本发明涉及基因工程的技术领域，具体而言，涉及一种小鼠基因型鉴定方法。
背景技术：
携带外源基因的小鼠(亦称转基因小鼠)是人类疾病研究的重要工具，在医学和生命科学研究领域的应用越来越广泛。在应用转基因小鼠开展科学研究前，通常需要对小鼠的基因型进行鉴定，区分转基因小鼠以及野生型小鼠。小鼠基因鉴定，涉及小鼠dna的获取、目标dna片段扩增、dna电泳。
目前传统的dna提取方法包括酚/氯仿提取法和高盐提取法。这些方法虽然能够获取较高纯度和较高得率的组织dna，但都有一些不足之处：一是操作步骤比较繁琐，例如多次涉及离心；二是涉及过多的试剂，例如均采用了氯仿、乙醇、蛋白酶k等试剂；三是时间偏长，部分实验步骤包含过夜流程。即便是近年来的相关文献公开的方法和现有试剂盒(例如vazyme、promega和takala公司试剂盒等)提供的方法，其dna提取部分所花时间也在30min到数小时之间，而且含有耗材(如收集柱等)和多种试剂(如裂解液、中和液、蛋白酶k等)。上述问题都在一定程度上增加了实验成本(包括试剂成本、耗材成本和人力成本)，从而制约了转基因小鼠基因分型的工作效率。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供了一种小鼠基因型鉴定方法，包括采用0.2％～0.4％的tritonx-100磷酸盐溶液处理有核细胞，使得细胞内核酸释放出来的过程。
在某些实施方式中，所述有核细胞采自小鼠尾静脉血。
在某些实施方式中，所述0.2％～0.4％％的tritonx-100磷酸盐溶液的配置方法包括：
将0.2～0.4mltritonx-100溶于100ml磷酸盐缓冲液中，配成0.2％～0.4％的tritonx-100磷酸盐溶液。
在某些实施方式中，还包括以下步骤：
s1：取小鼠尾静脉血；
s2：向尾静脉血中加入红细胞裂解液，待红细胞破碎，离心去除红细胞，得到白细胞沉淀；
s3：洗涤白细胞沉淀；
s4：将含量为0.2％～0.4％的tritonx-100磷酸盐溶液加入白细胞沉淀中处理有核细胞，使得细胞内核酸释放出来；
s5：pcr反应；
s6：于凝胶成像仪中观察显带。
在某些实施方式中，所述s1还包括以下步骤：
s11：固定小鼠，用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使鼠尾静脉扩张；
s12：用针头戳破鼠尾远端扩张的尾静脉，用虹吸细管吸取5～10ul静脉血；
s13：将获取的静脉血移至含10uletda溶液的1.5ml无菌ep管中，再用无菌干棉球按压针口。
在某些实施方式中，所述s2还包括以下步骤：
s21：向ep管中加入0.5ml预冷的红细胞裂解液，混匀冰上静止4～5分钟，待红细胞破碎完全；
s22：1000r/min离心5分钟，弃上清去除红细胞，得到白细胞沉淀。
在某些实施方式中，所述s3还包括以下步骤：
s31：用pbs洗涤2次；
s32：1000r/min离心2分钟，弃上清。
在某些实施方式中，所述s4还包括以下步骤：
s41：配置0.2％～0.4％含tritonx-100磷酸盐溶液；
s42：向ep管加入配置好的0.2％～0.4％tritonx-100磷酸盐溶液0.2ml得到混合物，震荡重悬，室温静置10分钟；
s43：将静止后的混合物于1000r/min离心5分钟，将上清液移至新的无菌ep管，于-80摄氏度保存，或者冰上放置，以准备行下一步操作。
在某些实施方式中，所述s5中pcr反应液组成为：
在某些实施方式中，所述s5中pcr反应条件为：
step1：预变性：94℃、5min、1cycle；
step2：pcr反应：94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，35cycle；
step3：彻底延伸：72℃、7min。
本发明提供的一种小鼠基因型鉴定方法相对于现有技术而言，有益效果是：
本发明提供的小鼠基因型鉴定方法，包括采用0.2％～0.4％的tritonx-100磷酸盐溶液处理有核细胞，使得细胞内核酸释放出来的过程。
可以理解的是，目前用于全血dna提取的方法，所用的专用试剂较多，整个操作时间较长。本发明除了与其他方案一样使用红细胞裂解液裂解红细胞外，对获取的有核细胞，使用实验室的辅助试剂聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)。
在免疫细胞化学中tritonx-100常用浓度为0.025％-0.1％，用于漂洗组织标本，降低切片表面张力，使反应液易于覆盖标本表面。也有认为0.025％-0.1％tritonx-100磷酸盐溶液可以溶解细胞膜表面的fc受体以及减少非特异性的结合，增加细胞膜的通透性。
需要理解的是，本发明经研究发现0.2％～0.4％的tritonx-100磷酸盐溶液处理有核细胞，能够使细胞内核酸释放到水溶液中来，无需使用异丙醇或者乙醇进一步纯化，裂解产物直接可以用于pcr扩增，极大减少了提取dna的步骤、缩短了获取dna的时间、提高了实验的效率。
通过多次实验研究证实，非离子型表面活性剂tritonx-100在特定的浓度下具有上述特殊的效果。尤其是，0.2％～0.4％的tritonx-100磷酸盐溶液。
进一步的，所述有核细胞采自小鼠尾静脉血。
可以理解的是，目前针对转基因小鼠鉴定的试剂盒提取小鼠dna的方式多数是通过剪取鼠尾、鼠耳朵或者鼠脚趾来实现的。
以vazyme公司的onestepmousegenotypingkit产品为代表，提供了整套dna粗提取及pcr扩增体系，通过加入组织裂解液以及蛋白酶k，通过水浴的方式(55摄氏度水浴2-4个小时或者水浴过夜，95摄氏度灭火蛋白酶k)，使小鼠组织释放出dna，然后直接吸取裂解液作为dna模板进行后续的目标dna片段扩增及dna电泳操作。
takala公司提供的dnaisoreagent亦可提取动物组织来源的dna(传统的缠绕法)，样品在dnaisoreagent中能够充分被裂解，在加入乙醇后，会出现白色絮状的基因组dna沉淀，收集并洗涤沉淀即可得到基因组dna，操作可以在30分钟内完成。
虽然文献上鲜有以全血提取dna的方式鉴定小鼠基因型的报道，但市面上亦有用于从全血提取dna的试试剂盒。以takala公司的bloodgenomednaextractionkit为代表，试剂盒含有gentlesolutioni、ii、iii三种溶液。其中gentlesolutioni的作用是在破坏血细胞的同时，与核酸形成电中性的复合体。将该复合体离心收集并用gentlesolutionii清洗后，在沉淀中加入gentlesolutioniii，将dna分离出来，然后再加入异丙醇将dna沉淀回收，整个操作需40分钟左右。
takala公司的takaraminibestwholebloodgenomicdnaextractionkit采用柱式法。该试剂盒用于从1ul～1ml加入各种抗凝剂的无核红细胞(如哺乳动物)全血中提取基因组dna，采用特别的红细胞裂解方法裂解全血中的大量无核红细胞，再由细胞裂解液裂解白细胞并释放基因组dna，再结合dna制备膜技术纯化基因组dna。
由此可知，目前针对转基因小鼠鉴定的组织来源通常是剪取的鼠尾、鼠耳朵或者鼠脚趾，给实验小鼠造成较大的创伤，并造成较大的应激反应，且剪取组织后不易止血或者止血时间较长。本发明通过从小鼠鼠尾采集静脉血，仅需采集5～10微升静脉血，减轻对小鼠的创伤及应激反应，并且方便止血。
综上所述，本发明提供的一种小鼠基因型鉴定方法具有上述诸多的优点及价值，并在同类产品中未见有类似的方法公开发表或使用而确属创新，产生了好用且实用的效果，较现有的技术具有增进的多项功效，从而较为适于实用，并具有广泛的产业价值。
附图说明
应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施方式公开的方法对3只α-突触核蛋白a53t突变转基因小鼠以及3只同窝出生的野生型小鼠进行基因鉴定的结果；
图2为vazyme公司的onestepmousegenotypingkit的方法对3只α-突触核蛋白a53t突变转基因小鼠以及3只同窝出生的野生型小鼠进行基因鉴定的结果。
其中，“+”表示转基因小鼠，“-”表示野生型小鼠。琼脂凝胶电泳鉴定结果：突变条带位于500bp，野生型无条带出现。两侧泳道为dnamarker：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp、1000bp。
具体实施方式
在下文中，将结合实施例更全面地描述本发明。本公开可具有各种实施例，并且可在其中做出调整和改变。然而，应理解：不存在将本公开的各种实施例限于在此公开的特定实施例的意图，而是应将本公开理解为涵盖落入本公开的各种实施例的精神和范围内的所有调整、等同物和/或可选方案。
在下文中，可在本公开的各种实施例中使用的术语“包括”或“可包括”指示所公开的功能、操作或元件的存在，并且不限制一个或更多个功能、操作或元件的增加。
在本公开的各种实施例中，表述“或”或“a或/和b中的至少一个”包括同时列出的文字的任何组合或所有组合。例如，表述“a或b”或“a或/和b中的至少一个”可包括a、可包括b或可包括a和b二者。
在本公开的各种实施例中使用的表述(诸如“第一”、“第二”等)可修饰在各种实施例中的各种组成元件，不过可不限制相应组成元件。例如，以上表述并不限制所述元件的顺序和/或重要性。以上表述仅用于将一个元件与其它元件区别开的目的。例如，第一用户装置和第二用户装置指示不同用户装置，尽管二者都是用户装置。例如，在不脱离本公开的各种实施例的范围的情况下，第一元件可被称为第二元件，同样地，第二元件也可被称为第一元件。
应注意到：如果描述将一个组成元件“连接”到另一组成元件，则可将第一组成元件直接连接到第二组成元件，并且可在第一组成元件和第二组成元件之间“连接”第三组成元件。相反地，当将一个组成元件“直接连接”到另一组成元件时，可理解为在第一组成元件和第二组成元件之间不存在第三组成元件。
在本公开的各种实施例中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的并且并非意在限制本公开的各种实施例。如在此所使用，单数形式意在也包括复数形式，除非上下文清楚地另有指示。除非另有限定，否则在这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本公开的各种实施例所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。所述术语(诸如在一般使用的词典中限定的术语)将被解释为具有与在相关技术领域中的语境含义相同的含义并且将不被解释为具有理想化的含义或过于正式的含义，除非在本公开的各种实施例中被清楚地限定。
在本发明某些实施例中，一种小鼠基因型鉴定方法，包括采用0.2％～0.4％的tritonx-100磷酸盐溶液处理有核细胞，使得细胞内核酸释放出来的过程。
上述，可以理解的是，目前用于全血dna提取的方法，所用的专用试剂较多，整个操作时间较长。本发明除了与其他方案一样使用红细胞裂解液裂解红细胞外，对获取的有核细胞，使用实验室的辅助试剂聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)。
在免疫细胞化学中tritonx-100常用浓度为0.025％-0.1％，用于漂洗组织标本，降低切片表面张力，使反应液易于覆盖标本表面。也有认为0.025％-0.1％tritonx-100磷酸盐溶液可以溶解细胞膜表面的fc受体以及减少非特异性的结合，增加细胞膜的通透性。
需要理解的是，本发明经研究发现0.2％～0.4％的tritonx-100磷酸盐溶液处理有核细胞，能够使细胞内核酸释放到水溶液中来，无需使用异丙醇或者乙醇进一步纯化，裂解产物直接可以用于pcr扩增，极大减少了提取dna的步骤、缩短了获取dna的时间、提高了实验的效率。
通过多次实验研究证实，非离子型表面活性剂tritonx-100在特定的浓度下具有上述特殊的效果。尤其是，0.2％～0.4％的tritonx-100磷酸盐溶液。
在本发明某些实施方式中，所述有核细胞采自小鼠尾静脉血。
在本发明某些实施方式中，所述0.2％～0.4％的tritonx-100磷酸盐溶液的配置方法包括：
将0.2～0.4mltritonx-100溶于100ml磷酸盐缓冲液中，配成0.2％～0.4％的tritonx-100磷酸盐溶液。
在本发明某些实施方式中，还包括以下步骤：
s1：取小鼠尾静脉血；
s2：向尾静脉血中加入红细胞裂解液，待红细胞破碎，离心去除红细胞，得到白细胞沉淀；
s3：洗涤白细胞沉淀；
s4：将含量为0.2％～0.4％的tritonx-100磷酸盐溶液加入白细胞沉淀中处理有核细胞，使得细胞内核酸释放出来；
s5：pcr反应；
s6：于凝胶成像仪中观察显带。
在本发明某些实施方式中，所述s1还包括以下步骤：
s11：固定小鼠，用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使鼠尾静脉扩张；
s12：用针头戳破鼠尾远端扩张的尾静脉，用虹吸细管吸取5～10ul静脉血；
s13：将获取的静脉血移至含10uletda溶液的1.5ml无菌ep管中，再用无菌干棉球按压针口。
在本发明某些实施方式中，所述s2还包括以下步骤：
s21：向ep管中加入0.5ml预冷的红细胞裂解液，混匀冰上静止4～5分钟，待红细胞破碎完全；
s22：1000r/min离心5分钟，弃上清去除红细胞，得到白细胞沉淀。
在本发明某些实施方式中，所述s3还包括以下步骤：
s31：用pbs洗涤2次；
s32：1000r/min离心2分钟，弃上清。
在本发明某些实施方式中，所述s4还包括以下步骤：
s41：配置0.2％～0.4％含tritonx-100磷酸盐溶液；
s42：向ep管加入配置好的0.2％～0.4％tritonx-100磷酸盐溶液0.2ml得到混合物，震荡重悬，室温静置10分钟；
s43：将静止后的混合物于1000r/min离心5分钟，将上清液移至新的无菌ep管，于-80摄氏度保存，或者冰上放置，以准备行下一步操作。
在本发明某些实施方式中，所述s5中pcr反应液组成为：
在本发明某些实施方式中，所述s5中pcr反应条件为：
step1：预变性：94℃、5min、1cycle；
step2：pcr反应：94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，35cycle；
step3：彻底延伸：72℃、7min。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
实施例1
(1)固定小鼠，用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使鼠尾静脉扩张，用4号针头戳破鼠尾远端扩张的尾静脉，用虹吸细管吸取5ul静脉血，随即将血液移至含10uletda溶液的1.5ml无菌ep管，用无菌干棉球按压针口；
(2)往ep管中加入0.5ml预冷的红细胞裂解液，混匀冰上静止4分钟，待红细胞完全破碎，1000r/min离心5分钟，弃上清，得到白细胞沉淀，用pbs洗涤2次，1000r/min离心2分钟，弃上清。
(3)配置0.2％含tritonx-100磷酸盐溶液，往ep管加入0.2ml，震荡重悬，室温静置10分钟，1000r/min离心5分钟，将上清液移至新的无菌ep管，于-80摄氏度保存，或者冰上放置，以准备行下一步操作。
(4)提取的dna模板用于pcr反应时的条件
1)pcr反应液组成
2)pcr反应条件
step1：预变性：94℃、5min、1cycle；
step2：pcr反应：94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，35cycle；
step3：彻底延伸：72℃、7min
(5)琼脂凝胶电泳，150v，25min，于凝胶成像仪中观察。
实施例2
(1)固定小鼠，用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使鼠尾静脉扩张，用3号针头戳破鼠尾远端扩张的尾静脉，用虹吸细管吸取10ul静脉血，随即将血液移至含10uletda溶液的1.5ml无菌ep管，用无菌干棉球按压针口。
(2)往ep管中加入0.5ml预冷的红细胞裂解液，混匀冰上静止5分钟，待红细胞完全破碎，1000r/min离心5分钟，弃上清，得到白细胞沉淀，用pbs洗涤2次，1000r/min离心2分钟，弃上清。
(3)配置0.4％含tritonx-100磷酸盐溶液，往ep管加入0.2ml，震荡重悬，室温静置10分钟，1000r/min离心5分钟，将上清液移至新的无菌ep管，于-80摄氏度保存，或者冰上放置，以准备行下一步操作。
(4)提取的dna模板用于pcr反应时的条件
1)pcr反应液组成
2)pcr反应条件
step1：预变性：94℃、5min、1cycle；
step2：pcr反应：94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，35cycle；
step3：彻底延伸：72℃、7min
(5)琼脂凝胶电泳，150v，25min，于凝胶成像仪中观察。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
发明人声明，本发明通过上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程。并且即不意味着本发明应依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。