一种抗体‑海兔毒素偶联物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物制药
技术领域：
，特别是涉及一种抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用。
背景技术：
：mart-1蛋白是一种只在黑色素细胞和大部分黑色素瘤细胞中才会表达的黑色素瘤相关抗原，并且在黑色素瘤细胞中呈高表达，据不完全统计，100％的黑色素瘤样本都有mart-1蛋白的表达(barrowc等，clincancerres.2006feb1；12(3pt1):764-771)。因此，选择以mart-1蛋白为靶点设计的药物将在黑色素瘤中有较为广泛的应用。进20年来，单克隆抗体领域的快速发展使其在临床的肿瘤治疗领域有着举足轻重的作用，例如西妥昔单抗，曲妥珠单抗，利妥昔单抗等一系列单克隆抗体都在各自的肿瘤适应症上均表现出了良好的临床治疗效果。他们通常是通过抑制肿瘤细胞的关键信号传导通路和fc段诱导产生adcc，cdc效应来达到抑制肿瘤细胞生长和杀伤肿瘤细胞的目的(weinerlm等，natrevimmunol.2010may；10(5):317-327.)。抗体偶联药物(antibody-drugconjugates，adcs)是一种结合了单克隆药物和化学修饰/偶联技术的新型生物药物，它将单克隆抗体和毒性小分子通过linker技术连接在一起，不仅具有单克隆药物优良的靶向性又具有小分子毒物的高细胞毒性，使其能快速、精准的到达肿瘤部位，并在被肿瘤细胞内吞之后在细胞内释放毒性小分子，达到更快更强的杀伤肿瘤细胞的目的。然而我们注意到，无论是临床使用的单克隆抗体还是抗体偶联药物，他们所针对的靶点仍然是细胞膜表面的膜蛋白胞外区，而对于胞内的高表达或者突变的肿瘤相关蛋白仍然无可奈何。主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex)，简称mhc，具体分为两类。其中mhci类分子复合物由mhci类分子，β2-微球蛋白和长度为8-11个氨基酸的递呈肽构成，其中mhci类分子又可以主要分为hla-a、b、c三大类。细胞通过自身的mhci类分子将由蛋白酶体水解自身蛋白产生的多肽递呈至细胞表面(yorkia等，annurevimmunol.1996；14:369-396.)。基于这一理论，黑色素瘤相关抗原mart-1蛋白的26-35位氨基酸：eaagigiltv形成的多肽正可以被hla-a2分子递呈至细胞表面。正是这一理论使得胞内蛋白也可以成为抗体乃至抗体偶联药物的靶点。单克隆抗体具有稳定的结构和良好的靶向性，但是普通的偶联方式如氨基，巯基的偶联方式，有可能会使得抗体的稳定性或者靶向性下降。sortasea是从金黄色葡萄球菌中分离的催化转肽反应的酶，其184位的半胱氨酸亲核攻击lpxtg(x表示天然氨基酸中任意一种)标签中苏氨酸(t)和甘氨酸(g)之间的肽键，形成共价硫代中间体，同时释放出甘氨酸及其羧基c末端肽段。该中间体通过捕获溶剂中的甘氨酸底物从而在苏氨酸和捕获的甘氨酸底物之间形成新的肽键，释放出sortasea酶进行下一步催化。由于该反应特异性高、操作简单、反应条件温和，sortasea已被广泛用于蛋白质工程和蛋白质定点修饰。技术实现要素：本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种针对eaagigiltv/hla-a2的抗体与海兔毒素(monomethylauristatine，mmae)偶联形成的抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用。一种抗体-海兔毒素偶联物的制备方法，包括以下步骤：(1)提供c端具有lpxtg序列的抗mart-1蛋白递呈肽eaagigiltv/hla-a2复合物的单克隆抗体、具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物；(2)在sortasea酶催化下，lpxtg序列与寡甘氨酸接头发生转肽反应，使所述单克隆抗体与具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物进行偶联；(3)反应完成后，分离纯化得到所述抗体-海兔毒素偶联物。所述抗mart-1蛋白递呈肽eaagigiltv/hla-a2复合物的单克隆抗体的重链氨基酸序列如seqidno.1所示，轻链氨基酸序列如seqidno.2所示。所述单克隆抗体的重链和轻链的c端均连接有lpxtg序列。c端位于恒定区，远离抗体的可变区，所以偶联后对抗体活性影响较小。重链轻链的c端均连接lpxtg序列，用于偶联海兔毒素，可以尽量增加单个抗体上偶联的海兔毒素的比例，一分子抗体包括两条重链和两条轻链，这样理论上一份子抗体可以偶联四分子的海兔毒素，抗体携带的药物比例高。所述单克隆抗体的重链和轻链在lpxtg序列后连接gwshpqfek序列。该序列可以增加sortasea酶与抗体末端之间复合物的稳定性，从而增加偶联效率，并且偶联后会随着sortasea酶识别序列末尾的甘氨酸残基一起被切除，不影响最终抗体-海兔毒素偶联物的活性。所述单克隆抗体的轻链lpxtg序列之前连接柔性接头，所述柔性接头为ggggs五肽。引入柔性接头，克服了之前抗体轻链上无法偶联带寡甘氨酸的毒性药物的问题，且偶联效率大大提高，得到更高药物抗体偶联比(dar)的抗体偶联药物。所述寡甘氨酸接头为ggg序列，所述寡甘氨酸接头与海兔毒素或海兔毒素衍生物之间设有缬氨酸-瓜氨酸二肽接头。缬氨酸-瓜氨酸二肽接头可在溶酶体酶cathepsinb作用下断开。本发明又提供了所述制备方法制备的抗体-海兔毒素偶联物。本发明还提供了所述的抗体-海兔毒素偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包括所述的抗体-海兔毒素偶联物。所述肿瘤为hla-a2、mart-1双阳性的黑色素瘤。本发明通过定点偶联使每分子的抗体带上4分子的mmae毒素，均一性良好，且在体内实验中展示了良好的肿瘤杀伤能力；与现有adcs靶点相比，cla12-vcmmaeadcs拓展了目前adcs靶点的选择面，论证了胞内蛋白通过mhci分子的递呈也可以作为adcs药物靶点的这一观点。附图说明图1为cla12adcs与cla12单克隆抗体在还原状态下经高效液相plrp-反向柱的分析结果图。图2为cla12adcs与cla12单克隆抗体在非还原状态下经高效液相hic柱的分析结果图。图3为ggg-vcmmae经质谱分析后的二级碎片图。图4为经胰酶消化后的cla12adcs多肽经质谱分析后，提取3个ggg-vcmmae特征离子后的结果图，其中图a、b、c为三个特征离子分析图，图d为总的质谱分析图。图5为经胰酶消化后的cla12adcs多肽经质谱分析后，在紫外吸收图和质谱一级图中提取带有lpetggg-vcmmae目标肽的特征峰图，其中图a为紫外吸收图，图b为质谱一级图。图6为经胰酶消化后的cla12adcs多肽经质谱分析后，抗体重链c末端带有lpetggg-vcmmae目标肽的二级碎片图。图7为经胰酶消化后的cla12adcs多肽经质谱分析后，抗体轻链c末端带有lpetggg-vcmmae目标肽的二级碎片图。图8为cla12adcs与cla12单克隆抗体在5μg/ml的浓度下用流式细胞分析技术对靶细胞mel624.38亲和力的分析图。图9为cla12adcs与cla12单克隆抗体对mel624.38，mcf7，sk-mel28和k562细胞系的杀伤效果图。图10为cla12adcs与cla12单克隆抗体诱导mel624.38细胞凋亡图，其中，图a为阴性对照组rpim-1640，图b为实验组，图c为指示图，图d为cla12对照组。图11为不同剂量cla12adcs组，cla12单克隆抗体组和对照adcs组scid-beige鼠体内肿瘤生长曲线图。图12为不同剂量cla12adcs组，cla12单克隆抗体组和对照adcs组scid-beige鼠给药后体重变化曲线图。具体实施方式实施例1cla12hl-vcmmae偶联物的制备。以eaagigiltv/hla-a2复合物为靶点的单克隆抗体为cla12，其序列来自美国专利：us20100158927a1。抗体轻重链可变区基因序列(重链可变区基因序列如seqidno.5所示，轻链可变区基因序列如seqidno.6所示)由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成，抗体轻重链恒定区序列为实验室保存，通过pcr法将其轻重链可变区分别与人lamda轻链恒定区和人igg1型重链恒定区相连，并在轻重链c末端连接lpetg序列，表达获得的重组抗体命名为cla12hl。(1)cla12单克隆抗体轻重链c末端改造，通过pcr法在抗体的轻重链c末端分别加上编码lpetg多肽的核酸序列，其中lamda轻链恒定区与lpetg序列之间通过ggggs五肽linker连接，并在轻重链lpetg序列之后加上gwshpqfek序列用于增加sortasea酶与抗体c末端之间复合物的稳定性，从而增加偶联效率，待轻重链序列构建完毕，将他们分别连接pmh3表达载体并稳定转染至中国仓鼠卵巢细胞(cho)，选取表达量高的单克隆进行表达，并用proteina亲和柱对抗体进行纯化。最终重链的基因序列如seqidno.3所示，轻链的基因序列如seqidno.4所示，重链的氨基酸序列如seqidno.1所示，轻链氨基酸序列如seqidno.2所示。(2)sortasea酶的表达，通过pcr法获得其60-210位氨基酸所对应的碱基序列，并在其n端加入his6标签，构建于表达载体pet28a中，通过大肠杆菌rosettaplyss2(de3)进行表达，当菌液od600＝0.5左右，加入iptg使其终浓度位1mm。最后通过亲和层析柱(hitrapni-ntacolumn，ge)进行纯化。(3)偶联反应体系如下：50mmtris-hcl，150mmnacl，5mmcacl2，ph7.5，cla12hl抗体2μm，sortasea酶10μm，ggg-vcmmae(南京联宁生物制药有限公司，ggg-vcmmae中，ggg表示三个甘氨酸残基，vc表示溶酶体酶cathepsinb可断开的二肽接头(缬氨酸-瓜氨酸)，mmae为高毒性小分子药物海兔毒素。)200μm，室温反应8h，制备成cla12hl-vcmmae偶联物。(4)cla12hl-vcmmae偶联物的纯化，经前期的高效液相和质谱分析，发现基本上抗体的轻重均连有海兔毒素，且反应基本完全，所以产物的纯化直接使用亲和层析柱(hitrapproteinahpcolumn，ge)进行纯化，得到均一的cla12adcs，所得产物过0.22μm孔径的滤膜除菌，-20℃保存备用。实施例2cla12hl-vcmmae偶联物的鉴定。(1)cla12hl-vcmmae偶联药物高效液相鉴定，取cla12hl-vcmmae偶联药物和cla12hl单克隆抗体各20μg，分别加入稍许tcep粉末，移液枪混匀后，37℃孵育10min，用plrp-反向柱进行分析，检测波长为280nm。检测结果如图1所示，cla12hl单克隆抗体有轻链(l0)和重链(h0)两个峰，cla12hl-vcmmae也有轻链(l0)和重链(h0)两个峰，但相较于cla12hl单克隆抗体有轻链和重链两个峰的位置都明显的向后偏移，且与cla12hl单克隆抗体有轻链和重链两个峰的位置没有重叠，说明cla12hl-vcmmae轻链和重链各自都连上了ggg-vcmmae。(2)cla12hl-vcmmae偶联药物高效液相鉴定，取cla12hl-vcmmae偶联药物和cla12hl单克隆抗体各20μg，用hic疏水柱进行分析，检测波长为280nm。检测结果如图2所示，cla12hl单克隆抗体在6min左右出现单峰，而cla12hl-vcmmae在11min左右出现主单峰，另在9min和10min左右出现3个很小的峰，因此判断cla12hl-vcmmae偶联物主要产物均一性良好，再结合图1的结果，可以说明基本上1分子的cla12hl单克隆抗体基本连上4分子的ggg-vcmmae。(3)cla12hl-vcmmae偶联药物质谱鉴定，将cla12hl-vcmmae偶联药物用盐酸胍-tris溶液(ph8.0)将供试品稀释至2mg/ml，加入二巯基苏糖醇(终浓度20mm)反应1.5h后，加入碘乙酰胺(终浓度60mm)室温避光反应40min封闭游离半胱氨酸残基后，12000rpm/min4℃离心超滤置换缓冲液为100mm磷酸盐(ph7.4)，加入胰蛋白酶37℃酶切24h后用甲酸(终浓度1％)终止酶切反应待测。本次检测所用的柱子为：acquityuplcbeh300c18，进样量为10μl。其中液相分离条件如表1所示，质谱参数设置如表2所示。表1cla12hl-vcmmae偶联药物酶切后多肽超高效液相分离条件。表2cla12hl-vcmmae偶联药物酶切后多肽质谱参数设置。毛细管电压2.5kv锥孔电压80v质量分析范围50至2000damse碰撞能量20至45ev离子源温度90℃雾化温度400℃雾化流速700l/hr内标亮氨酸脑啡肽检测结果：首先，ggg-vcmmae小分子的二级图谱如图3所示，其中分子量为506.4110、686.5637、718.5949的子离子为ggg-vcmmae的特征碎片；第二，如图4所示，对cla12hl-vcmmae的总离子流图进行ggg-vcmmae的特征碎片的提取，三个特征碎片均在38.3min和39.7min有强度较高的单峰出现；第三，如图5所示，结合cla12hl-vcmmae的总离子流图和紫外吸收图，以及我们观察到在38.3min和39.7min的两个峰的分子量分别为2895.476da和1734.998da，这与理论上带有lpetggg-vcmmae的多肽碎片理论值相符合(2895.477da和1735da)，初步判断轻链c末端和重链c末端连有lpetggg-vcmmae的多肽分别对应38.3min和39.7min的两个峰；第四，如图6和表3(38.3min)、图7和表4(39.7min)所示，对38.3min和39.7min的两个峰进行进一步二级碎片的解析，发现其对应肽段确实含有lpet序列，且在部分y离子上有找到ggg-vcmmae的修饰，在整条肽段的二级图谱上也找到ggg-vcmmae的特征碎片。因此从质谱上判断，可以确定ggg-vcmmae的偶联位置确实在lpet序列后面。表338.3min的峰进行进一步二级碎片的解析数据。表439.7min的峰进行进一步二级碎片的解析数据。实施例3cla12hl-vcmmae偶联物的生物学活性检测。1、流式亲和力检测(1)取5×105个mel624.38细胞分别与5μg/ml的cla12单克隆抗体和cla12hl-vcmmae在1％bsa的pbs溶液中4℃孵育30min；(2)pbs洗涤两次后，加入山羊抗人igg(h+l)多抗(1∶200稀释)，再4℃孵育30min；pbs洗涤两次后用流失细胞分析仪检测细胞的平均荧光强度(mfi)。流式细胞分析仪检测cla12和cla12hl-vcmmae与mart-1，hla-a2双阳性细胞mel624.38的结合，以二抗标记后的fitc的平均荧光强度来显示结合力的强弱。检测结果如图8所示，cla12单克隆抗体和cla12hl-vcmmae在相同浓度下对相同数量的mart-1，hla-a2双阳性细胞mel624.38亲和力相差无几。2、细胞毒性检测(1)将mel624.38，mcf7，sk-mel28，k562，四种细胞系用各自分培养基以每孔2500个细胞量进行96孔板的铺板，依次梯度稀释cla12单克隆抗体和cla12hl-vcmmae，并加入到每个细胞孔中，使药物最终浓度依次为：10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.01μg/ml、0.005μg/ml、0.001μg/ml、0.0005μg/ml，每个药物浓度3个附孔。120h后，每孔加入10ul的cck-8(东仁化学科技(上海)有限公司)，1h后测定450nmod值，计算细胞活力。检测结果如图9所示，cla12hl-vcmmae对于mart-1+，hla-a2+细胞mel624.38的ic50值约为：1.01μg/ml，对于mart-1-，hla-a2+细胞mcf7的ic50值分别约为72.24μg/ml，对于mart-1+，hla-a2-细胞sk-mel28的ic50值约为：16.66μg/ml，对于mart-1-，hla-a2-细胞k562的ic50值约为：26.14μg/ml，其中cla12单克隆对于双阳性细胞mel624.38的ic50值约为：64.25μg/ml，本发明所获得的adcs相较于原始的单克隆抗体在对于阳性细胞的杀伤能力上有了明显的提高，但是在细胞层面，有交叉反应的现象，尤以对mart-1+，hla-a2-细胞sk-mel28最为明显。3、细胞凋亡分析(1)分别于5×104个mel624.38细胞进行铺板，分别加入1μg/ml的cla12单克隆抗体和cla12hl-vcmmae，培养72h后，细胞离心，去培养基，用pbs洗涤，取2×105个mel624.38细胞，加入500μl结合缓冲液，5μlannexinv(膜联蛋白v)，10μlpi(碘化丙啶)，室温避光孵育5min。流式细胞分析仪检测凋亡细胞的百分比。检测结果如图10所示。由图10可见，cla12单克隆抗体处理的细胞凋亡率很低，和空白给药组几乎没有差异，而cla12hl-vcmmae诱导细胞凋亡的现象则明显很多，早凋/万凋率分别为16.6％和8.2％，显示cla12hl-vcmmae比cla12单克隆抗体对阳性细胞mel624.38具有更强的杀伤能力。4、scid-beige小鼠体内抗肿瘤实验体外培养mel624.38细胞至对数生长期，胰酶消化并用rpmi-1640洗涤两次，加入适量的无菌pbs混匀后，加至等量的高浓度基质胶中(康宁公司)，两者混匀后暂放冰浴中；用75％的酒精消毒scid-beige小鼠前肢右腋下皮肤，每只注射0.2ml，即107个肿瘤细胞，待鼠体内肿瘤平均大小为180mm3时，将25只小鼠随机分成5组，每组5只；对于5组scid-beige鼠尾静脉分为：不给药组，cla12单抗组(15mg/kg)，ofa-vcmmae组(dar≈4)，cla12hl-vcmmae低剂量组(5mg/kg)和cla12hl-vcmmae高剂量组(15mg/kg)。给药间隔为3天，一共给药4次。由图11可见，cla12单抗组(15mg/kg)，cla12hl-vcmmae低剂量组(5mg/kg)和cla12hl-vcmmae高剂量组(15mg/kg)对肿瘤的生长均有抑制，其中，cla12hl-vcmmae高剂量组的抑制效果最为明显，可以发现针对这一靶点，adcs药物起效较慢，药物浓度需维持在较高的水平在给药完毕后第4天，高剂量组有两种小鼠肿瘤完全消除，在给药完毕后第7天，高剂量组所有小鼠肿瘤完全消除，而且一直到60天后也没有复发的迹象。cla12单抗组(15mg/kg)，cla12hl-vcmmae低剂量组(5mg/kg)在前提抑瘤效果相差不多，给药完毕后第4天可以看出些许差距，时间越长，两者抑瘤效果相差越为明显，cla12hl-vcmmae低剂量组的抑瘤能力较cla12单抗组稍好一些。取最后一次给药后的数据做统计学分析，发现相较ofa-vcmmae组，cla12hl-vcmmae低剂量组和cla12hl-vcmmae高剂量组的抑瘤能力具有明显差异。由图12可见，mel-624.38细胞对于scid-beige小鼠的影响较大，对于不给药组在瘤体积到达800mm3时，小鼠的体重就呈下降的趋势，除了cla12hl-vcmmae高剂量组，其余组在瘤体长到800-1000mm3后，组内小鼠的体重也呈下降的趋势，但是对于cla12hl-vcmmae高剂量组，经过给药小鼠的体内的瘤体完全消除，小鼠的体重一直呈现上升的趋势，说明高剂量的cla12hl-vcmmae在杀伤肿瘤细胞的同时对小鼠的毒性并不明显。经上述实验结果表明，采用sortasea酶可以将单克隆抗体和海兔毒素进行定点偶联并获得均一的，dar≈4的adcs，且所获得cla12hl-vcmmae偶联物具有良好的稳定性和靶向性，能在体外和小鼠体内对肿瘤细胞进行有效的杀伤，但起效较慢，且需要将药物浓度维持在一个较高的水平，cla12hl-vcmmae在杀伤肿瘤的过程中，小鼠的状态一直良好，未见对小鼠的其他组织有明显的毒副作用。序列表<110>浙江大学<120>一种抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>492<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metlysleuargvalglyglnthrleuglythrileproargglncys151015gluvalleuleuleuleuleuleuleuglyleuvalaspglyglnleu202530glnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergluthrleu354045serleuthrcysthrvalserglyglyserilesersersersertyr505560tyrtrpglytrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile65707580glyseriletyrtyrserglyserthrtyrtyrasnproserleulys859095serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu100105110lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala115120125arghisvalglyhisgluleuasptyrtrpglyglnglythrleuval130135140thrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleuala145150155160proserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycysleu165170175vallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnsergly180185190alaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserser195200205glyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleu210215220glythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthr225230235240lysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthrhisthr245250255cysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalphe260265270leupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrpro275280285gluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluval290295300lyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthr305310315320lysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalserval325330335leuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscys340345350lysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrileser355360365lysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupropro370375380serarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuval385390395400lysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglus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lulys15当前第1页12