本发明涉及真菌培养技术领域，具体涉及一种灵芝菌丝体的发酵方法。
背景技术：
灵芝多糖具有抗肿瘤、提高免疫力、抗衰老、降血脂等多种生理功能，有较大的药用和保健价值，受到当今医药界和食品工业的共同关注，其制成的药物和保健品深受人们喜爱，具有广阔的开发前景。
灵芝有效成分的提取方式包括：子实体提取、菌丝体提取，二者提取的成分有所差异，成分含量各有高低，都有其无法相互替代的特点。其中菌丝体提取所采用菌丝培养工艺包含：液体发酵培养与固体发酵培养，液体发酵最终是提取菌球以及浸出液浓缩物中的真菌多糖、蛋白等有效成分，优点是提取物的纯度或含量较高，应用在制备高效药物的方面较多，其缺点是发酵工艺要求高，投入高，提取工艺复杂、提取率较低。固体发酵的优点是投入低、工艺简便，产物回收率高，缺点是提取含量低，培养周期长，只能应用在常效类保健药物和保健品的方面。现有技术并没有一种高效的灵芝菌丝体的发酵方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种灵芝菌丝体的发酵方法。本发明提供的灵芝发酵方法将固体发酵与液体发酵技术相结合，具有生产规模大、生产周期短、生产工艺简便、有效成分含量高、产物回收率高的优点。
本发明提供了一种灵芝菌丝体的综合发酵方法，包括以下步骤：
1)将活化后的灵芝菌种接种于液体发酵培养基中，23～26℃培养5～7d，通气量为0.6～1v/v·min，气压为0.03～0.06mpa，得到发酵菌种；
所述液体发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖0.5～1％，豆粕0.1～0.2％，玉米粉0.1～0.2％，小麦粉0.1～0.2％，酵母膏0.1～0.3％，硫酸镁0.003～0.005％，磷酸二氢钾0.08～0.1％，复合维生素b0.001％和消泡剂0.03～0.05％，余量为水；
2)将步骤1)得到的发酵菌种接种于固体发酵培养基中进行暗培养，所述暗培养的时间为30～40d。
优选的是，所述步骤1)中活化后的灵芝菌种在液体发酵培养基中的接种量为0.1％～0.2％。
优选的是，所述步骤1)得到的发酵菌种的生物量为(2.00±0.50)×10-2g/ml、菌球平均直径为1.00±0.10mm，菌球密度为120.00±2.00个/ml，ph值为5～6.5。
优选的是，所述步骤2)的固体发酵培养基为菌包袋固体发酵培养基。
优选的是，所述步骤2)中发酵菌种的接种量为50～100ml/kg。
优选的是，所述固体发酵培养基中的碳氮比为(20～28)：1，含水量为42～50％，灭菌前培养基的ph值为7～8。
优选的是，所述固体发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：大米5～10％，小麦10～15％，玉米粉35％～45％，玉米芯5～8％，豆粕5～10％，麸皮15～25％，氢氧化钙1～2％和轻质碳酸钙1～2％。
优选的是，所述步骤2)暗培养的湿度为60～65％；所述暗培养包括以下4个阶段：
第1～9d，所述暗培养的温度为25～26℃，co2浓度为1000～1500ppm；
第10～15d，所述暗培养的温度为23～24℃，co2浓度为1500～2000ppm；
第16～30d，所述暗培养的温度为24～25℃，co2浓度为2000～3000ppm；
第30d至培养完成，所述暗培养的温度为25～26℃，co2浓度为1500～2000ppm。
优选的是，所述步骤2)暗培养后还包括脱袋、切片和烘烤过程。
本发明提供了一种灵芝菌丝体的综合发酵方法。本发明提供的灵芝菌丝体发酵方法将固体发酵与液体发酵技术相结合，综合了固体、液体发酵的优势，具有生产规模大、生产周期短、生产工艺简便、污染率低、有效成分含量高、产物回收率高的优点。有利于后续有效成分的高效提取和产物的回收。本发明的发酵方法相较于现有的固体发酵，有着生产规模大、生产周期短、污染率低的优点，相较于液体发酵培养，有生产工艺简便、有效成分含量高、产物回收率高的优点。所述综合发酵方法培养的菌丝体混合物，灵芝挥发油提取率高达0.03％，灵芝菌酸提取率达3.2％，含酸固体产品酸纯度可达25％以上，灵芝多糖提取率可达10.1％，多糖纯度可达45％以上。
具体实施方式
本发明提供了一种灵芝菌丝体的综合发酵方法，包括以下步骤：
1)将活化后的灵芝菌种接种于液体发酵培养基中，23～26℃培养5～7d，通气量为0.6～1v/v·min，气压为0.03～0.06mpa，得到发酵菌种；
所述液体发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖0.5～1％，豆粕0.1～0.2％，玉米粉0.1～0.2％，小麦粉0.1～0.2％，酵母膏0.1～0.3％，硫酸镁0.003～0.005％，磷酸二氢钾0.08～0.1％，复合维生素b0.001％和消泡剂0.03～0.05％，余量为水；
2)将步骤1)得到的发酵菌种接种于固体发酵培养基中进行暗培养，所述暗培养的时间为30～40d。
本发明首先进行的是活化后灵芝菌种的制备。在本发明中，所述菌种的活化次数优选为2次，通过在活化培养基中进行培养得到一级菌种和二级菌种，本发明选取二级菌种作为活化后的灵芝菌种用于液体发酵培养。在本发明中，所述一级菌种活化培养基优选采用本领域技术人员熟知的加富马铃薯培养基，二级菌种活化培养基优选为每升水中包括葡萄糖：10～20g，蛋白胨：2～4g，酵母膏：1～2g，磷酸二氢钾：1～2g，七水硫酸镁：0.75～1.5g和复合维生素b：0.25～0.5g。本发明对所述灵芝菌种的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售灵芝菌种即可，本发明优选选取来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cgmcc5.743的灵芝菌种。
本发明优选选取生长速度为5.5～6.5mm/d的菌丝作为一级菌种。本发明在一级菌种的选取过程中，优选选取菌落边缘整齐，洁白且强壮的菌株。本发明一级菌种的制备能够筛除出生长较弱的原始菌种，保证菌种的活性。本发明所述一级菌种培养的条件优选为22～28℃暗培养5～8d，更优选为23℃暗培养7d。
得到一级菌种后，本发明优选选取一级菌种菌落边缘1.5～2.5mm的菌丝置于二级菌种活化培养基中进行培养，所述活化培养的条件优选为恒温振荡培养5～7d，选取生物量为1.5～2.5×10-2g/ml的菌种，作为二级菌种。本发明在恒温振荡培养前，优选将一级菌种在二级活化培养基中静置至菌丝块萌发，所静置的条件优选为黑暗条件下，23～25℃静置28～32h，更优选为24℃静置30h。在本发明中，所述振荡培养的温度优选为23～26℃，更优选为24℃。本发明振荡培养优选采用恒温摇床进行，所述摇床的转速优选为140～160r/min，更优选为150r/min。在本发明中，第二次活化培养能够保证菌种的同源性和同步性。在本发明中，第二次活化后得到的菌种优选大小、分布均匀，不下沉，球面长满绒毛，培养基颜色较灭菌后明显变浅且透明。现有的灵芝液体发酵技术中，容易产生次生代谢产物，而本方法严格通过两次菌种的活化、筛选，能够保证菌种的同源性和同步性，同时接种量按照本方法保证在0.1～0.2％，能够极大缩短液体发酵时间，保证发酵产物的活性同步达到峰值，有利于后续的固体发酵。
得到活化后的灵芝菌种后，本发明将活化后的灵芝菌种接种于液体发酵培养基中，23～26℃培养5～7d，通气量为0.6～1v/v·min，气压为0.03～0.06mpa，得到液体发酵菌种。在本发明中，所述液体发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖0.5～1％，豆粕粉0.1～0.2％，玉米粉0.1～0.2％，小麦粉0.1～0.2％，酵母膏0.1～0.3％，硫酸镁0.003～0.005％，磷酸二氢钾0.08～0.1％，复合维生素b0.001％和消泡剂0.03～0.05％，余量为水。在本发明中，所述葡萄糖和玉米粉主要提供培养基的碳源，豆粕粉、小麦粉与酵母膏主要提供培养基的氮源，磷酸二氢钾主要控制培养基质中的ph，钾离子提供代谢环境，硫酸镁中镁离子是多种酶的活化剂。本发明的培养基中，酵母膏优选安琪酵母lm800，葡萄糖优选食用级，硫酸镁、尿素等化学物优选分析纯等级，其余各组分的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的各组分的常规市售产品即可。在本发明中，所述步骤1)中活化后的灵芝菌种在液体发酵培养基中的接种量为0.1％～0.2％。在本发明中，得到的液体发酵菌种的生物量为(2.00±0.50)×10-2g/ml、菌球平均直径为1.00±0.10mm，菌球密度为120.00±2.00个/ml，ph值为5～6.5。在本发明中，所述液体发酵培养的培养温度为23～26℃，更优选为24℃。在本发明中，所述液体发酵培养的时间为5～7d，更优选为6d。在本发明中，所述液体发酵培养的通气量为0.6～1v/v·min，更优选为0.8v/v·min。本发明通气优选采用无菌空气系统对空气进行处理，主要原理是洁净空气通过空压机进行空气压缩，具体地，经过储气罐保存高压气体，通过冷冻干燥机除湿、除尘、冷却空气至22～24℃，通过双层0.1μm微孔膜过滤细菌等微生物，最终通入培养装置。在本发明中，所述液体发酵培养的气压为0.03～0.06mpa，更优选为0.05mpa。在本发明中，所述发酵过程中通入的气体优选为冷干无菌空气。
本发明对所述液体发酵培养的具体操作过程没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知液体发酵方法即可。具体采用以下方法进行发酵：在本发明中，所述液体发酵培养的发酵设备具体优选包括：蒸汽灭菌系统、冷热循环水系统、无菌空气系统和无菌管道接种系统。在本发明中，所述蒸汽灭菌系统用于发酵装置的灭菌，采用蒸汽通入式灭菌，蒸汽压力优选为0.12mpa。本发明所述发酵装置优选为发酵罐，材质优选为sus304不锈钢，容积优选为800l，所述的发酵罐包含有夹层，所述夹层的作用为通过循环水恒温控制发酵温度。本发明对发酵培养基的灭菌方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的灭菌方法即可。具体地，本发明在水温升至75℃时，优选将除消泡剂以外的原料用热水溶解搅拌，等发酵罐内水温升至90℃，加入原料和消泡剂，121℃灭菌45min，灭菌完成后，利用冷热水循环系统的冷水通过夹层进行降温处理，待培养基冷却至24℃后再进行接种。本发明在液体发酵过程中，优选每2h观察发酵罐压力、温度、气味、通气量等数据并记录。在本发明中，发酵培养过程中优选进行两次取样检测，检测的目的为判断菌液是否被污染，检测方法优选为：气味判断菌液有无异味、肉眼判断菌液有无变色浑浊、革兰氏染色显微镜检有无细菌感染、平板划线检测有无细菌及其他真菌污染。
得到发酵菌种后，本发明将发酵菌种通过无菌管道接种于固体发酵培养基中进行暗培养。所述菌种接种过程优选采用无菌管道接种系统进行接种，具体地，所述接种管道采用高压蒸汽灭菌，灭菌条件优选为121℃，45min，待管道冷却后进行接种。在本发明中，所述暗培养的时间为30～40d；在本发明中，所述固体发酵培养基中的碳氮比为(20～28)：1，含水量为42～50％，灭菌前培养基的ph值为7～8。在本发明中，所述暗培养的时间优选为35d，所述固体培养基中的碳氮比优选为25：1，含水量优选为48％，所述含水量的设置能够保证灭菌的彻底性，菌包的松紧度和菌丝对水分的要求，本发明灭菌前培养基的ph值优选为7.5。在本发明中，所述固体发酵培养基中碳氮比的设定能够保证灵芝菌丝体的生长，且能保证在原料成本最低的前提下菌丝长势正常。在本发明中，所述步骤2)的固体发酵培养基优选为菌包袋固体发酵培养基，即灵芝菌丝体的固体培养在菌包袋中进行。本发明对菌包袋的材质没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的pp(聚丙烯)菌包袋即可，规格优选为36cm×15cm×0.5mm的。所述菌包袋每包优选装2.5±0.5斤培养基质，所述菌包的高度优选为17.5～18cm。在本发明中，所述菌包袋装料后的灭菌条件优选为123℃灭菌200min。
在本发明中，所述发酵菌种的接种量为50～100ml/kg，更优选为60ml/kg。本发明对发酵菌种的接种方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的接种装置进行接种即可。具体的，本发明选取长度为17.5cm，平均设置四排八个出液孔的接种枪进行接种，更优选的，本发明利用预置计数器与电磁阀控制菌种的单次出量，具体地，于无菌环境下接种，接种时接种枪插入料孔内，踩动开关进行喷料，使菌种均匀喷洒至料面，料中以及料底。在本发明中，所述固体发酵培养基优选包括以下质量百分含量的组分：大米5～10％，小麦10～15％，玉米粉35％～45％，玉米芯5～8％，豆粕5～10％，麸皮15～25％，氢氧化钙1～2％和轻质碳酸钙1～2％。在本发明中，所述固体发酵培养基优选还包括质量百分含量为0.1～0.2％的尿素。在本发明中，所述玉米粉的粒径优选为0.6～1.0mm，所述豆粕的粒径优选为0.8～1.2mm，所述大米的粒径优选为2.0～2.5mm，所述小麦的粒径优选为2.4～2.8mm。在本发明中，所述玉米粉、豆粕、大米和小麦的粒径能够保证菌包整体物理结构，平衡菌包透气性与灭菌的彻底性。在本发明中，所述小麦在使用前优选用25℃的水浸泡36h，所述大米优选25℃水浸泡12h。
在本发明中，所述步骤2)暗培养的湿度为60～65％；所述暗培养包括以下4个阶段：
第1～9d，所述暗培养的温度为25～26℃，co2浓度为1000～1500ppm；
第10～15d，所述暗培养的温度为23～24℃，co2浓度为1500～2000ppm；
第16～30d，所述暗培养的温度为24～25℃，co2浓度为2000～3000ppm；
第30d至培养完成，所述暗培养的温度为25～26℃，co2浓度为1500～2000ppm。
在本发明中，所述暗培养后还包括脱袋、切片和烘烤过程，得到片状菌块。在本发明中，菌包袋固体发酵培养基培养完的灵芝菌丝体优选进行脱袋，脱袋后的菌丝体优选进行切片，在本发明中，所述切片过程优选自制切片机械进行，所述切片的厚度优选为1～1.5cm，本发明优选采用带孔烘盘进行分装。在本发明中，烘烤优选于烘房中进行，所述烘房容积优选360m3，所述烘烤优选采用蒸汽管道空间加热，优选功率2.2kw、风量9000m3/h的轴流风机引风通过蒸汽管道散热片辅热除湿，优选功率0.55kw、风量3000～4000m3/h的离心风机循环热量和排湿，烘烤温度优选介于70～75℃之间。本发明的烘烤方法可保证：总蒸汽流量为1.25～1.5吨/次，单次烘干成品量为1.8吨，烘烤时间低于22h，烘烤后菌块水分不7％。本发明得到片状菌块后，对片状菌块的后续加工过程没有特殊的限定，采用本领域技术人员常规加工方式即可，如粉碎处理后，得到灵芝菌粉；或以超临界co2流体萃取菌粉得到灵芝挥发油、灵芝多糖和灵芝酸。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种灵芝菌丝体的发酵方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
灵芝原始菌种接种于装有培养基的多个平板培养皿中进行培养。
所述灵芝一级活化菌种的具体制备方法包括以下步骤：
灵芝原始菌种来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cgmcc5.743。
将所述灵芝原始菌种从4℃保藏条件下转移至24℃的恒温培养箱中，恢复生物酶的活性，24h后置于超净工作台中待用。
所述灵芝一级活化菌种采用的是加富马铃薯培养基，具体配制方式如下：
(1)马铃薯200g经清洗、去皮、去芽眼，切片0.2～0.3cm的厚度；
(2)将所得马铃薯放置热水中，先用大火煮3～5分钟至软化，再改为文火煮10分钟，使马铃薯营养充分散于水中；
(3)用6～8层纱布过滤，保留浸出液；
(4)在步骤(3)所得浸出液中加入酵母膏1g、蛋白胨2g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、复合维生素b1g、葡萄糖20g，琼脂粉20g，用水定容至1000ml；
(5)将步骤(4)的混合液分装于多个10cm规格的培养皿中，培养基厚度为5mm左右。
分装好培养基后培养皿用牛皮纸和橡皮筋5个扎一捆，平放于立式高压灭菌锅中，121℃灭菌45分钟，过程中不得倾斜培养皿。冷却后置于超净工作台中待用。
于超净工作台内挑取所述灵芝原始菌种于培养皿中。具体的，用接种钩切取长宽为5mm的原始菌种块，置于培养皿中央，接种15～20个培养皿后，用封口膜密封好，做好标记，23℃黑暗培养7d。待菌丝萌发后倒置培养皿，并将封口膜用无菌接种针扎孔，每个培养皿扎20个孔，继续培养。
待菌落生长至培养皿边缘1.5cm左右后，选取生长速度为5.5～6.5mm/d，菌落边缘整齐，菌丝洁白且强壮的菌株的菌丝作为灵芝一级活化菌种。
接种一级菌种菌落边缘1.5～2.5mm的菌丝的菌块于二级活化培养基中进行培养。
所述灵芝二级活化菌种的具体制备方法包括以下步骤：
所述灵芝二级活化培养基包括以下组分：葡萄糖：20g，蛋白胨：3g，酵母膏：1g，磷酸二氢钾：2g，七水硫酸镁：1g，复合维生素b：0.5g。
用75℃的水溶解上述各组物质，并定容至1000ml。
分装于多个500ml直口三角瓶中，每个三角瓶装250ml，每个三角瓶内放置一个2.5cm的磁力搅拌子，并用自制棉花塞盖紧，另用牛皮纸包裹三角瓶口，用绳子扎紧瓶口。
所述自制棉花塞采用纤维较长的非脱脂棉，具体制作方式为：裁取与三角瓶瓶口大小匹配的棉花块，用左手虎口裹紧棉花块，右手拇指压紧一侧，另一侧保证平滑呈u字状，剪取与棉花团大小匹配的医用纱布块包裹住棉花团，压紧，并于棉花团u字开口处用绳子系紧纱布不变形即可。
分装好的三角瓶置于立式高压灭菌锅中，121℃灭菌45分钟。冷却后置于超净工作台中待用。
将所述灵芝一级活化菌种置于超净工作台中，选取一级活化菌种菌落边缘1.5～2.5mm的菌丝块进行接种，每瓶三角瓶的接种数量为6块菌丝块。采用直径6.0mm的打孔器制备菌丝块。所述菌种块为浮于培养基表面。
接种完成后三角瓶置于黑暗条件下24℃恒温培养箱静置30h，待菌丝萌发后转移至恒温摇床，转速为150r/min，24℃黑暗培养7d，选取菌球大小、分布均匀，不下沉，球面长满绒毛，培养基颜色较灭菌后明显变浅且透明的菌种作为灵芝二级活化菌种。
将二级菌种接种至发酵罐中，接种量为0.1％，24℃恒温培养，通气量为0.6～1v/v·min，气压为0.03～0.06mpa，培养7d后选取生物量为2.00×10-2g/ml，菌球直径为1.00mm，菌球密度为122个/ml，ph为6.2的液体发酵菌种。
所述灵芝液体发酵菌种的具体制备方法包括以下步骤：
所述灵芝液体发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖1％，豆粕粉0.2％，玉米粉0.2％，小麦粉0.2％，酵母膏0.1％，硫酸镁0.004％，磷酸二氢钾0.08％，复合维生素b0.001％和消泡剂0.03％，余量为水。
本发明所述发酵装置为发酵罐，材质为sus304不锈钢，容积为800l，所述的发酵罐包含有夹层，所述夹层的作用为通过循环水恒温控制发酵温度。
根据接种量和接种菌包数计算所需液体菌种的总量，添加等量的水于发酵罐中，罐体夹层通入0.12mpa的蒸汽进行升温，待在水温升至75℃时，将除消泡剂以外的原料用热水溶解搅拌，等发酵罐内水温升至90℃，加入原料和消泡剂。待水温升至121℃时，关闭夹层蒸汽开关，打开罐内蒸汽开关将蒸汽直接通入罐体内，并将过滤器灭菌线路开关打开，进入灭菌程序。121℃灭菌45min。灭菌完成后，利用冷热水循环系统的冷水通过夹层进行降温处理，待培养基冷却至24℃后进行接种。
将所述灵芝二级活化菌种接种前放置磁力搅拌器上搅拌12h从而打碎菌球，所述打碎目的是多点萌发，缩短灵芝菌丝在发酵罐内萌发的时间，同时防止堵塞接种管道。
接种时关闭发酵罐进气阀将罐内压力降至排气管微有气体排出，关闭排气阀。将火焰圈套至接种口点燃，打开接种口后，将进气开关微开使接种口微有气体排出。将三角瓶在火焰圈的保护下打开瓶口，倒入罐内。拧紧接种口盖后用湿毛巾熄灭火焰圈。打开进出气阀，调节罐内压力至0.05mpa，通气量为0.8v/v·min进入培养阶段。所述排气阀前增加一个黄铜立式止回阀防止空气倒吸。
所述灵芝液体发酵过程中，每2h观察发酵罐压力、温度、气味、通气量、有无变色浑浊等数据并记录。第4d与发酵完成接种前进行两次取样检测，检测的目的为判断菌液是否被污染，检测方法采用本领域技术人员所熟知的检测方法，为：革兰氏染色显微镜镜检有无细菌感染、平板划线检测有无细菌及其他真菌污染。
选取生物量为(2.00±0.50)×10-2g/ml、菌球平均直径为1.00±0.10mm，菌球密度为120.00±2.00个/ml，ph值为5～6.5的单罐发酵产物作为灵芝液体菌种。
所述菌种生物量的测定方法为：取部分菌液，经5000r/min离心5min，重复洗涤3次，在-45℃、真空度为15pa条件下冷冻干燥，48h后测定菌丝生物量。所述菌球直径的测定方法为：通过显微镜目镜测微尺，在同一样品中随机测量10个菌球直径，取其算术平均值作为菌球的平均直径。所述菌球密度的测量方法为：用移液管准确吸取1ml发酵液于培养皿中进行计数，计算出每毫升中菌球的个数。
将灵芝发酵菌种通过无菌接种管道接种于固体发酵培养基中，转移至培养房进行暗培养，菌丝长满菌包后得到综合发酵产物。
所述无菌接种管道内外径规格10×20mm的耐高压硅胶管，接种端连不锈钢接种枪。所述接种枪长度17.5cm，均匀分布四排八个出液孔。所述接种枪连接20cm不锈钢管状夹套，另一端设置一个球阀开关，连接排水、排气管道。所述发酵罐底部出料口连接一个四通，分为(1)罐体出料口、(2)取样口、(3)接种管口、(4)进水管口或蒸汽管口。
所述接种管道灭菌方式如下：
灵芝液体菌种发酵完成后，接种管道连接至所述管口，所述管口连接进水管，打开水管与接种管道阀门，用自来水冲洗接种管道，冲洗时间20min，冲洗完成后，将所述管口的水管更换成蒸汽管道连接。
打开蒸汽阀门，将高压蒸汽通入接种管内，另一端打开接种枪夹套的球阀开关，将蒸汽排出。灭菌温度为121℃，灭菌压力为0.12mpa，灭菌时间45min灭菌完成，待管道冷却至25℃以下进行接种。
所述冲洗的目的是为了冲洗掉管道以及接种枪内的残余菌球、营养物质，防止杂菌的生长。
所述灵芝固体发酵培养基质的配制：
所述灵芝固体发酵培养基质包括以下质量百分含量的组分：大米10％，小麦15％，玉米粉40％，玉米芯8％，豆粕5％，麸皮20％，氢氧化钙1％和轻质碳酸钙1％。所述培养基质碳氮比为25：1。
所述固体发酵培养基中碳氮比的设定能够保证灵芝菌丝的生长，且能保证在原料成本最低的前提下菌丝长势正常。
使用前，所有原料需经过预处理，包括粉碎、浸泡。所述玉米粉的粒径为0.6～1.0mm，所述豆粕的粒径为0.8～1.2mm，所述大米的粒径为2.0～2.5mm，所述小麦的粒径为2.4～2.8mm。所述小麦在使用前用25℃的水浸泡36h，所述大米、玉米芯25℃水浸泡12h。
所述玉米粉、豆粕、大米和小麦的粒径能够保证菌包整体物理结构，平衡菌包透气性与灭菌的彻底性。所述小麦、大米、玉米芯为了调节菌包的透气性，设置的颗粒度较大，导致吸水量大且不易吸水，浸泡目的是防止所述原料干芯从而导致灭菌不彻底。
将所述培养基质各组分倒入10.4m3的搅拌锅中，为1000kg/锅，搅拌均匀后加入水，保证打包前基质中含水量为48％，ph值为7.5。搅拌均匀后传送至自动打包机中，保证菌包高度17cm，每袋装2.4斤培养基质。所述自动打包机打包过程中进行两次冲压，第二次冲压在菌包基质中央打孔，深度15.5cm。
所述含水量的设置能够保证灭菌的彻底性，菌包的松紧度和菌丝对水分的要求。
所述固体发酵耐高温菌包袋内进行，所述菌包袋采用本领域技术人员熟知的pp(聚丙烯)菌包袋即可，规格为36cm×15cm×0.5mm。
菌包制作完成后，放置于配套耐高温塑料筐中，每筐12袋，塑料筐放置于灭菌车内，推入高压蒸汽灭菌柜进行灭菌。
所述灭菌过程抽真空2次、升温保温1设置105℃30min、升温保温2设置115℃30min、灭菌设置123℃200min、焖置排气设置30min。灭菌完成后，菌包冷却至25℃以下进行接种。
所述接种方式具体如下：
冷却完成的菌包传送至洁净度小于10万级的接种室内进行接种。接种时遵循“一手拿枪，一手拿盖”原则。接种操作流程为：①开盖；②接种枪插入菌包料孔，枪尾圆盘卡住套环为止；③脚踩脚踏开关，使菌种喷出；④停留1～2秒钟使菌种喷尽，同时打开下一个菌包盖；⑤接种枪抽出菌包后立即盖上盖子，再按照②③④⑤流程依次接种。接完种的菌包于传送带上传送出接种室。
所述灵芝液体菌种的接种量为60ml/kg。所述接种枪长度为17.5cm，平均设置四排八个出液孔，所述接种量的控制设备预置计数器与电磁阀。
所述灵芝菌丝培养具体方式如下：
接种完成后，灵芝菌包转移至培养房进行黑暗培养。所述暗培养的湿度为60～65％；所述暗培养包括以下4个阶段：
第一阶段为第1～9d，属于菌丝萌发期，菌丝自身发热量低，需设备提供培养温度至25～26℃，由于菌丝呼吸量较小，co2浓度为1000～1500ppm；
第二阶段为第10～15d，属于菌丝定植一期，菌丝自身发热量最大，氧气消耗开始增加，培养温度需降至23～24℃，co2浓度控制在1500～2000ppm；
第三阶段为第16～30d，属于菌丝定植二期，菌丝自身发热量较大，co2积累浓度最高，培养温度设置在24～25℃，co2浓度为2000～3000ppm；
所述第四阶段为第30d至培养完成，属于菌丝后熟期，菌丝发热量与所述第一阶段基本持平，培养温度设置为25～26℃，co2积累浓度大于第一阶段，为1500～2000ppm。
本发明采用固体发酵与液体发酵结合技术对灵芝菌丝体进行发酵培养，固体发酵基质含水量与接种量与传统工艺有所差别，本发明采用的是降低固体培养基水分，增加液体菌种接种量的方式。所述固体培养基含水量标准是根据配方各组分的占比、颗粒度大小以及吸水性能制定的，在保证灭菌彻底性原则的前提下，所述培养基质越干，液体菌种的渗透性越好，液体菌种种量的原则标准是培养基质内特别是底部无积水的前提下，菌种量越大，菌种基数越多，菌丝生长越快。而菌包局部积水反而导致菌丝局部生长缓慢或难以生长，同时液体菌种种量越大，后期提取的真菌多糖含量越高。
经对比，在本方法所述固体发酵原料配方及各组分比例、颗粒大小的特定前提下，固体发酵基质含水量为48％，接种量为60ml/kg，菌丝长势最快。
本发明起初采用液体发酵方式制作灵芝菌丝体，单次发酵量越大，提取成本越低，但在发酵罐罐体径高比等同的前提下，发酵设备越大，发酵设备工艺与配套设备要求越高，操作工艺与发酵工艺要求更严苛，扩繁次数增加，发酵总周期更长，风险系数更大，所需的前期投入也更高，并且提取工艺与设备要求也更高。本申请方法采用800l发酵罐用以制作液体发酵菌种，并非直接用于提取，而是扩繁至固体发酵基质中，有着前期投入低，污染率低，抗风险能力强，生产工艺相对简便的优点。
实施例2
以灵芝发酵产物的加工处理：
采用实施例1得到成熟的灵芝菌丝发酵产物，进行切片，烘干处理，得到片状菌块；对片状菌块粉碎处理后，得到灵芝菌粉；以超临界co2流体萃取菌粉得到灵芝挥发油、灵芝多糖和灵芝酸。
灵芝成熟菌丝发酵产物的切片烘干，具体包括以下步骤：
固体发酵培养完成的灵芝菌包进行人工取盖、取环、脱袋处理，脱袋后的发酵产物进行机械切片，所述切片的单片厚度为1～1.5cm。
所述切片机械为自制切片机，灵感来自于造纸厂切割机，设置一个可90°闭合的固定闸刀把手，把手下焊接13片最大厚度3mm的不锈钢刀片，所述刀片间距为1.25cm。刀片下方桌面设置一个17cm长、5cm直径的不锈钢圆柱形固定卡槽，所述卡槽设置13条横向内空条纹。卡槽上半圆内空条纹间距3.35mm，闸刀刀片上提时可防止菌渣残留于刀片间隙内，下半圆卡槽条纹间距8mm，切片完成后片状菌块可通过卡槽。卡槽下方设置一个可放置烘盘的桌面，桌面离卡槽高度20cm，所述通过卡槽的菌块直接落至烘盘中。所述卡槽一端连接一个长50cm、直径相同的弧形入料圆筒，圆筒末端与桌面呈15°，便于投入菌包。所述入料筒、卡槽、刀片皆可开合或拆卸，便于切片完成后的清洗。
所述烘盘带孔烘盘提高烘干效率，孔径3mm，烘盘孔密度25个/dm2。所述烘盘80×50×2cm规格，厚度1mm的不锈钢材质，每个烘盘摆放3个灵芝菌包，共摆放3×14片。
所述烘干于烘房中进行，烘房容积360m3，所述烘房上下前后各设置4个温度探头与湿度探头。所述烘房后端设置功率0.55kw、风量3000～4000m3/h的离心风机，为提高利用率，所述离心风机设置循环和外排两用通道，烘烤前期常开外排通道多排湿气，后期多开循环通道少开排风通道，可缩短烘烤时间、节约能源。所述烘房蒸汽管道空间加热，所述蒸汽管道排水排气阀门置于烘房外，直径25mm铁管，以盘管形式置于烘烤架下端，所述烘烤架设置8层，单层高度30cm，宽度1.6m，每层设置4根盘管加热。另每间烘房前端2台功率2.2kw、风量9000m3/h的轴流风机引风辅热除湿。
所述烘干过程分为3个步骤：升温、降湿和保温。烘盘放满烘房后，打开盘管蒸汽阀门进行烘房升温，待温度升至70℃后适当调小盘管蒸汽量，打开散热片蒸汽阀门，并打开轴流风机和离心机，引风排湿。待空间平均湿度低于5％时，进入所述保温阶段，离心风机设置每小时循环风启动45min，外排风启动15min，保温6h后烘烤结束。当烘烤温度长时间低于65℃，高温高湿高营养环境会滋生霉菌，烘烤温度高于80℃会破坏多糖物质结构。升温时，保证蒸汽压力充足，升温时间不超过3小时；烘烤时，严格控制进入烘房蒸汽量，烘烤温度在70～75℃之间。
本切片烘烤方法可保证：单次烘烤蒸汽总用量在1.25～1.5吨/次，单次烘干成品量为1.8吨，烘烤时间低于22h，烘烤后菌块水分不高于7％。
烘烤完成后进行分装、称重至50斤/包，缝口机封口，带有薄膜内袋的包装袋包装，包装后置于阴凉、通风干燥处储存待用。
所述综合发酵方法培养的菌丝体混合物，经测定，灵芝挥发油提取率高达0.03％，灵芝菌酸提取率达3.2％，含酸固体产品酸纯度可达25％以上，灵芝多糖提取率根据品种不同可达10.1％，多糖纯度可达45％以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。