瘤细胞中的突变水平变化的困难，提供了一种检测wnt信号通路中axin2基因突变的试剂盒。
本发明提供的试剂盒中包括检测axin2基因突变的肽核酸pna荧光探针(用于特异性检测axin2基因s464f突变的肽核酸荧光探针)，通过联合肽核酸pna荧光探针的pcr方法，能够更加灵敏的检测细胞中axin2基因发生的突变，并且为研究wnt信号通路提供最直接的证据；该试剂盒中还包括：检测axin2基因突变所需的与axin2基因野生型互补杂交的一段肽核酸pna探针(用于阻断野生型axin2基因扩增的肽核酸探针)、用于定性检测axin2基因突变的引物。
本发明的原理是通过构建与axin2基因野生型互补的一段肽核酸pna序列，当肽核酸pna序列与axin2基因互补结合时，任一突变均可导致pna/dna产生错配，从而使得溶解温度发生改变。进而根据axin2基因突变型设计特异性的肽核酸pna探针以及引物对axin2突变型基因进行荧光定量pcr扩增，经过一轮的pcr扩增后，即可将axin2基因突变型与野生型进行区分开来。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种轴抑制蛋白(axin2)基因s464f突变检测试剂盒，它包括以下引物及探针：
用于特异性检测axin2基因s464f突变的正向引物axin2-f：5'-gctcacactcaattcgcgg-3'；
用于特异性检测axin2基因s464f突变的反向引物axin2-r：5'-cgtggcctccgcctcgatc-3'；
用于特异性检测axin2基因s464f突变的肽核酸荧光探针axin2-pna-p：5'-荧光报告基团-cccgcttccgctccc-淬灭基团-3'；
用于阻断野生型axin2基因扩增的肽核酸探针axin2-pna：5'-cccgctcccgctccc-3'。
进一步地，所述的试剂盒还包括：
检测内参的正向引物axin2-f'：5'-ccaccattcgcagtaccac-3'；
检测内参的反向引物axin2-r'：5'-caaactgctcgctgggc-3'；
检测内参的肽核酸荧光探针axin2-pna-p'：5'-荧光报告基团-gatcgaggcggaggcca-淬灭基团-3'。
进一步地，所述的试剂盒还包括pcr反应试剂。所述pcr的反应试剂包括：depc水、dna聚合酶、dntps、pcrbuffer、rnasin、逆转录酶、oligo(dt)和含mg离子的溶液(mgcl2)等。所述的dna聚合酶优选为具有5'→3'外切活性的dna聚合酶。
进一步地，在具体检测时pcr反应体系中的各组分浓度如下：dna聚合酶的终浓度为0.01u/μl～0.05u/μl，dntps的终浓度为0.2～0.6mm，pcrbuffer的终浓度为1×，rnasin的终浓度为40u/μl～60u/μl，m-mlv逆转录酶的终浓度为200u/μl～320u/μl，mg离子(mgcl2)的终浓度为1.5～5.0mm，正向引物的终浓度为0.05～0.9μm，反向引物的终浓度为0.05～0.9μm，oligo(dt)0.05～0.9μm，肽核酸探针的终浓度为0.05～0.9μm，肽核酸荧光探针的终浓度为0.05～0.9μm。
进一步地，所述的试剂盒还包括阳性对照品、阳性参考品及阴性参考品。所述的阳性对照品为含有axin2基因第6外显子s464f突变的质粒dna与含有axin2基因第7外显子序列的质粒dna的混合物，浓度3ng/μl。所述的阳性参考品为含有axin2基因第6外显子s464f突变的质粒dna，阴性参考品为含有axin2基因第6外显子s464野生的质粒dna，浓度均为3ng/μl。在检测中，阳性对照品ct值位于阳性参考品ct值与阴性参考品ct值之间。
本发明经过大量试验、研究和分析成功研究出能够用于快速、灵敏、有效的检测axin2基因s464f突变的试剂盒。利用这个试剂盒可以检测出人类axin2基因s464f突变情况。
本发明提供的试剂盒不包括对待测样品处理和模板提取的步骤，但对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和新鲜组织样品所获得的片段dna依然具有与细胞样品dna同样的扩增和检测能力。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：axin2基因是wnt信号通路中β-catenin蛋白上游发挥着重要功能的基因，本发明提供了直接检测wnt信号通路中axin2基因突变检测的试剂，借助于所述检测试剂能够通过实时荧光定量pcr法在转录水平快速检测出axin2基因的突变，而与普通实时荧光定量pcr不同的是，本发明使用的肽核酸pna荧光探针更加灵敏，本发明为抗癌药物的筛选，新靶向药物的机制研究都提供了非常有力的工具。操作简单，一次加样，从pcr反应开始到结束，一直在封闭的反应体系中进行，不但降低了污染几率，而且降低了结果出现偏差的几率。结果判读明确直观。
总之，本发明涉及的轴抑制蛋白(axin2)基因s464f突变检测的试剂盒实验操作简单，费用低廉，结果重复性，敏感性好，是研究肿瘤相关药物作用机理及基础科学研究的一种重要手段。
附图说明
图1是本发明实施例中所述肽核酸质谱图；
图2是本发明实施例中所述s464f突变型和野生型参考品pcr扩增图，图中上、中、下三条线各表示axin2第464位密码子突变型参考品、样本以及野生型参考品的扩增曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例及附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
本实施例通过非小细胞肺癌细胞进行举例说明，但是本发明不局限于非小细胞肺癌细胞。
本实施例所用a549(人非小细胞肺癌a549细胞系)购自美国atcc，培养细胞所使用的rpmi-1640培养基及10％胎牛血清均购自英俊公司(invitrogen)，其他试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司。
一、引物探针设计
(1)选择axin2mrna中的一段含464位氨基酸密码子的序列作为靶序列设计引物与探针。
靶序列：
gctcacactcaattcgcgggagggggcgcccacgcagcaccccctctccctactgccctccggcagctacgaggaagacccgcagacgatactggacgatcacctgtccagggtcctcaagacccctggctgccagtctccaggcgtaggccgctatagcccccgctcccgctccccggaccaccaccaccaccaccattcgcagtaccactccctgctcccgcccggtggcaagctgcctcccgcggccgcctcgccgggcgcctgccccctcctcgggggcaaaggctttgtgaccaagcagacgacgaagcatgtccaccaccactacatccaccaccatgccgtccccaagaccaaggaggagatcgaggcggaggccacg。
检测axin2s464f突变的引物与探针如下：
axin2-f：5'-gctcacactcaattcgcgg-3'；
axin2-r：5'-cgtggcctccgcctcgatc-3'；
axin2-pna-p：5'-fam-cccgcttccgctccc-bhq-3'；
axin2-pna：5'-cccgctcccgctccc-3'。
(2)以axin2第6外显子不同于上述靶序列(不含464位氨基酸密码子)的区域作为内参，用于检测内参的引物与探针如下：
axin2-f'：5'-ccaccattcgcagtaccac-3'；
axin2-r'：5'-caaactgctcgctgggc-3'；
axin2-pna-p'：5'-fam-ctcccgcggccgcctc-bhq-3'。
以上：f：forward，正向；axin2-f/axin2-f'表示用于检测核酸的正向引物；
r：reverse，反向；axin2-r/axin2-r'表示用于检测核酸的反向引物；
p：probe，荧光探针；p/p'表示用于检测核酸的荧光探针，该荧光探针为taqman荧光探针。
二、人非小细胞肺癌a549细胞系培养与传代
1)细胞培养
所有细胞系使用rpmi-1640培养基(invitrogen,carlsbad,ca)，10％胎牛血清(invitrogen,carlsbad,ca)，于37℃、5％co2环境下培养。
2)细胞传代
首先使用灭菌吸管将细胞培养皿中的培养液吸出，加入pbs缓冲液清洗2遍，往细胞中慢慢滴加适量胰蛋白酶，待细胞变圆，调整角度细胞能够移动后加入3ml的含10％胎牛血清的dmem培养基，反复轻轻吹打后，显微镜下观察细胞形态并计数，根据培养皿中细胞的含量将适量的细胞传代至其他灭菌的培养皿中，加入5ml的dmem培养基后放入5％co2培养箱。
细胞计数公式(个/ml)：(4大格细胞总数)×104×稀释倍数/4。
三、总rna的提取
1)倒掉培养基，pbs清洗后，直接将1mltrizol注入培养瓶(其中细胞5×106个/ml)，反复抽吸均匀。
2)在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿(为trizol总体积的1/5)，振荡混均30秒，室温下静置5分钟。
3)12000rpm4℃离心15分钟，分相为三层。上层：rna(约为trizol的60％)；中间：dna；下层：蛋白质(酚-氯仿)。
4)小心吸取上清液，转移到另一ep管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.4～0.6ml。有机相和中间层含有dna和蛋白质，避免触及；
5)上清液加入约0.5ml的异丙醇,振荡混均30秒。室温下静置10分钟。
6)12000rpm4℃离心10分钟。
7)rna沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液，注意避免吸弃rna沉淀。
8)离心管加入1ml预冷的75％乙醇(1mltrizol至少1ml乙醇清洗dna)，振荡混均30秒，使沉淀振荡起来，室温12000rpm离心1～2分钟。尽可能吸弃上清液，防止rna沉淀丢失。重复以上清洗步骤一次。
9)倒置离心管于滤纸上，干燥rna，但不能完全干燥(5～10分钟)。用depc水15μl溶解沉淀，55～60℃孵育10～15分钟。
四、实时荧光定量pcr
取提取的总rna1-5μg，加入pcr反应液，pcr反应液包括：无菌水、具有5'→3'外切活性的dna聚合酶、dntps、10×pcrbuffer、rnasin、m-mlv逆转录酶、oligo(dt)、引物、pna探针、pna荧光探针和含mg离子的溶液。其中，浓度为5u/μl的具有5'→3'外切活性的dna聚合酶0.3μl，浓度为10mmol/l的dntps2μl，10×pcrbuffer5μl，浓度为40u/μl的rnasin0.6μl，浓度为200u/μl的m-mlv逆转录酶0.6μl，浓度为25mmol/l的mgcl2溶液5μl，浓度为10μmol/l的正向、反向游引物各1.2μl，浓度为10μmol/l的pna探针、pna荧光探针各1.5μl，添加无菌水至体积为50μl。其中，具有5'→3'外切活性的dna聚合酶可以为taq酶。
pcr扩增：将各反应管放入荧光定量pcr仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，定义样品孔，并按下表提供的扩增程序进行pcr扩增：
表1为pcr扩增反应扩增程序
在扩增程序的第三步的终了读取荧光值。
五、数据分析判断：
首先定量体系ct值应满足7≤ct值≤33，若定量体系fam信号ct值＜7说明待测样本dna上样浓度过大；若ct值＞33或无ct值说明待测样本dna上样浓度太低或已经降解，要重新处理待测样本dna再验证。若实验满足以上条件再判定检测样本的突变清况，同时选定所检样本与该样本检测位点对应的突变型(阳性)参考品和野生型(阴性)参考品孔，对比三孔pcr扩增曲线(cta表示样本孔ct值，ctw表示野生型ct值，ctm表示突变型ct值)：
当ctw＜cta≤ctm时，表明该样本存在突变；
当ctw＝cta时，表明该样本为野生型。
图1是本发明实施例中所述肽核酸质谱图；
图2是本发明实施例中所述s464f突变型和野生型参考品pcr扩增图,图中上、中、下三条线各表示axin2第464位密码子突变型参考品、样本以及野生型参考品的扩增曲线，表明所检样本存在突变。
以上实施例仅用来说明本发明的技术方案，而非对其进行限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110>湖北工业大学
<120>一种轴抑制蛋白（axin2）基因s464f突变检测试剂盒
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
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<212>dna
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<400>6
caaactgctcgctgggc17
<210>7
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
ctcccgcggccgcctc16
<210>8
<211>385
<212>dna
<213>homosapiens
<400>8
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tcccgcggccgcctcgccgggcgcctgccccctcctcgggggcaaaggctttgtgaccaa300
gcagacgacgaagcatgtccaccaccactacatccaccaccatgccgtccccaagaccaa360
ggaggagatcgaggcggaggccacg385