抑制TNFα的稳定和可溶的抗体的制作方法

本申请是申请日为2009年6月25日、发明名称为“抑制tnfα的稳定和可溶的抗体”的中国发明专利申请no.200980123825x的分案申请。相关信息本申请要求2008年6月25日提交的us61/075,640和2008年6月26日提交的us61/075,956的优先权。发明背景肿瘤坏死因子α(tnfα，也称为恶液质素)是由许多细胞类型(包括单核细胞和巨噬细胞)响应内毒素或其他刺激物而产生的天然发生的哺乳动物细胞因子。tnfα是炎性、免疫和病理生理反应的主要介体(mediator)(grell,m.，等人(1995)cell,83:793-802)。可溶性tnfα通过前体跨膜蛋白的断裂而形成(kriegler，等人(1988)cell53:45-53)，并且分泌的17kda多肽装配成可溶性同三聚体复合物(smith，等人(1987),j.biol.chem.262:6951-6954；关于tnfa的综述，参见butler，等人(1986),nature320:584；old(1986),science230:630)。然后这些复合物结合在多种细胞上发现的受体。结合产生一系列促炎效应，包括(i)释放其他促炎细胞因子例如白细胞介素il-6、il-8和il-1，(ii)释放基质金属蛋白酶和(iii)上调内皮粘附分子的表达，从而通过诱集白细胞进入血管外组织来进一步放大炎性和免疫级联。许多病症与升高的tnfα水平关联，它们中的许多具有显著的医学重要性。已显示tnfα在许多人类疾病中上调，所述疾病包括慢性疾病例如类风湿性关节炎(ra)、炎性肠病包括克罗恩病和溃疡性结肠炎、脓毒症、充血性心力衰竭、支气管哮喘(asthmabronchiale)和多发性硬化。人tnfα转基因小鼠组成型地产生高水平的tnfα并且发展与ra相似的自发性、破坏性多关节炎(keffer等人1991，emboj.，10,4025-4031)。tnfα因而被称为促炎细胞因子。tnfα现已被认为是ra(其为特征在于多关节炎症和破坏的慢性进行性和使人虚弱的疾病，具有全身性的发热以及不适和疲劳症状)发病机制中的关键因子。ra还导致慢性滑液炎症，且经常进展至关节软骨和骨破坏。在ra患者的滑液和外周血中都发现了增加的tnfα水平。当给ra患者施用tnfα阻断剂时，他们减少了炎症，改善了症状和延缓了关节损伤(mckown等人(1999)，arthritisrheum.42:1204-1208)。在生理学上，tnfα还与抵抗特定感染的保护作用关联(cerami.等人(1988)，immunol.today9:28)。tnfα由已被革兰氏阴性细菌的脂多糖活化的巨噬细胞释放。因此，tnfα似乎为参与和细菌性脓毒症关联的内毒性休克的发展和发病机制的具有中心重要性的内源性介体(michie，等人(1989)，br.j.surg.76:670-671.；debets.等人(1989)，secondviennashockforum，p.463-466；simpson，等人(1989)crit.careclin.5:27-47；waage等人(1987).lancet1:355-357；hammerle.等人(1989)secondviennashockforump.715-718；debets.等人(1989)，crit.caremed.17:489-497；calandra.等人(1990)，j.infect.dis.161:982-987；revhaug等人(1988)，arch.surg.123:162-170)。至于其他器官系统，还已显示tnfα在中枢神经系统中，特别是在神经系统的炎性和自身免疫性病症(包括多发性硬化、格-巴二氏综合征(guillain-barresyndrome)和重症肌无力)和在神经系统的退行性疾病(包括阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病)中起着至关重要的作用。tnfα还牵涉视网膜和肌肉的相关系统的病症(包括视神经炎、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、皮肌炎、肌萎缩侧索硬化和肌营养不良)以及对神经系统的损伤(包括创伤性脑损伤、急性脊髓损伤和中风)。肝炎是除了其他诱发剂(trigger)以外可由病毒感染(包括eb病毒(epstein-barrvirus)、巨细胞病毒和甲型-戊型肝炎病毒)引起的另一种tnfα相关炎性病症。肝炎引发肝门和小叶区域中的急性肝炎症，然后引发纤维化和肿瘤进展。tnfα还可介导引起主要的癌症发病率和死亡率的癌症的恶病质(tisdalemj.(2004)，langenbecksarchsurg.389:299-305)。tnfα在炎症、细胞免疫应答和许多疾病的病理学中所起的至关重要的作用已导致对于tnfα的拮抗剂的研究。设计用于治疗tnfα介导的疾病的一种tnfα拮抗剂是特异性结合tnfα，从而阻断其功能的抗体或抗体片段。抗tnfα抗体的使用已显示，tnfα的阻断可逆转由tnfα促成的效应，包括il-1、gm-csf、il-6、il-8、粘附分子和组织破坏的减少(feldmann等人(1997)，adv.immunol.1997:283-350)。最近已成为商购可获得的tnfα的特异性抑制剂包括已在ra和克罗恩病的治疗中显示临床效果的抗tnfα的单克隆嵌合小鼠-人抗体(英利昔单抗、remicadetm；centocorcorporation/johnson&johnson)。以团注的形式(这导致稳定地减少直至下一次注射的高起始浓度)每周一次或以更长的间隔静脉内或皮下施用所有市售的tnfα抑制剂。它们的分布容积(volumeofdistribution)是有限的。尽管获得这些进展，但仍然需要用于治疗tnfα相关病症例如ra的新型有效的抗体或其他免疫结合剂。特别地，迫切需要对于关节炎和其他tnfα介导的病症的有效且持续的治疗具有最佳功能性质的免疫结合剂，其允许更灵活的施用和配制方式并且具有提高的组织渗透性从而增加分布容积。发明概述因此，本发明的一般目的是提供在体外和体内特异性结合tnfα的稳定和可溶的抗体或其他免疫结合剂。在优选实施方案中，所述免疫结合剂是scfv抗体或fab片段。本发明提供了特异于tnfα的稳定和可溶的scfv抗体和fab片段，其包含就稳定性、溶解性、对tnfα的体外和体内结合以及低免疫原性进行最优化的特定轻链和重链序列。所述抗体经设计用于tnfα介导的病症的诊断和/或治疗。还公开了用于表达本发明的重组抗体的核酸、载体和宿主细胞、用于分离其的方法和所述抗体在医药中的用途。附图概述图1描述了来自44个抗-tnfrabmab杂交瘤的上清液在结合tnfα(biacore测定)和中和其活性(l929测定)中的相对能力。图2描述了20种抗tnfrabmab单链抗体和7种人源化抗tnf单链抗体在选择性结合tnfα中的能力(elisa分泌测定，请注意对于该测定使用来自细菌培养物的上清液，未就单链抗体的含量对其进行标准化)。图3描述了ep43max(图3a)和ep34max(图3b)对人tnfα的结合动力学。图4描述了ep43max的效力(空心方块)，esba105的效力(实心圆)。ep43max的ec50为1ng/ml并且esba105的ec50为6.5ng/ml。图5描述了ep43max、ep6max和ep19max在热去折叠测定(ftir)中的性能。图6描述了ep43max和其衍生物的热变性曲线，如通过ftir分析比较的。图7描述了ep43max(图7a)和其ep43minmax变体(图7b)在热胁迫测试中的比较。图8描述了本文中用于将抗原结合部位从兔单克隆抗体移植入高度可溶且稳定的人抗体构架的cdrh1的界定。图9a举例说明epi34max和阿达木单抗阻断1000pg/ml重组人tnfα的细胞毒性活性(鼠l929细胞)的潜能。ep34max和阿达木单抗的ic50分别被测定为1.03ng/ml和8.46ng/ml。图9b举例说明阿达木单抗和ep34max阻断10pg/ml重组人tnfα的细胞毒性活性(人kym-1细胞)的潜能。英利昔单抗和ep34max(791)的ic50分别被测定为66.2ng/ml和0.69ng/ml。图10a举例说明epi34max和英利昔单抗阻断1000pg/ml重组人tnfα的细胞毒性活性(鼠l929细胞)的潜能。ep34max和英利昔单抗的ic50分别被测定为1.04ng/ml和13.9ng/ml。图10b举例说明英利昔单抗和ep34max(791)阻断10pg/ml重组人tnfα的细胞毒性活性(人kym-1细胞)的潜能。英利昔单抗和ep34max的ic50分别被测定为14.8ng/ml和0.63ng/ml。图11举例说明与esba903相比较，从ep34max的酰胺i带区域中的傅里叶变换红外光谱拟合的bioatrft-ir热变性曲线图。esba903的v50为71.12，且ep34max的v50为71.50；esba903的斜率为2.481，ep34max的斜率为2.540。图12举例说明ep34max和esba903scfv抗体的dsc热去折叠曲线。ep34max的tm为78.11℃，esba903的tm为76.19℃。发明详述本发明的一般目的是提供在体外和体内特异性结合tnfα的稳定和可溶的免疫结合剂。在优选实施方案中，所述抗体衍生物是scfv抗体或fab片段。本发明的免疫结合剂优选包含轻链和/或重链。定义为了可更容易地理解本发明，如下定义某些术语。另外的定义示于本说明书的上下文中。本文中使用的术语“抗体”是“免疫球蛋白”的同义词。根据本发明的抗体可以是完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，例如单个可变结构域，fv(skerraa.和pluckthun，a.(1988)science240：1038-41)，scfv(bird，r.e.等人(1988)science242：423-26；huston，j.s.等人(1988；proc.natl.acad.sci.usa85：5879-83)，fab，(fab')2或本领域技术人员熟知的其他片段。术语“cdr”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个cdr的最常用的定义之一由kabate.a.等人，(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.nihpublication91-3242)提供。如本文中使用的，cdr的kabat定义只应用于轻链可变结构域的cdr1、cdr2和cdr3(cdrl1、cdrl2、cdrl3或l1、l2、l3)，以及重链可变结构域的cdr2和cdr3(cdrh2、cdrh3或h2、h3)。然而，如本文中使用的，根据下列残基(kabat编号)定义重链可变结构域的cdr1(cdrh1或h1)：其始于位置26并且终止于位置36之前。这基本上是由kabat和chotia分别定义的cdrh1的融合物(关于示例说明，也参见图8)。本文中使用的术语“抗体构架”是指可变结构域vl或vh的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(cdr)的支架。从本质上讲，其是不具有cdr的可变结构域。术语“单链抗体”、“单链fv”或“scfv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；vh)和抗体轻链可变结构域(或区域；vl)的分子。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh-cooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。术语“免疫结合剂”是指分子，所述分子包含抗体的全部或部分抗原结合位置，例如重链和/或轻链可变结构域的全部或一部分，以便免疫结合剂能够特异性识别靶抗原。免疫结合剂的非限定性实例包括全长免疫球蛋白分子和scfv，以及抗体片段，包括但不限于(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的二价片段，(iii)fab'片段；(iv)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(v)包含抗体的单臂的vl和vh结构域的fv片段；(vi)单结构域抗体例如dab片段，其由vh或vl结构域组成，camelid或shark抗体(例如，sharkig-nars)；和(vii)纳米抗体(nanobody)，包含可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。如本文中使用的，用于确定抗体重链和轻链可变区中的氨基酸残基位置的编号系统相应于由a.honegger，j.mol.biol.309(2001)657-670定义的系统(aho系统)。aho系统与由kabat等人(kabat，e.a.，等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，u.s.departmentofhealthandhumanservices，nihpublicationno.91-3242)定义的最常用的系统之间的换算表提供于a.honegger，j.mol.biol.309(2001)657-670中。术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原(例如，tnf)上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸。参见，例如，epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology，第66卷，g.e.morris，ed.(1996)。术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7m，例如大约小于10-8m、10-9m或10-10m或更小的亲和力(kd)结合。术语"kd"是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体以小于大约10-7m，例如小于大约10-8m、10-9m或10-10m或更小的解离平衡常数(kd)结合tnf，例如，如使用表面等离子体共振(spr)技术在biacore仪中测定的。如本文中所使用的，“同一性”是指两个多肽、分子之间或两个核酸之间匹配的序列。当两个进行比较的序列中的位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据(例如，如果两个dna分子的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的位置都被赖氨酸占据)时，各个分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置的数目除以进行比较的位置的数目再乘以100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来提供。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller的算法(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)中的gap程序的needleman和wunsch(jmolbiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16，14，12，10，8，6或4的缺口权重和1，2，3，4，5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。“相似的”序列是当比对时共有相同和相似氨基酸残基的序列，其中相似的残基是进行比对的参照序列中的相应氨基酸残基的保守置换。在这点上，参照序列中的残基的“保守置换”是用在物理或功能上与相应的参照残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。因此，“经保守置换修饰的”序列是与参照序列或野生型序列相异在于存在一个或多个保守置换的序列。两个序列之间的“百分数相似性”是包含由两个序列共有的匹配残基或保守置换的位置的数目除以进行比较的位置的数目x100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配以及10个位置中有2个包含保守置换，那么这两个序列具有80％的正相似性。如本文中使用的，术语“保守的序列修饰”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守的序列修饰包括核苷酸和氨基酸置换、添加和缺失。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入修饰。保守氨基酸置换包括其中用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代人抗vegf抗体中的预测的非必需氨基酸残基。鉴定不消除抗原结合作用的核苷酸和氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997))。本文中使用的“氨基酸共有序列”是指可使用至少两个，优选更多的进行比对的氨基酸序列的矩阵产生的氨基酸序列(允许在比对中出现缺口)，其使得可能确定各位置上出现频率最高的氨基酸残基。共有序列是包含在各位置上出现频率最高的氨基酸的序列。如果两个或更多个氨基酸等同地出现在单个位置上，那么共有序列包括两个或所有此类氨基酸。可在不同水平上分析蛋白质的氨基酸序列。例如，可在单个残基水平、多个残基水平、具有缺口的多个残基水平等上展示保守性或变异性。残基可展示相同残基的保守性或可在种类水平上保守。氨基酸种类的实例包括具有下列的氨基酸种类：极性的但不带电荷的r基团(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；带正电荷的r基团(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；带负电荷的r基团(谷氨酸和天冬氨酸)；疏水r基团(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸种类(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他种类对于本领域技术人员来说是已知的并且可使用结构测定法或其他数据来定义以估量可置换性。在该意义上，可置换的氨基酸可以指可在该位置上进行置换并且保持功能保守性的任何氨基酸。然而，将认识到，相同种类的氨基酸在它们的生物物理性质上可具有一定程度的不同。例如，将认识到，某些疏水性r基团(例如，丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸)比其他疏水性r基团(例如，缬氨酸或亮氨酸)更加亲水(即，具有更高的亲水性或更低的疏水性)。相对亲水性或疏水性可使用本领域公知的方法(参见，例如，rose等人,science,229:834-838(1985)和cornette等人,jmol.biol,195:659-685(1987))来测定。如本文中所使用的，当一个氨基酸序列(例如，第一vh或vl序列)与一个或多个另外的氨基酸序列(例如，数据库中的一个或多个vh或vl序列)比对时，可将一个序列(例如，第一vh或vl序列)中的氨基酸位置与一个或多个另外的氨基酸序列中的“相应位置”相比较。如本文中所使用的，“相应位置”表示当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性或百分数相似性时进行比较的序列中的等同位置。如本文中使用的，"嵌合"免疫结合剂具有与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源的重链和/或轻链的部分，同时链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列同一或同源。本文中使用的人源化抗体是一种嵌合抗体。如本文中使用的，"人源化抗体"是使用重组dna技术合成以规避对外来抗原的免疫应答的免疫结合剂。人源化是用于减少异种来源的单克隆抗体的免疫原性的良好建立的技术。人源化抗体由人源化的重链可变区、人源化的轻链可变区和完全人恒定结构域组成。可变区的人源化包括受体构架的选择(通常人受体构架)、待插入可变结构域受体构架的来自供体免疫结合剂的cdr的范围和来自供体构架的残基至受体构架内的置换。用于将cdr移植入人受体构架的一般方法已由winter在美国专利5,225,539(其以其全文通过引用合并入本文)中公开。us6,407,213(其教导以其全文通过引用合并入本文)公开了构架的许多氨基酸位置，其中来自供体免疫结合剂的置换是优选的。如本文中所使用的，术语“功能性质”是例如为了提高多肽的生产性质或治疗功效，其提高(例如相对于常规多肽)对于本领域技术人员来说是期望的和/或有利的多肽(例如，免疫结合剂)的性质。在一个实施方案中，功能性质是提高的稳定性(例如，热稳定性)。在另一个实施方案中，功能性质是提高的溶解性(例如，在细胞条件下)。在另一个实施方案中，功能性质是非聚集性。在另一个实施方案中，功能性质是表达(例如，在原核细胞中)的提高。在另一个实施方案中，功能性质是在内含体纯化方法后重折叠产量的提高。在某些实施方案中，功能性质不是抗原结合亲和力的提高。术语“核酸分子”是指dna分子和rna分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链dna。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可将另外的dna区段连接至其中的环状双链dna环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将另外的dna区段连接至病毒基因组中。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在已将它们引入其中的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而它们可随宿主基因组一起复制。术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(escherichiacoli)或沙门氏菌(salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)；肺炎球菌(pneumococcus)；链球菌(streptococcus)和流感嗜血菌(haemophilusinfluenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(pichiapastoris)。适当的动物宿主细胞系包括cho(中国仓鼠卵巢细胞系)和ns0细胞。术语“治疗”、“疗法”和“医治”是指本文中描述的治疗性或预防性措施。“治疗”的方法利用给有此治疗需要的受试者(例如，患有tnfα介导的病症的受试者或最终可能获得这样的病症的受试者)施用本发明的抗体以预防、治愈、延迟、减轻病症或复发性病症的严重度或改善其一个或多个症状，或以延长在这样的治疗不存在的情况下所预期的受试者的存活。术语"tnf介导的病症"或"tnf介导的疾病"是指其症状或疾病状态的发作、进展或持续需要tnf的参与的任何病症。示例性tnf介导的病症包括但不限于，一般炎症的慢性和/或自身免疫性状态、免疫介导的一般炎性病症、炎性cns疾病、影响眼、关节、皮肤、粘膜、中枢神经系统、胃肠道、泌尿道或肺的炎性疾病、一般葡萄膜炎的状态、视网膜炎、hla-b27+葡萄膜炎、贝切特氏病(behcet'sdisease)、干眼综合征、青光眼、干燥综合征、糖尿病(包括糖尿病性神经病变)、胰岛素抵抗、一般关节炎的状态、类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎和赖特综合征(reiter'ssyndrome)、青少年关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、格-巴二氏综合征、重症肌无力、肌萎缩性侧索硬化、结节病、肾小球肾炎、慢性肾病、膀胱炎、银屑病(包括银屑病性关节炎)、化脓性汗腺炎、脂膜炎、坏疽性脓皮病、sapho综合征(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、痤疮、斯威特氏综合征(sweet'ssydrome)、天疱疮、克罗恩病(包括肠外表现)、溃疡性结肠炎、支气管哮喘、超敏性肺炎、普通变态反应(generalallergies)、变应性鼻炎、变应性鼻窦炎、慢性阻塞性肺病(copd)、肺纤维化、韦格纳氏肉芽肿(wegener'sgranulomatosis)、川崎综合征(kawasakisyndrome)、巨细胞动脉炎、变应性肉芽肿性血管炎(churg-straussvasculitis)、结节性多动脉炎、烧伤、移植物抗宿主病、宿主抗移植物反应、器官或骨髓移植后的排斥事件、一般脉管炎的全身性和局部状态、系统性和盘状红斑狼疮、多肌炎和皮肌炎、硬皮病、先兆子痫、急性和慢性胰腺炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、手术后炎症例如眼手术(例如白内障(晶状体置换)或青光眼手术)、关节手术(包括关节镜手术)、关节相关结构(例如韧带)上的手术，口腔和/或牙科手术、微创心血管手术(例如ptca，旋切术，支架放置)，腹腔镜和/或内窥镜腹膜内和妇科学手术、内窥镜泌尿学手术(例如前列腺手术、输尿管镜检查术、膀胱镜检查、间质性膀胱炎)后的炎症或一般地手术期间的炎症(预防)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、贝尔麻痹、克雅病(creutzfeld-jakobdisease)、癌症相关骨质溶解、癌症相关炎症、癌症相关疼痛、癌症相关恶病质、骨转移瘤(bonemetastases)、急性和慢性疼痛(无论此类疾病是否由tnfα的中心或外周作用引起以及无论它们是被分类为炎性、伤害性还是神经病性疼痛)，坐骨神经痛、腰痛、腕管综合征、复杂性局部疼痛综合征(crps)、痛风、疱疹后神经痛、纤维肌痛、局部疼痛状态、转移性肿瘤引起的慢性疼痛综合征、痛经(dismenorrhea)、细菌性、病毒性或真菌性脓毒症、肺结核、aids、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、高血压、血脂异常、心功能不全和慢性心力衰竭。术语"有效剂量"或"有效给药量"是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。对于该用途有效的量将取决于待治疗的病症的严重度和患者自己的免疫系统的总体状态。术语“受试者”是指任何人或非人动物。例如，本发明的方法和组合物可用于治疗患有tnf介导的病症的受试者。术语"兔类动物"是指分类学兔形目(lagomorpha)的成员，包括兔科(leporidae)(例如野兔和兔)和鼠兔科(ochotonidae)(鼠兔)。在优选实施方案中，兔类动物是兔。本文中使用的术语“兔”是指属于兔科的动物。不同的命名法被用于产生的免疫结合剂。此类免疫结合剂通常利用编号(例如#34)来确定。在使用前缀例如ep或epi的情况下(例如，ep34，其与epi34或#34相同)，表示相同的免疫结合剂。除非另外指出，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但下面描述了适当的方法和材料。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例只是举例说明性的而非限定性的。在下列部分更详细地描述本发明的多个方面。应理解，可随意组合不同实施方案、参数和范围。此外，取决于具体的实施方案，可不使用选择的定义、实施方案或范围。抗tnfα抗体在一个方面，本发明提供了结合tnfα，从而适合于在体内阻断tnfα的功能的免疫结合剂。此类免疫结合剂的cdr来源于us7,431,927中公开的兔抗tnfα单克隆抗体。已知兔抗体具有特别高的亲和力。此外，本文中公开的cdr序列是天然序列，这意味着所得的免疫结合剂不必进行亲和力成熟。在优选实施方案中，免疫结合剂体内中和tnfα。在某些实施方案中，本发明提供了特异性结合tnfα的免疫结合剂，其包括cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2或cdrl3氨基酸序列中的至少一个。用于本发明的免疫结合剂的示例性cdr氨基酸序列示于seqidno:3-50(表1)中。可使用任何本领域内公认的方法将seqidno:3-50中所示的cdr移植至任何适当的结合支架(参见例如，riechmann，l.等人(1998)nature332:323-327；jones，p.等人(1986)nature321:522-525；queen，c.等人(1989)proc.natlacad.see.u.s.a.86:10029-10033；属于winter的美国专利5,225,539和属于queen等人的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。可将来自不同亲本抗体的cdr组合入一个抗体中以产生另外的抗体种类。然而，优选，人源化本文中公开的免疫结合剂，从而使其适合用于治疗性应用。因此，在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人tnfα的免疫结合剂，所述免疫结合剂包含:(i)人源化的重链可变区(vh)，所述重链可变区包含人重链可变构架序列和源于兔免疫结合剂的cdrh1、cdrh2和cdrh3序列；和/或(ii)人源化的轻链可变区(vl)，所述轻链可变区包含人轻链可变构架序列和源于兔免疫结合剂的cdrl1、cdrl2和cdrl3序列。如本领域中已知的，许多兔vh链具有额外的成对的半胱氨酸(相对于鼠和人的对应物)。除了在cys22与cys92之间形成的保守的二硫桥外，在一些兔链中还存在cys21-cys79桥以及在cdrh1的最后一个残基与cdrh2的第一个残基之间形成的cdr间s-s桥。此外，经常在cdr-l3中发现成对的半胱氨酸残基。此外，许多兔抗体cdr不属于任何之前已知的经典结构(canonicalstructure)。特别地，cdr-l3通常比人或鼠对应物的cdr-l3长得多。除了兔之外，本发明还可用于移植任何兔类动物的cdr。在抗体的情况下，可将seqidno：3-50中所示的兔cdr移植入来自任何物种的任何抗体的构架区。然而，之前已发现，包含在所谓的“质量控制”筛选(wo0148017)中鉴定的构架的抗体或抗体衍生物的特征在于普遍较高的稳定性和/或溶解性，从而其还可用于细胞外应用例如中和人tnfα的背景中。此外，还已发现，这些vl(可变轻链)和vh(可变重链)可溶性和稳定的构架的一个特定组合特别适合于容纳兔cdr。令人惊讶地发现，在移植入所述构架或其衍生物后，许多种兔cdr的环构象可得到完全保持，且很大程度上不依赖于供体构架的序列。此外，与兔野生型单链相比，包含不同兔cdr的所述构架或其衍生物可进行良好的表达和良好的产生，并且仍然几乎完全保持原始供体兔抗体的亲和力。因此，在一个实施方案中，将seqidno：3-50中所示的cdr移植入通过ep1479694中公开的“质量控制”筛选获得的人抗体构架。用于本发明的示例性构架的氨基酸序列示于下列的seqidno：1和2中。seqidno1fw1.4的可变轻链eivmtqspstlsasvgdrviitc(x)n＝3-50wyqqkpgkapklliy(x)n＝3-50vpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyyc(x)n＝3-50fgqgtkltvlgseqidno2fw1.4的可变重链evqlvesggglvqpggslrlscaas(x)n＝3-50wvrqapgkglewvs(x)n＝3-50rftisrdnskntlylqmnslraedtavyycak(x)n＝3-50wgqgtlvtvssx可以是任意天然发生的氨基酸。可存在至少3个和多至50个氨基酸。通常将cdr插入其中x存在的位置。在其他实施方案中，本发明提供了特异性结合tnfα的免疫结合剂，其包含vh或vl氨基酸序列中的至少一个。用于本发明的免疫结合剂的示例性vh或vl氨基酸序列示于seqidno：51-111中。在某些实施方案中，本发明还提供了特异性结合tnfα的免疫结合剂，其包含与seqidno：51-111中所示的氨基酸序列具有大体上的相似性的氨基酸序列，并且其中所述免疫结合剂保持或改善了本发明的抗tnfα免疫结合剂的期望的功能性质。示例性百分比相似性包括但不限于大约50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的同一性。在某些实施方案中，本发明还提供了特异性结合tnfα的免疫结合剂，其包含与seqidno：51-111中所示的氨基酸序列具有大体上的同一性的氨基酸序列，并且其中所述免疫结合剂保持或改善了本发明的抗tnfα免疫结合剂的期望的功能性质。示例性百分比同一性包括但不限于大约50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的同一性。在某些实施方案中，本发明还提供了特异性结合tnfα的免疫结合剂，其包含具有相对于seqidno：51-111中所示的氨基酸序列的保守置换的氨基酸序列，并且其中所述免疫结合剂保持或改善了本发明的抗tnfα免疫结合剂的期望的功能性质。在最优选的实施方案中，本发明的免疫结合剂包含至少一个与seqidno：3-50中的任一个至少80％，更优选至少85％，90％，95％或100％同一的cdr序列。在本发明的优选实施方案中，提供了免疫结合剂，其包含由seqidno3-8组成的组中的至少1个，优选2个、3个、4个、5个或最优选6个cdr。在本发明的另一个优选实施方案中，提供了免疫结合剂，其包含由seqidno9-14组成的组中的至少1个，优选2个、3个、4个、5个或最优选6个cdr。在本发明的另一个优选实施方案中，提供了免疫结合剂，其包含由seqidno:15-20组成的组中的至少1个，优选2个、3个、4个、5个或最优选6个cdr。在本发明的另一个优选实施方案中，提供了免疫结合剂，其包含由seqidno:21-26组成的组中的至少1个，优选2个、3个、4个、5个或最优选6个cdr。在本发明的另一个优选实施方案中，提供了免疫结合剂，其包含由seqidno:27-32组成的组中的至少1个，优选2个、3个、4个、5个或最优选6个cdr。在本发明的另一个优选实施方案中，提供了免疫结合剂，其包含由seqidno:33-38组成的组中的至少1个，优选2个、3个、4个、5个或最优选6个cdr。在本发明的另一个优选实施方案中，提供了免疫结合剂，其包含由seqidno:39-44组成的组中的至少1个，优选2个、3个、4个、5个或最优选6个cdr。在本发明的另一个优选实施方案中，提供了免疫结合剂，其包含由seqidno:45-50组成的组中的至少1个，优选2个、3个、4个、5个或最优选6个cdr。本文中于seqidno:3-50中提供的cdr序列还可包含置换。优选，所述序列具有3个，更优选2个和最优选仅1个置换。所述置换优选使免疫结合剂的选择性结合能力不被削弱但使所述免疫结合剂的亲和力改变，优选增强。表1.rabmab供体cdr在另一个实施方案中，本发明提供了抗体，所述抗体结合人tnfα上被包含表1中所示的一组cdr(h1-h3、l1-l3；属于一个rabmab克隆)的单克隆抗体识别的表位。可基于它们在标准tnf结合测定中与表1的抗体交叉竞争的能力来鉴定此类抗体。测试抗体抑制表1的抗体与人tnfα的结合的能力证明所述测试抗体可与表1的抗体竞争对人tnfα的结合，从而牵涉人tnfα上与表1的抗体识别的相同的表位。在优选的实施方案中，结合人tnfα上的与表1中所示的抗体相同的表位的抗体是人单克隆抗体。可如本文中所述制备和分离这样的人单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体片段是单链抗体(scfv)或fab片段。在scfv抗体的情况下，可利用柔性接头以任一方向将选择的vl结构域连接至选择的vh结构域。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成。在本发明的优选实施方案中，使用(ggggs)4接头(seqidno:72)或其衍生物，但也可使用1-3个重复的变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94-106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.immunother.50:51-59描述。排列可以是nh2-vl-接头-vh-cooh或nh2-vh-接头-vl-cooh，前者的方向是优选的方向。在fab片段的情况下，将选择的轻链可变结构域vl融合至人igκ链的恒定区，同时将适当的重链可变结构域vh融合至人igg的第一(n-末端)恒定结构域ch1。在c末端，在两个恒定结构域之间形成链间二硫桥。本发明的抗体或抗体衍生物可具有对人tnf的亲和力，且解离常数kd在1fm-10μm的范围内。在本发明的优选实施方案中，kd≤1nm。可使用适当的方法(berzofsky等"antibody-antigeninteractions"，fundamentalimmunology，paul，w.e.，ed，ravenpress:newyork，ny(1992)；kuby，j.immunology，w.h.freemanandcompany:newyork，ny)和本文中描述的方法通过实验测定抗体对抗原的亲和力。优选的抗体包括具有来自下列vh和vl序列(以下划线标示cdr序列)的可变重链(vh)和/或可变轻链(vl)区的抗体：seqidno：51ep43minvhevqlvesggglvqpggslrlscaasgfslssgamswvrqapgkglewvsviissgatyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakggpddsnsmgtfdpwgqgtlvtvssseqidno：52ep43minvleivmtqspstlsasvgdrviitcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgseqidno：53ep43maxvhevqlvesggglvqpggslrlsctvsgfslssgamswvrqapgkglewvgviissgatyyaswakgrftiskdtskntvylqmnslraedtavyycarggpddsnsmgtfdpwgqgtlvtvssseqidno：54ep43maxvleivmtqspstlsasvgdrviikcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgfpsrfsgsgsgaeftltisglepadfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgseqidno：55ep43maxdhpvhevqlvesgggsvqpggslrlsctvsgfslssgamswvrqapgkglewvgviissgatyyaswakgrftiskdtskntvylqmnslraedtatyycarggpddsnsmgtfdpwgqgtsvtvssseqidno：56ep43minmaxvl：t22kvleivmtqspstlsasvgdrviikcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgseqidno：57ep43minmaxvl：v58fvleivmtqspstlsasvgdrviitcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgfpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgseqidno：58ep43minmaxvl：q79evleivmtqspstlsasvgdrviitcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslepddfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgseqidno：59ep43minmaxvl：d81avleivmtqspstlsasvgdrviitcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpadfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgseqidno：60eplminvhevqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsndaiswvrqapgkglewvsyisdwsiryyanwaqgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgapgagdngiwgqgtlvtvss注意：ep1mincdr-h1不匹配ep1max的cdr-h1seqidno：61ep1minvleivmtqspstlsasvgdrviitcqstesvyknnylawyqqkpgkapklliydastlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycagyyrsgsgtangsfgqgtkltvlgseqidno：62ep1maxvhevqlvesgggsvqpggslrlsctvsgidlsndaiswvrqapgkglewvayisdwsiryyanwaqgrftiskdtskntvylqmnslraedtatyycargapgagdngiwgqgttvtvssseqidno：63ep1maxvleivmtqspstlsasvgdrviitcqstesvyknnylawyqqkpgkapklliydastlasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyycagyyrsgsgtangsfgqgtkltvlgseqidno：64ep6minvhevqlvesggglvqpggslrlscaasgfslsrygvswvrqapgkglewvstigeagrayyanwarsrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgevfnngwgafniwgqgtlvtvssseqidno：65ep6minvleivmtqspstlsasvgdrviitcqasesiysglawyqqkpgkapklliyqastlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycqqgfgtsnvenpfgqgtkltvlgseqidno：66ep6maxvhevqlvesggglvqpggslrlsctvsgfslsrygvswvrqapgkglewvgtigeagrayyanwarsrstisrdtskntvylqmnslraedtavyycargevfnngwgafniwgqgtlvtvssseqidno：67ep6maxvleivmtqspstlsasvgdrviitcqasesiysglawyqqkpgkapklliyqastlasgvpsrfsgsgsgtdftlaisslqpddfatyycqqgfgtsnvenpfgqgtkltvlgseqidno：68ep15minvhevqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsrygvswvrqapgkglewvsaigetgrayyanwaksrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgeefnngwgafniwgqgtlvtvssseqidno:69ep15minvleivmtqspstlsasvgdrviitcqaseniytslawyqqkpgkapklliysastlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycqqgfatsnvenpfgqgtkltvlgseqidno:70ep15maxvhevqlvesgggsvqpggslrlsctvsgfslsrygvswvrqapgkglewvgaigetgrayyanwaksrstisrdtskntvylqmnslraedtatyycargeefnngwgafniwgqgttvtvssseqidno:71ep15maxvleivmtqspstlsasvgdrviitcqaseniytslawyqqkpgkapklliysastlasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqgfatsnvenpfgqgtkltvlgseqidno:72甘氨酸-丝氨酸接头ggggsggggsggggsggggsseqidno:73ep19maxmodvhevqlvesggglvqpggslrlsctvsgfslnsneiswvrqapgkglewvgyignggmthyaswakgrftisrdtskntvylqmnslraedtavyycassveytdlyylniwgqgtlvtvssseqidno：74ep19maxmodvleivmtqspstlsasvgdrviitcqasdniyrglawyqqkpgkapklliydastlqsgvpsrfsgsgsgtqftltisslqpddfatyyclgvygyssddgaafgqgtkltvlgseqidno:75ep19minmodvhevqlvesggglvqpggslrlscaasgfslnsneiswvrqapgkglewvsyignggmthyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaksveytdlyylniwgqgtlvtvssseqidno：76ep19minmodvleivmtqspstlsasvgdrviitcqasdniyrglawyqqkpgkapklliydastlqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyyclgvygyssddgaafgqgtkltvlgseqidno:77ep34minvhevqlvesggglvqpggslrlscaasgftisrsywicwvrqapgkglewvsciygdnditplyanwakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaklgyadyaydlwgqgtlvtvssseqidno：78ep34minvleivmtqspstlsasvgdrviitcqssqsvygniwmawyqqkpgkapklliyqasklasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycqgnfntgdryafgqgtkltvlgseqidno：79ep34maxvhevqlvesggglvqpggslrlsctasgftisrsywicwvrqapgkglewvaciygdnditplyanwakgrfpvstdtskntvylqmnslraedtavyycarlgyadyaydlwgqgtlvtvssseqidno：80ep34maxvleivmtqspstlsaslgdrviitcqssqsvygniwmawyqqksgkapklliyqasklasgvpsrfsgsgsgaefsltisslqpddfatyycqgnfntgdryafgqgtkltvlgseqidno：81ep35minvhevqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsvgywicwvrqapgkglewvscidagtsggtyyatwakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgvssngyyfklwgqgtlvtvssseqidno：82ep35minvleivmtqspstlsasvgdrviitcqasqsisnllawyqqkpgkapklliyaasklasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycqqgwshtnvdntfgqgtkltvlgseqidno：83ep35maxvhevqlvesgggsvqpggslrlsctasgfsfsvgywicwvrqapgkglewvacidagtsggtyyatwakgrftiskdtskntvylqmnslraedtatyycargvssngyyfklwgqgttvtvssseqidno:84ep35maxvleivmtqspstlsasvgdrviitcqasqsisnllawyqqkpgkapkllivaasklasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqgwshtnvdntfgqgtkltvlgseqidno：85ep42minvhevqlvesggglvqpggslrlscaasgftfrndaiswvrqapgkglewvsyisdwgikyyaswvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgapgagdngiwgqgtlvtvss注意：ep42mincdr-h1不匹配ep42max的cdr-h1seqidno：86ep42minvleivmtqspstlsasvgdrviitcqstesvyknnylawyqqkpgkapklliydastlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycagyyrsgfgtangsfgqgtkltvlgseqidno:87ep42maxvhevqlvesgggsvqpggslrlsctvsgidlrndaiswvrqapgkglewvsyisdwgikyyaswvkgrftiskdtskntvylqmnslraedtatyycargapgagdngiwgqgttvtvssseqidno：88ep42maxvleivmtqspstlsasvgdrviitcqstesvyknnylawyqqkpgkapklliydastlasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyycagyyrsgfgtangsfgqgtkltvlg抗tnf抗体的产生本发明至少部分基于发现：通过质量控制(qc)测定鉴定的高度可溶且稳定的人抗体构架是特别适合于接纳来自其他非人动物物种的cdr例如兔cdr的构架。特别地，本发明基于发现：特定人抗体(所谓的″fw1.4″抗体)的轻链和重链可变区特别适合用作来自具有不同结合特异性的多种兔抗体的cdr的受体。虽然当在hela细胞中表达时，并且当与其原始cdr(如wo03097697中公开的)一起使用时，esbatech的人单链构架fw1.4在质量控制测定中明显表现不佳，然而令人惊讶地发现，当与其他cdr例如兔cdr组合时，其产生非常稳定、可溶且可良好地产生的单链抗体。此外，通过将兔cdr移植入此类高度相容的轻链和重链构架所产生的人源化免疫结合剂持续且可靠地保持了供体cdr所源自的兔抗体的结合性质。此外，通过本发明的方法产生的免疫结合剂可靠地展示优良的功能性质例如溶解性和稳定性。因此，本发明的一般目的是提供将兔和其他非人cdr移植入可溶且稳定的轻链和/或重链人抗体构架(分别地，seqidno：1(k127)和seqidno：2(a43))，从而产生具有优良的生物物理性质的人源化抗体的方法。在优选实施方案中，构架在重链构架(vh)中在选自位置h24、h25、h56、h82、h84、h89和h108(aho编号系统)的位置处包含一个或多个置换。另外或可选择地，构架可在轻链构架(vh)中在根据aho编号系统的位置l87处包含置换。已显示所述置换的存在提供了几乎完全保持原始供体抗体的亲和力的受体构架。在更优选的实施方案中，选自下列的一个或多个置换存在于构架序列中：根据aho编号系统的位置h24处的苏氨酸(t)、位置h25处的缬氨酸(v)、位置h56处的甘氨酸(g)或丙氨酸(a)、位置h82处的赖氨酸(k)、位置h84处的苏氨酸(t)、位置h89处的缬氨酸(v)和位置h108处的精氨酸(r)及位置l87处的苏氨酸(t)。因此，在更优选的实施方案中，所述受体构架是：seqidno.89：rfw1.4的可变重链构架evqlvesggglvqpggslrlsctas(x)n＝3-50wvrqapgkglewvg(x)n＝3-50rftisrdtskntvylqmnslraedtavyycar(x)n＝3-50wgqgtlvtvssseqidno.90：rfw1.4(v2)的可变重链构架evqlvesggglvqpggslrlsctvs(x)n＝3-50wvrqapgkglewvg(x)n＝3-50rftiskdtskntvylqmnslraedtavyycar(x)n＝3-50wgqgtlvtvssseqidno.91：fw1.4的经置换的可变轻链构架eivmtqspstlsasvgdrviitc(x)n＝3-50wyqqkpgkapklliy(x)n＝3-50gvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyyc(x)n＝3-50fgqgtkltvlgseqidn0.92：rfw1.4的构架eivmtqspstlsasvgdrviitc(x)n＝3-50wyqqkpgkapklliy(x)n＝3-50gvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyyc(x)n＝3-50fgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctas(x)n＝3-50wvrqapgkglewvg(x)n＝3-50rftisrdtskntvylqmnslraedtavyycar(x)n＝3-50wgqgtlvtvssseqidn0.93：rfw1.4(v2)的构架eivmtqspstlsasvgdrviitc(x)n＝3-50wyqqkpgkapklliy(x)n＝3-50gvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyyc(x)n＝3-50fgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctvs(x)n＝3-50wvrqapgkglewvg(x)n＝3-50rftiskdtskntvylqmnslraedtavyycar(x)n＝3-50wgqgtlvtvssx可以是任何天然发生的氨基酸；可存在至少3个和多至50个氨基酸。通常将cdr插入其中x存在的位置。可使用重组遗传学领域内的常规技术产生本发明的抗体或抗体衍生物。在已知多肽的序列的情况下，可通过本领域熟知的方法通过基因合成产生编码其的cdna。可将此类cdna克隆入适当的载体质粒。一旦获得编码vl和/或vh结构域的dna，便可进行定点诱变(例如使用诱变引物通过pcr进行的定点诱变)以获得各种衍生物。可基于vl和/或vh序列中期望的改变的数目来选择最佳“起始”序列。优选的序列是tb-a序列和其衍生物，例如scfv序列或fab融合肽序列可被选择作为pcr驱动的诱变和/或克隆的模板。用于将cdr整合入或移植入构架区的方法包括例如riechmann，l.等人(1998)nature332:323-327；jones，p.等人(1986)nature321:522-525；queen，c.等人(1989)proc.natlacad.see.u.s.a.86:10029-10033；属于winter的美国专利5,225,539和属于queen的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370中所示的方法以及分别于2008年6月25日和2009年2月4日提交的、名称为"humanizationofrabbitantibodiesusinguniversalantibodyframeworks"的美国临时申请系列号61/075,697和61/155,041中公开的方法。可使用本领域技术人员熟知的标准克隆和诱变技术来连接接头、改组结构域或构建用于产生fab片段的融合物。公开本发明的一般方法的基本方案描述于molecularcloning，alaboratorymanual(sambrook&russell，第3版，2001)和currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等人，1999)中。将具有编码scfv多肽的基因的dna序列，或在fab片段的情况下，编码两个分开的基因或包含vl-cκ和vh-ch1融合物的两个基因的双顺反子操纵子的dna序列克隆入适当的表达载体，优选具有诱导型启动子的表达载体。必须注意，在各基因之前存在适当的核糖体结合位点以确保翻译。应当理解，本发明的抗体包含公开的序列而非由公开的序列组成。例如，克隆策略可要求制备从其产生在n末端具有一个或一些另外的残基的抗体的构建体。具体地，来源于起始密码子的甲硫氨酸可存在于终蛋白质中(在其中其在翻译后未被切割的情况下)。大多数scfv抗体的构建体在n末端产生另外的丙氨酸。在本发明的优选实施方案中，选择用于大肠杆菌的周质表达的表达载体(krebber，1997)。所述载体在可切割的信号序列之前包含启动子。然后将抗体肽的编码序列符合读框地融合至可切割的信号序列。这允许将表达的多肽靶向在其中信号序列被切割的细菌周质。然后折叠抗体。在fab片段的情况下，必须将vl-cκ和vh-ch1融合肽都连接至输出信号。在肽到达周质后在c末端半胱氨酸上形成共价s-s键。如果抗体的细胞质表达是优选的，那么通常可以以高产量从内含体获得所述抗体，所述内含体可容易地与其他细胞片段和蛋白质分离。在该情况下，将内含体溶解在变性剂例如盐酸胍(gndhcl)中，然后利用本领域技术人员熟知的复性方法使其重折叠。将表达scfv或fab多肽的质粒引入适当的宿主细胞，优选细菌、酵母或哺乳动物细胞，最优选适当的大肠杆菌菌株，如例如jm83(用于周质表达)或bl21(用于在内含体中表达)。可从周质或内含体收获多肽并且使用本领域技术人员已知的标准技术例如离子交换层析、反相层析、亲和层析和/或凝胶过滤来纯化所述多肽。可就产量、体外溶解性和稳定性表征本发明的抗体或抗体衍生物。可使用wo9729131中描述的重组人tnf，利用elisa或表面等离子体共振(biacore)体外测试对tnf，优选对人tnfα的结合能力，后一种方法还允许测定koff速率常数，其优选应当小于10-3s-1。kd值≤10nm是优选的。除了对于人tnf具有强的结合亲和力的抗体外，还期望产生在治疗方面具有有益的性质的抗tnf抗体。例如，抗体可以是在l929tnfα介导的细胞毒性测定中显示中和活性的抗体。在该测定中，用重组人tnf(htnf)诱导用放线菌素处理的小鼠l929成纤维细胞的毒性。在1000pg/ml的tnf浓度上测定到90％的最大htnf诱导的细胞毒性。将所有l929细胞培养在具有酚红，具有l-谷氨酰胺培养基，补充有胎牛血清(10％v/v)的rpmi1640中。在不含酚红的rpmi1640和5％胎牛血清中估量抗tnfa结合剂的中和活性。在存在1000pg/mlhtnf的情况下向l929细胞中加入不同浓度(0-374ng/ml)的抗tnf结合剂以测定拮抗作用达到半最大抑制(ec50％)时所处的浓度。剂量响应曲线用具有可变斜率的非线性s形回归(sigmoidalregression)拟合并且计算ec50。经优化的变体可就增强的功能性质例如增强的溶解性和/或稳定性进一步优化本发明的抗体。在某些实施方案中，按照2008年3月12日提交的pct申请系列号pct/ep2008/001958(名称为"sequencebasedengineeringandoptimizationofsinglechainantibodies"，其通过引用合并入本文)中公开的“功能共有序列”方法优化本发明的抗体。例如，可将本发明的tnfα免疫结合剂与功能性选择的scfv的数据库进行比较以鉴定比vegf免疫结合剂中的相应位置更耐受变异性或更不耐受变异性的氨基酸残基位置，从而表明此类鉴定的残基位置可适合用于改造以改善功能性例如稳定性和/或溶解性。用于置换的示例性构架位置描述于2008年6月25日提交的pct申请pct/ch2008/000285(名称为"methodsofmodifyingantibodies，andmodifiedantibodieswithimprovedfunctionalproperties")和2008年6月25日提交的pct申请pct/ch2008/000284(名称为"sequencebasedengineeringandoptimizationofsinglechainantibodies")中。例如，可在本发明的免疫结合剂的重链可变区中在氨基酸位置(对于下文列出的每一个氨基酸位置参照aho编号)上引入一个或多个下列置换：(a)氨基酸位置1处的q或e；(b)氨基酸位置6处的q或e；(c)氨基酸位置7处的t、s或a，更优选t或a，更优选t；(d)氨基酸位置10处的a、t、p、v或d，更优选t、p、v或d，(e)氨基酸位置12处的l或v，更优选l，(f)氨基酸位置13处的v、r、q、m或k，更优选v、r、q或m，(g)氨基酸位置14处的r，m，e，q或k，更优选r，m，e或q，更优选r或e；(h)氨基酸位置19处的l或v，更优选l；(i)氨基酸位置20处的r，t，k或n，更优选r，t或n，更优选n；(j)氨基酸位置21处的i，f，l或v，更优选i，f或l，更优选i或l；(k)氨基酸位置45处的r或k，更优选k；(l)氨基酸位置47处的t，p，v，a或r，更优选t，p、v或r，更优选r；(m)氨基酸位置50处的k，q、h或e，更优选k、h或e，更优选k；(n)氨基酸位置55处的m或i，更优选i；(o)氨基酸位置77处的k或r，更优选k；(p)氨基酸位置78处的a、v、l或i，更优选a、l或i，更优选a；(q)氨基酸位置82处的e，r，t或a，更优选e，t或a，更优选e；(r)氨基酸位置86处的t，s，i或l，更优选t，s或l，更优选t；(s)氨基酸位置87处的d，s，n或g，更优选d，n或g，更优选n；(t)氨基酸位置89处的a，v，l或f，更优选a，v或f，更优选v；(u)氨基酸位置90处的f，s，h，d或y，更优选f，s，h或d；(v)氨基酸位置92处的d，q或e，更优选d或q，更优选d；(w)氨基酸位置95处的g，n，t或s，更优选g，n或t，更优选g；(x)氨基酸位置98处的t，a，p，f或s，更优选t，a，p或f，更优选f；(y)氨基酸位置103处的r，q，v，i、m，f或l，更优选r，q，i，m，f或l，更优选y，更优选l；和(z)氨基酸位置107处的n，s或a，更优选n或s，更优选n。另外地或可选择地，可将一个或多个下列置换引入本发明的免疫结合剂的轻链可变区：(aa)氨基酸位置1处的q，d，l，e，s或i，更优选l，e，s或i，更优选l或e；(bb)氨基酸位置2处的s，a，y，i，p或t，更优选a，y，i，p或t，更优选p或t；(cc)氨基酸位置3处的q，v，t或i，更优选v，t或i，更优选v或t；(dd)氨基酸位置4处的v，l，i或m，更优选v或l；(ee)氨基酸位置7处的s，e或p，更优选s或e，更优选s；(ff)氨基酸位置10处的t或i，更优选i；(gg)氨基酸位置11处的a或v，更优选a；(hh)氨基酸位置12处的s或y，更优选y；(ii)氨基酸位置14处的t，s或a，更优选t或s，更优选t；(jj)氨基酸位置18处的s或r，更优选s；(kk)氨基酸位置20处的t或r，更优选r；(ll)氨基酸位置24处的r或q，更优选q；(mm)氨基酸位置46处的h或q，更优选h；(nn)氨基酸位置47处的k，r或i，更优选r或i，更优选r；(oo)氨基酸位置50处的r，q，k，e，t或m，更优选q，k，e，t或m；(pp)氨基酸位置53处的k，t，s，n，q或p，更优选t，s，n，q或p；(qq)氨基酸位置56处的i或m，更优选m；(rr)氨基酸位置57处的h，s，f或y，更优选h，s或f；(ss)氨基酸位置74处的i，v或t，更优选v或t，r，更优选t；(tt)氨基酸位置82处的r，q或k，更优选r或q，更优选r；(uu)氨基酸位置91处的l或f，更优选f；(vv)氨基酸位置92处的g，d，t或a，更优选g，d或t，更优选t；(xx)氨基酸位置94处的s或n，更优选n；(yy)氨基酸位置101处的f，y或s，更优选y或s，更优选s；和(zz)氨基酸位置103处的d，f，h，e，l，a，t，v、s，g或i，更优选h，e，l，a，t，v，s，g或i，更优选a或v。在其他实施方案中，本发明的免疫结合剂包含一个或多个2008年6月25日提交的美国临时申请系列号61/075,692(名称为“solubilityoptimizationofimmunobinders”)中描述的溶解性和/或稳定性增强突变。在某些优选实施方案中，免疫结合剂在选自由12、103和144(aho编号约定)组成的重链氨基酸位置的氨基酸位置处包含溶解性增强突变。在一个优选实施方案中，免疫结合剂包含一个或多个选自下列的置换：(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(s)；(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(s)或苏氨酸(t)；和(c)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(s)或苏氨酸(t)。在另一个实施方案中，免疫结合剂包含下列置换：(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(s)；(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(s)或苏氨酸(t)；和(c)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(s)或苏氨酸(t)。如上所述，可通过接头序列改组和组合vl和vh序列(特别是具有相同组或大体上相同组的cdr序列但具有不同构架序列(例如由于存在上述置换)的vl和vh序列)的组合。示例性组合包括但不限于：seqidno：94ep43mineivmtqspstlsasvgdrviitcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlscaasgfslssgamswvrqapgkglewvsviissgatyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakggpddsnsmgtfdpwgqgtlvtvssseqidno:95ep43maxeivmtqspstlsasvgdrviikcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgfpsrfsgsgsgaeftltisglepadfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctvsgfslssgamswvrqapgkglewvgviissgatyyaswakgrftiskdtskntvylqmnslraedtavyycarggpddsnsmgtfdpwgqgtlvtvssseqidno:96ep43minmaxeivmtqspstlsasvgdrviitcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctvsgfslssgamswvrqapgkglewvgviissgatyyaswakgrftiskdtskntvylqmnslraedtavyycarggpddsnsmgtfdpwgqgtlvtvssseqidno:97ep43maxdhpeivmtqspstlsasvgdrviikcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgfpsrfsgsgsgaeftltisglepadfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesgggsvqpggslrlsctvsgfslssgamswvrqapgkglewvgviissgatyyaswakgrftiskdtskntvylqmnslraedtatyycarggpddsnsmgtfdpwgqgtsvtvssseqidno:98ep43minmaxdhpeivmtqspstlsasvgdrviitcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesgggsvqpggslrlsctvsgfslssgamswvrqapgkglewvgviissgatyyaswakgrftiskdtskntvylqmnslraedtatyycarggpddsnsmgtfdpwgqgtsvtvssseqidno:99ep43minmaxvl:t22keivmtqspstlsasvgdrviikcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctvsgfslssgamswvrqapgkglewvgviissgatyyaswakgrftiskdtskntvylqmnslraedtavyycarggpddsnsmgtfdpwgqgtlvtvssseqidno:100ep43minmax:vl:v58feivmtqspstlsasvgdrviitcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgfpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctvsgfslssgamswvrqapgkglewvgviissgatyyaswakgrftiskdtskntvylqmnslraedtavyycarggpddsnsmgtfdpwgqgtlvtvssseqidno:101ep43minmaxvl:d81aeivmtqspstlsasvgdrviitcqasqsisdwlawyqqkpgkapklliygasrlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpadfatyycqqgwsdsyvdnlfgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctvsgfslssgamswvrqapgkglewvgviissgatyyaswakgrftiskdtskntvylqmnslraedtavyycarggpddsnsmgtfdpwgqgtlvtvssseqidno:102ep43minmaxvl:q79eeivmtqspstlsasvgdrviitcqa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ggsvqpggslrlsctvsgidlrndaiswvrqapgkglewvsyisdwgikyyaswvkgrftiskdtskntvylqmnslraedtatyycargapgagdngiwgqgttvtvssseqidno:121ep42minmaxeivmtqspstlsasvgdrviitcqstesvyknnylawyqqkpgkapklliydastlasgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyycagyyrsgfgtangsfgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesgggsvqpggslrlsctvsgidlrndaiswvrqapgkglewvsyisdwgikyyaswvkgrftiskdtskntvylqmnslraedtatyycargapgagdngiwgqgttvtvss在优选实施方案中，序列与seqidno.94-121的任一个具有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性和最优选100％的同一性。抗tnf抗体的用途对于治疗性应用，以药学上可接受的剂型例如上述剂型(包括可以以推注的形式静脉内或通过在一段时间内的持续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径给人施用的剂型)给哺乳动物优选人施用本发明的抗tnf抗体。还可以适当地通过瘤内、肿瘤旁、损伤内(intralesional)或损伤周围(perilesional)途径施用抗体以产生局部及全身性治疗效应。为了预防或治疗疾病，适当的抗体剂量将取决于待治疗的疾病的类型(如上所定义的)、疾病的严重度和进程、是为了预防目的还是为了治疗目的施用抗体、以前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答以及主治医生的判断。适当地在一次或在一系列治疗中给患者施用抗体。抗tnf抗体可用于治疗tnf介导的疾病。取决于疾病的类型和严重度，大约1μg/kg至大约50mg/kg(例如，0.1-20mg/kg)的抗体是用于给患者施用的初始候选剂量，无论例如是通过一次或更多次分开的施用还是通过连续输注。取决于上述因素，典型的每日剂量或每周剂量可在大约1μg/kg至大约20mg/kg或更多的范围内。对于在数天或更长的时间内的重复施用，取决于条件，重复治疗直至发生期望的疾病症状的抑制。然而，可使用其他给药方案。该治疗的进展可通过常规技术和测定(包括例如放射肿瘤成像)容易地监控。根据本发明的其他实施方案，可通过连续施用抗体或与对于此类目的有效的另一种试剂组合施用抗体来提高抗体预防或治疗疾病的功效，所述另一种试剂例如血管内皮生长因子(vegf)、能够抑制或中和酸性或碱性成纤维细胞生长因子(fgf)或肝细胞生长因子(hgf)的血管生成活性的抗体、能够抑制或中和组织因子、蛋白质c或蛋白质s的凝血剂活性的抗体(参见esmon等人，1991年2月21日公开的pct专利公开案wo91/01753)、能够结合her2受体的抗体(参见hudziak等人，1989年7月27日公开的pct专利公开案wo89/06692)或一个或多个常规治疗剂例如烷化剂、叶酸拮抗剂、核酸代谢的抗代谢物、抗生素类、嘧啶类似物，5-氟尿嘧啶、顺铂、嘌呤核苷、胺、氨基酸、三唑核苷或皮质类固醇。此类其他试剂可存在于将要施用的组合物中或可分开施用。此外，适当地连续或与放射治疗(无论是照射还是施用放射性物质)组合施用抗体。本发明的抗体可用作亲和纯化剂。在该方法中，使用本领域内熟知的方法将抗体固定在固相例如sephadex树脂或滤纸上。将固定的抗体与待纯化的包含tnf蛋白(或其片段)的样品接触，然后用基本上除去样品中的所有物质(除了结合至固定的抗体的tnf蛋白外)的适当的溶剂洗涤支持物。最后，用使tnf蛋白从抗体释放的另一种适当的溶剂例如甘氨酸缓冲液ph5.0洗涤支持物。抗tnf抗体还可用于tnf蛋白的诊断测定，例如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。此类诊断法可用于癌症诊断。对于诊断应用，通常用可检测的部分标记抗体。许多标记是可获得的，其通常可分类为以下类别：(a)放射性同位素例如111in、99tc、14c、131i、125i、3h、32p或35s。可使用例如currentprotocolsinimmunology，第1和2卷，coligen等人，ed.wiley-interscience，newyork，n.y.，pubs.(1991)中描述的技术用放射性同位素标记抗体，并且可使用闪烁计数测量放射性。(b)荧光标记例如稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素和其衍生物、罗丹明和其衍生物、丹(磺)酰、丽丝胺(lissamine)、藻红蛋白和德克萨斯红是可获得的。可使用例如currentprotocolsinimmunology(同上)中公开的技术将荧光标记缀合至抗体。可使用荧光计定量荧光。(c)各种酶-底物标记是可获得的，美国专利4,275,149提供了一些此类标记的综述。酶通常催化生色底物的化学变化，所述化学变化可使用各种技术测量。例如，酶可催化底物的颜色变化，所述颜色变化可通过分光光度计测量。可选择地，酶可改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光的变化的技术描述于上文中。化学发光底物通过化学反应被电子激发，然后可发射可测量的(例如使用化学发光仪(chemiluminometer)或给荧光受体提供能量的光。酶标记的实例包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(hrpo)、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和6-磷酸葡糖脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶缀合至抗体的技术描述于o'sullivan等人，methodsforthepreparationofenzyme-antibodyconjugatesforuseinenzymeimmunoassay，inmethodsinenzym.(edj.langone&h.vanvunakis)，academicpress，newyork，73:147-166(1981)中。酶-底物组合的实例包括例如：(i)辣根过氧化物酶(hrpo)和过氧化氢酶(作为底物)，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(opd)或盐酸3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb))；(ii)碱性磷酸酶(ap)和对-硝基苯基磷酸盐(作为生色底物)；和(iii)β-d-半乳糖苷酶(β-d-gal)和生色底物(例如，对-硝基苯基-β-d-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β-d-半乳糖苷酶。许多其他酶-底物组合对于本领域技术人员来说是可获得的。关于此类组合的一般综述，参见美国专利4,275,149和4,318,980。有时，将标记与抗体间接缀合。本领域技术人员了解用于实现该目的的各种技术。例如，可将抗体与生物素缀合，并且可将上述3个广泛类别的标记中的任一种与抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性结合抗生物素蛋白，从而，可以以间接的方式将标记与抗体缀合。备选地，为了实现标记与抗体的间接缀合，用小的半抗原(例如，地高辛)缀合抗体，用抗半抗原的抗体(例如，抗地高辛抗体)缀合上述不同类型的标记之一。从而，可实现标记与抗体的间接缀合。在本发明的另一个实施方案中，不必标记抗tnf抗体，并且可使用结合tnf抗体的标记抗体检测其存在。本发明的抗体可用于任何已知的测定方法，例如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。zola，monoclonalantibodies:amanualoftechniques，pp.147-158(crcpress，inc.1987)。竞争性结合测定依赖于标记的标准品与测试样品分析物竞争与有限量的抗体的结合的能力。测试样品中tnf蛋白的量与结合至抗体的标准品的量成反比。为了帮助测定结合的标准品的量，通常在竞争之前或之后使抗体不溶解，以便可方便地将结合至抗体的标准品和分析物与保持未结合的标准品和分析物分开。夹心测定涉及两种抗体(各自能够结合待检测的蛋白质的不同免疫原性部分或表位)的使用。在夹心测定中，测试样品分析物被固定在固体支持物上的第一抗体结合，然后第二抗体结合分析物，从而形成不溶性三部分复合物。参见，例如美国专利4,376,110。第二抗体本身可用可检测的部分标记(直接夹心测定)或可使用用可检测的部分标记的抗免疫球蛋白抗体测量(间接夹心测定)。例如，一种类型的夹心测定是elisa测定，在该情况下可检测的部分是酶。对于免疫组织化学，肿瘤样品可以是新鲜的或冷冻的或可包埋在石蜡中和用防腐剂例如福尔马林固定。抗体还可用于体内诊断测定。通常，用放射性核素(例如111in、99tc、14c、131i、125i、3h、32p或35s)标记抗体，以便能够使用免疫闪烁成像(immunoscintiography)定位肿瘤。本发明的抗体还可提供于试剂盒(预先确定量的试剂与用于进行诊断测定的说明书的包装组合)中。在用酶标记抗体的情况下，试剂盒可包括酶所需的底物和辅因子(例如提供可检测的生色团或荧光团的底物前体)。此外，可包括其他添加剂例如稳定剂、缓冲剂(例如，封闭缓冲剂或裂解缓冲剂)等。各种试剂的相对量可广泛地变化以在溶液中提供显著优化测定的灵敏性的试剂的浓度。特别地，可以以包含赋形剂的无水粉剂(通常冻干的)的形式提供试剂，当其溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液。药物制剂在一个方面，本发明提供了含有用于治疗tnf介导的疾病的抗tnf抗体的药物制剂。术语"药物制剂"是指以这样的形式存在的制剂，所述形式允许抗体或抗体衍生物的生物学活性明确有效，并且所述制剂不包含对将给其施用所述制剂的受试者有毒的另外的成分。“药学上可接受的”赋形剂(媒介物、添加剂)是可适当地给受试哺乳动物施用以提供有效剂量的使用的活性成分的那些。“稳定的”制剂是其中的抗体或抗体衍生物在贮存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域内是可获得的并且综述于例如peptideandproteindrugdelivery，247-301，vincentleeed.，marceldekker，inc.，newyork，n.y.，pubs.(1991)和jones，a.adv.drugdeliveryrev.10:29-90(1993)中。可在选择的温度下测量稳定性，并进行选择的时间。优选，制剂在室温(大约30℃)或在40℃下稳定至少1个月和/或在大约2-8℃下稳定至少1年，至少2年。此外，制剂优选在制剂的冷冻(至例如，-70℃)和解冻后稳定。如果抗体或抗体衍生物在颜色和/或澄清度的目测检查时或如通过uv光散射或通过尺寸排阻层析所测量的，没有显示聚集、沉淀和/或变性的迹象，那么其在药物制剂中“保持其物理稳定性”。如果在给定的时间上化学稳定性是使蛋白质被认为仍然保持其生物学活性(如下文中所定义的)的化学稳定性，那么抗体或抗体衍生物在药物制剂中“保持其化学稳定性”。可通过检测和定量蛋白质的化学改变的形式来估量化学稳定性。化学变化可包括大小改变(例如，剪切(clipping))，其可使用例如尺寸排阻层析、sds-page和/或基质辅助激光解吸附电离/飞行时间质谱(maldi/tofms)来评估。其他类型的化学变化包括可通过例如离子交换层析来评估的电荷变化(例如，由于脱酰胺作用而发生的)。如果在给定的时间上抗体的生物学活性在制备药物制剂时所展示的生物学活性的大约10％内(在测定的误差内)(如在例如抗原结合测定中所测定的)，那么抗体或抗体衍生物在药物制剂中“保持其生物学活性”。在下文中详尽地阐述抗体的其他“生物学活性”测定。“等渗的”意指目的制剂具有与人血液大体上相同的渗透压。等渗制剂通常具有大约250至350mosm的渗透压。可使用例如蒸汽压或冰冷冻型渗透计(ice-freezingtypeosmometer)测量等渗性。“多元醇”是具有多个羟基的物质，其包括糖(还原性和非还原性糖)、糖醇和糖酸。本文中优选的多元醇具有小于大约600kd(例如，在大约120至大约400kd的范围内)的分子量。“还原性糖”是包含可还原金属离子或与蛋白质中的赖氨酸和其他氨基共价反应的半缩醛基团的糖，“非还原性糖”是不具有还原性糖的此类性质的糖。还原性糖的实例是果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非还原性糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖。甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、苏糖醇、山梨糖醇和甘油是糖醇的实例。至于糖酸，其包括l-葡糖酸和其金属盐。在期望制剂是冷冻-融化稳定的情况下，多元醇优选是在冷冻温度(例如-20℃)下不结晶(结晶使得制剂中的抗体不稳定)的多元醇。非还原性糖例如蔗糖和海藻糖是本文中优选的多元醇，并且由于海藻糖的优良的溶液稳定性，海藻糖优于蔗糖。如本文中使用的，“缓冲液”是指通过其酸碱共轭成分的作用抗ph变化的经缓冲的溶液。本发明的缓冲液具有范围在大约4.5至大约6.0、优选大约4.8至大约5.5内的ph；和最优选具有大约5.0的ph。可控制ph在该范围内的缓冲液的实例包括乙酸盐(例如，乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲液。在期望冷冻-融化稳定的制剂的情况下，缓冲液优选不是磷酸盐。在药理学意义上，在本发明的背景中，抗体或抗体衍生物的“治疗有效量”是指在预防或治疗病症(所述抗体或抗体衍生物对于其的治疗是有效的)中有效的量。“疾病/病症”是可受益于使用抗体或抗体衍生物的治疗的任何病况。其包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所述病症的那些病理学状况。“防腐剂”是可包含在制剂中以显著减弱其中的细菌作用，从而有助于例如多用途制剂的产生的化合物。可能的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯己双铵、苯扎氯铵(其中烷基是长链化合物的烷基苄基二甲基氯化铵的混合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳香醇例如酚、丁基和苯甲醇、对羟苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间-甲酚。本文中最优选的防腐剂是苯甲醇。本发明还提供了包含一种或多种抗体或抗体衍生物化合物以及至少一种生理上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。药物组合物可包含例如水、缓冲液(例如，中性缓冲盐溶液或磷酸缓冲盐溶液)、乙醇、矿物油、植物油、二甲基亚砜、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白质、佐剂、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂例如edta或谷胱甘肽和/或防腐剂中的一种或多种。如上文中所指出的，其他活性成分可以(但不是必须)包含在本文提供的药物组合物中。载体是可在施用给患者前与抗体或抗体衍生物结合的物质(通常用于控制化合物的稳定性或生物利用度)。用于此类制剂中的载体通常是生物相容性的，并且还可以是生物可降解的。载体包括例如单价或多价分子例如血清白蛋白(例如，人或牛)、卵白蛋白、肽、多聚赖氨酸和多糖例如氨基葡聚糖和聚酰胺胺(polyamidoamine)。载体还可包括固体支持材料例如包含例如聚乳酸聚乙醇酸、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素或葡聚糖的珠粒和微粒。载体可以以多种方式(包括共价结合(直接地或经由接头基团)、非共价相互作用或混合)携带化合物。可配制药物组合物以用于任何适当的施用方式，包括例如局部、口服、经鼻、直肠或胃肠外施用。在某些实施方案中，以适合于口服使用的形式存在的组合物是优选的。此类形式包括例如丸剂、片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮剂、可分散粉剂或粒剂、乳剂、硬或软胶囊或糖浆剂或酏剂。在其他实施方案中，可将本文提供的组合物配制为冻干剂(lyophilizate)。本文中使用的术语胃肠外包括皮下、皮内、血管内(例如，静脉内)、肌内、经脊柱、颅内、鞘内和腹膜内注射以及任何相似的注射或输注技术。可按照本领域内已知的用于制造药物组合物的任何方法制备意欲用于口服施用的组合物，其可包含一种或多种试剂例如甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂以提供吸引人且可口的制剂。片剂包含与生理上可接受的适合用于制造片剂的赋形剂混合的活性成分。此类赋形剂包括例如惰性稀释剂(例如，碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠)、粒化剂和崩解剂(例如，玉米淀粉或海藻酸)、粘合剂(例如，淀粉、明胶或阿拉伯胶)和润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石)。片剂可以是无包被的，或它们可利用在胃肠道中延迟崩解和吸收从而在更长的时期内提供持续作用的已知技术进行包被。例如，可使用时间延迟材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用于口服施用的制剂还可以以硬明胶胶囊(其中将活性成分与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合)的形式或以软明胶胶囊(其中将活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合)的形式提供。水性悬浮剂包含与适合用于制造水性悬浮剂的赋形剂混合的抗体或抗体衍生物。此类赋形剂包括混悬剂(例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶(gumtragacanth)和阿拉伯胶)；和分散剂或湿润剂(例如，天然存在的磷脂例如卵磷脂、烯烃氧化物与脂肪酸的缩合物例如聚氧乙烯硬脂酸酯、环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合物例如十七乙烯基氧鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、环氧乙烷与从脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯的缩合物例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与从脂肪酸和己糖醇酐衍生的部分酯的缩合物例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)。水性悬浮剂还可包含一种或多种防腐剂例如乙基或正丙基对羟基苯甲酸、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。可用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖配制糖浆剂和酏剂。此类制剂还可包含一种或多种缓和剂(demulcent)、防腐剂、调味剂和/或着色剂。可通过将活性成分悬浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或矿物油例如液体石蜡中来配制油性悬浮剂。油性悬浮剂可包含增稠剂例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂例如上述甜味剂和/或调味剂以提供可口的口服制剂。可通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸来保存此类悬浮剂。适合于通过加入水来制备水性悬浮剂的可分散粉剂和粒剂提供了与分散剂或湿润剂、混悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。适当的分散剂或湿润剂和混悬剂是例如上文提及的试剂。还可存在另外的赋形剂例如甜味剂、调味剂和着色剂。药物组合物还可以以水包油乳剂的形式存在。油相可以是植物油(例如橄榄油或花生油)、矿物油(例如，液体石蜡)或其混合物。适当的乳化剂包括天然存在的胶(例如，阿拉伯胶和黄蓍胶)、天然存在的磷脂(例如，大豆、卵磷脂和从脂肪酸和己糖醇衍生的酯或部分酯)、酐类(例如，去水山梨糖醇单油酸酯)以及从脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯与环氧乙烷的缩合物(例如，聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)。乳剂还可包含一种或多种甜味剂和/或调味剂。可将药物组合物配制为无菌注射水性或油性悬浮液，其中取决于所用的媒介物和浓度，将调节剂悬浮或溶解在媒介物中。还可按照现有技术，使用适当的分散剂、湿润剂和/或混悬剂例如上文提及的那些来配制这样的组合物。其中可使用的可接受的媒介物和溶剂是水、1,3-丁二醇、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油可用作溶剂或悬浮介质。为此，可使用任何非刺激性的不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，可将脂肪酸例如油酸用于制备可注射的组合物，并且可将佐剂例如局部麻醉药、防腐剂和/或缓冲剂溶解于媒介物中。还可将药物组合物配制为持续释放制剂(即，在施用后进行调节剂的缓慢释放的制剂例如胶囊)。通常可使用熟知的技术制备此类制剂，并且可通过例如口服、直肠或皮下植入，或通过在期望的靶位置植入来施用所述制剂。用于此类制剂中的载体是生物相容性的，并且还可以是生物可降解的；优选地制剂提供相对恒定水平的调节剂释放。持续释放制剂中包含的抗体或抗体衍生物的量取决于例如植入的位置、释放的速率和预期的持续时间以及待治疗或预防的疾病/病症的性质。通常以在体液(例如，血液、血浆、血清、csf、滑液、淋巴、细胞间隙液、眼泪或尿)中获得足以可检测地结合tnf以及预防或抑制tnf介导的疾病/病症的浓度的量施用本文中提供的抗体或抗体衍生物。如果剂量导致如本文中描述的可辨别的患者益处，则其被认为是有效的。优选全身性剂量的范围是大约0.1mg至大约140mg/千克体重/天(大约0.5mg至大约7g/患者/天)，且口服剂量通常为静脉内剂量的约5至20倍。可与载体材料组合以产生单个剂型的抗体或抗体衍生物的量将随治疗的宿主和具体的施用模式的变化而变化。剂量单位形式通常可包含大约1mg至大约500mg的活性成分。可包装药物组合物以治疗响应抗tnf的抗体或抗体衍生物的病症。包装的药物组合物可包括容器(其装有有效量的至少一种本文中所述的抗体或抗体衍生物)和说明书(例如，标签)(其说明包含的组合物将用于治疗响应一种抗体或抗体衍生物(在施用给患者后)的疾病/病症)。还可化学修饰本发明的抗体或抗体衍生物。优选的修饰基团是聚合物，例如任选地取代的直链或支链聚烯烃、polyalkenylene或聚氧烯烃聚合物或分支或不分支的多糖。此类效应物基团可增加抗体的体内半衰期。合成的聚合物的具体实例包括任选地取代的直链或支链聚(乙二醇)(peg)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物。特定的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。需要时可改变聚合物的大小，但其平均分子量通常在500da至50000da的范围内。对于其中抗体设计用于渗透组织的局部应用，聚合物的优选分子量是约5000da。可将聚合物分子连接至抗体，特别是经由wo0194585中所述的共价连接的铰链肽连接至fab片段重链的c末端。关于peg部分的连接，参见“poly(ethyleneglycol)chemistry，biotechnologicalandbiomedicalapplications”，1992，j.miltonharris(ed)，plenumpress，newyork和“bioconjugationproteincouplingtechniquesforthebiomedicalsciences”，1998，m.aslam和a.dent，grovepublishers，newyork。在如上所述制备目的抗体或抗体衍生物后，制备包含其的药物制剂。待配制的抗体未经历在前的冷冻干燥并且本文中的目的制剂是水性制剂。优选制剂中的抗体或抗体衍生物是抗体片段，例如scfv。通过考虑例如期望的剂量容积和施用模式来确定存在于制剂中的抗体的治疗有效量。大约0.1mg/ml至大约50mg/ml，优选大约0.5mg/ml至大约25mg/ml和最优选大约2mg/ml至大约10mg/ml是制剂中的示例性抗体浓度。在ph缓冲剂中制备包含抗体或抗体衍生物的水性制剂。本发明的缓冲剂具有大约4.5至大约6.0，优选大约4.8至大约5.5的ph，最优选具有大约5.0的ph。可控制ph在该范围内的缓冲剂的实例包括乙酸盐(例如，乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。缓冲剂的浓度可以是大约1mm至大约50mm，优选大约5mm至大约30mm，取决于例如缓冲剂和制剂的期望的等渗性。优选的缓冲剂是乙酸钠(大约10mm)，ph5.0。将可用作张力剂(tonicifier)和可稳定抗体的多元醇包含在制剂中。在优选实施方案中，制剂不包含紧张(tonicifying)量的盐例如氯化钠，因为这可引起抗体或抗体衍生物沉淀和/或可导致在低ph下的氧化作用。在优选实施方案中，多元醇是非还原性糖例如蔗糖或海藻糖。以可根据制剂的期望的等渗性而变化的量向制剂中加入多元醇。优选水性制剂是等渗的，在该情况下制剂中适当的多元醇浓度在例如大约1％至大约15％w/v的范围内，优选在大约2％至大约10％whv的范围内。然而，高渗或低渗制剂也可以是合适的。加入的多元醇的量还根据多元醇的分子量而改变。例如，与二糖(例如海藻糖)相比较，可加入更低量的单糖(例如，甘露醇)。还可向抗体或抗体衍生物制剂中加入表面活性剂。示例性表面活性剂包括非离子型表面活性剂例如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20，80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。加入的表面活性剂的量是使其减少配制的抗体/抗体衍生物的聚集和/或使制剂中颗粒的形成降至最低和/或减少吸附的量。例如，表面活性剂可以以大约0.001％至大约0.5％，优选大约0.005％至大约0.2％和最优选大约0.01％至大约0.1％的量存在于制剂中。在一个实施方案中，制剂包含上文中鉴定的试剂(即，抗体或抗体衍生物、缓冲剂、多元醇和表面活性剂)并且基本上不含一种或多种防腐剂，例如苯甲醇、苯酚、间-甲酚、氯丁醇和苄索氯铵。在另一个实施方案中，可在制剂中包含防腐剂，特别是在制剂为多剂量制剂的情况下。防腐剂的浓度可在大约0.1％至大约2％，最优选大约0.5％至大约1％的范围内。可在制剂中包含一种或多种其他药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂例如remington'spharmaceuticalsciences第21版，osol，a.ed.(2006)中描述的试剂，只要其不会不利地影响期望的制剂特征。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度上对接受者无毒，并且包括：另外的缓冲剂；共溶剂；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂例如edta；金属复合物(例如zn-蛋白质复合物)；生物可降解的聚合物例如聚酯；和/或形成盐的抗衡离子例如钠。用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可通过在配制制剂之前或之后利用无菌滤膜进行过滤来容易地实现。按照已知的方法，例如以推注的形式静脉内施用或通过在一段时间内的持续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径给需要使用所述抗体的治疗的哺乳动物优选人施用制剂。在优选实施方案中，通过静脉内施用给哺乳动物施用制剂。为此，可使用例如注射器或通过iv线注射制剂。抗体的适当剂量(“治疗有效量”)将取决于例如待治疗的病症、疾病的严重度和进程、是为了预防目的还是为了治疗目的而施用抗体、以前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、使用的抗体类型以及主治医生的判断。适当地在一次或在一系列治疗中给患者施用抗体或抗体衍生物，并且可在诊断后任何时间给患者施用抗体或抗体衍生物。抗体或抗体衍生物还可作为单一治疗或与用于治疗所述病症的其他药物或治疗剂结合进行施用。作为一般建议，施用的抗体或抗体衍生物的治疗有效量可在大约0.1至大约50mg/kg患者体重的范围内(无论通过一次还是多次施用)，且使用的抗体的常见范围为例如大约0.3至大约20mg/kg，更优选大约0.3至大约15mg/kg(每天施用一次)。然而，可以使用其他给药方案。可通过常规技术容易地监控该治疗的进展。制品在本发明的另一个实施方案中，提供了包含容器的制品，所述容器装有本发明的药物制剂，优选水性药物制剂，并且任选地提供关于其使用的说明书。适当的容器包括例如瓶子、小瓶和注射器。容器可由多种材料例如塑料或玻璃制成。示例性容器是3-20cc的一次性玻璃小瓶。可选择地，对于多剂量制剂，容器可以是3-100cc的玻璃小瓶。容器装有制剂，并且在其上或与其结合的标签可标明使用指导。制品还可包括从商业和用户立场来看期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针、注射器和具有使用说明的产品说明书。实施例本公开内容还通过下列实施例来举例说明，所述实施例不应当解释为进一步限定。本申请中提及的所有图和所有参考资料、专利和公开的专利申请的内容以它们的全文通过引用明确地合并入本文。在整个实施例中，除非另外指出，否则使用下列材料和方法。一般材料和方法一般而言，除非另外指出，否则本发明的实施使用化学、分子生物学、重组dna技术、免疫学(尤其是例如抗体技术)的常规技术和多肽制备的标准技术。参见，例如，sambrook，fritsch和maniatis，molecularcloning:coldspringharborlaboratorypress(1989)；antibodyengineeringprotocols(methodsinmolecularbiology)，510，paul，s.，humanapr(1996)；antibodyengineering:apracticalapproach(practicalapproachseries，169)，mccafferty，ed.，irlpr(1996)；antibodies:alaboratorymanual，harlow等人，c.s.h.l.press，pub.(1999)；和currentprotocolsinmolecularbiology，eds.ausubel等人，johnwiley&sons(1992)。热稳定性的测量在tensorbruker中使用ft-irbio-atrcell获得各种单链和跟踪分子的衰减全反射傅里叶变换ir(ftir-atr)光谱。将分子浓缩直至3mg/ml并且在4℃下对pbs，ph6.5透析过夜，收集缓冲液流过物(flowthrough)作为空白对照。通过对分子实施广泛温度范围(25-95℃)的热攻击(以5℃为梯度)来获得变性曲线图。使用opus软件进行所有光谱操作。从蛋白质光谱扣除主要的缓冲液和瞬时大气(co2和h2o)背景。然后对所得的蛋白质光谱进行基线修正，根据预期区域中最宽的可分辨峰的宽度测定蛋白质酰胺i光谱。使用三次多项式函数和光滑函数获得酰胺i带光谱的二阶导数光谱。通过酰胺i二阶导数分析来估计蛋白质结构的变化，使用线性校准曲线进行初始曲线拟合计算(假定对于3个更低的测量值，0％的变性和对于3个更高的测量值，100％的变性)。通过应用玻尔兹曼s形模型，将变性曲线图用于估计每种变体的热去折叠转变的中点(tm)。溶解性测量在硫酸铵存在的情况下增加蛋白质聚集和沉淀后测量各种scfv分子的相对溶解性。向蛋白质水溶液中加入硫酸铵以在终混合物盐-蛋白质中产生5％的饱和增量。凭经验确定沉淀的动态范围，将该范围中的饱和间隔减少至终混合物中的2.5％间隔饱和。在加入硫酸铵后，将样品轻轻混合，以6000rpm离心30分钟。就每一个硫酸铵饱和百分数回收上清液中剩余的蛋白质。通过使用nanodroptm1000分光光度计测量上清液中的蛋白质浓度来测定溶解性曲线。对上清液中剩余的可溶性蛋白质的测量值进行标准化，并通过应用玻尔兹曼s形模型将其用于评估每种变体的相对溶解性的中点。短期稳定性测试在40℃下温育2周后就可溶性聚集体和降解产物检查蛋白质。将具有10mg/ml浓度的蛋白质在4℃下对具有广泛ph范围(3.5，4.5，5.5，6.5，7.0，7.5和8.5)的pbs透析过夜。将在标准缓冲液pbs(ph6.5)中具有相同浓度的对照蛋白质在-80℃下贮存2周。在t＝0和t＝14天的时间点上通过sds-page测定降解条带，在sec-hplc中估量可溶性聚集物。使用biacore测定于40℃下进行2周后的剩余活性。效力测定在l929tnfa介导的细胞毒性测定中估量抗tnfa结合剂的中和活性。用重组人tnf(htnf)诱导用放射菌素处理的小鼠l929成纤维细胞的毒性。在1000pg/ml的tnf浓度上测定到90％的最大htnf诱导的细胞毒性。将所有l929细胞培养在含有酚红、含有l谷氨酰胺培养基、补充有胎牛血清(10％v/v)的rpmi1640中。在不含酚红的rpmi1640和5％胎牛血清中估量抗tnfa结合剂的中和活性。在1000pg/mlhtnf存在的情况下向l929细胞中加入不同浓度(0-374ng/ml)的抗tnf结合剂，以测定拮抗作用达到半最大抑制(ec50％)时所处的浓度。用具有可变斜率的非线性s形回归拟合剂量响应曲线并且计算ec50。抗tnfscfv的biacore结合分析对于在ph5和ph7.4(数据未显示)下的结合亲和力测量，通过使用nta传感器芯片和带his标签的tnf(在esbatech产生的)来应用使用biacoretm-t100的表面等离子体共振测量。nta传感器芯片的表面由预先固定有次氮基三乙酸(nta)(其经由ni2+nta螯合作用捕获组氨酸标记的分子)的羧甲基化的葡聚糖基质组成。人tnfan-his三聚体(5nm)通过其n末端的his-标签被镍捕获，以范围在30nm至0.014nm之间的几个浓度(3倍系列稀释梯度)注射esba105(分析物)。在再生步骤中，洗除由镍、配体和分析物形成的复合物。对于不同样品，允许使用相同的再生条件。通过表面等离子体共振(spr)技术产生应答信号并且将其测量为共振单位(ru)。所有测量在25℃下进行。在进行内联(in-line)参照室修正，然后扣除缓冲液样品后产生每一个抗tnfscfv样品的传感图。使用一对一langmuir结合模型利用biacoret100评估软件版本1.1计算表观解离速率常数(kd)、表观结合速率常数(ka)和表观解离平衡常数(kd)。实施例1:单克隆兔抗tnf抗体的cdr移植和功能性人源化。兔cdr的移植与使用与非人供体抗体共有最大序列同源性的人抗体受体构架的常规人源化方法不同，将兔cdr移植入构架fw1.4(seqidno.1和2，通过(ggggs)4接头连接)以产生min-graft，或将其移植入“兔源化的(rabbitized)”构架rfw1.4(seqidno.92)或其变体rfw1.4(v2)(seqidno.93)以产生max-graft。最初就期望的功能性质(溶解性和稳定性)、容纳多种兔cdr的结构适合性和与兔可变结构域共有序列的适当的同源性选择两种构架。构架rfw1.4是被进一步改造(目的在于用作几乎任意组兔cdr的通用受体构架)的fw1.4的衍生物。虽然稳定且可溶的构架序列fw1.4展示与兔抗体的高度同源性，但其不是可获得的最同源的序列。可能参与结合的残基的鉴定对于各个兔可变结构域序列，鉴定最接近的兔种系对应物。如果不能确定最接近的种系，那么将序列与亚型共有序列或具有高相似性百分数的兔序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为是体细胞高度突变的可能的结果，从而在抗原结合中起着重要作用。因此，考虑将此类残基移植至受体构架rfw1.4或rfw1.4(v2)上以产生max-graft。特别地，移植潜在参与直接抗原接触或影响vl和vh的排布的残基。需要时置换被描述为影响cdr结构的其他残基。当将cdr移植至fw1.4(min-graft)上时不进行构架置换。被移植以获得本文中公开的max-graft的构架位置的实例可通过进行rfw1.4、rfw1.4(v2)的构架区与本文中提供的目的scfv序列的序列比对来鉴定。本领域内已知的网络工具可以例如用于所述目的(例如，在2009年6月23日在http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html上可获得的clustalw或在2009年6月23日在http://bioinfo.genotoul.fr/multalin上可获得的multialin)。在其上rfw1.4和rfw1.4(v2)包含相同残基并且在其上目的scfv显示不同残基的所有构架位置是被移植以获得max-graft的构架位置。结构域改组将min-graft的可变轻链与max-graft的可变重链组合以鉴定就生物物理性质(溶解性和稳定性)和活性而言最佳的组合。scfv的克隆和表达如下产生本文中描述和表征的scfv。通过seqidno.72的接头连接人源化的vl序列和人源化的vh序列(seqidno:51-88，无seqidno:72)以产生下列方向的scfv：nh2-vl-接头-vh-cooh(参见例如seqidno:94-121)。在许多情况下，由服务提供商entelechongmbh(www.entelechon.com)从头合成编码各个scfv的dna序列。通过分别在scfvdna序列的5'和3'末端上引入的ncoi和hindiii限制性位点将所得的dna插入物克隆入细菌表达载体pgmp002。bamhi限制性位点位于vl结构域与vh结构域的dna序列之间。在一些情况下，不从头合成编码scfv的dna，而通过结构域改组来克隆表达scfv的构建体。因此，切取vl结构域并且通过ncoi和bamhi限制性位点将其引入新构建体，通过bamhi和hindiii限制性位点将vh结构域引入新构建体。在其他情况下，使用现有技术组装pcr法将点突变引入vh和/或vl结构域。gmp002的克隆描述于wo2008006235的实施例1中。与wo2008006235的实施例1中对于esba105的描述类似，产生scfv。实施例2:兔cdr供体抗体的表征和选择用于选择具有tnf抑制活性的兔抗体("rabmab")的一般实验方法如下：在高度可溶的tnf免疫结合剂的产生中将兔抗体用作cdr的供体抗体。用tnfα免疫兔，然后进行脾切取术。从兔分离脾细胞以用于产生杂交瘤。分离总共44个杂交瘤，并且就结合亲和力、生物学潜能和结合特异性表征来自这些杂交瘤的上清液。图1描述了来自44个抗tnfrabmab杂交瘤的上清液在体内中和tnfα中的相对能力。通过在培养的小鼠l929成纤维细胞中测量对tnfα的细胞毒性的抑制来测试中和作用。上清液在l929测定中展示不同的功效。在初次筛选(蓝色棒)和二次筛选(红色棒)中测定ec50值(达到50％抑制的有效浓度)，并且在每一个测定中针对最佳表现者进行标准化。还通过biacore分析测量每一种rabmab(绿色棒)的tnf结合亲和力。还测定由各杂交瘤编码的rabmab的序列，并将序列进行基于表位簇的预测的种系发生分析(phylogeneticanalysis)。从不同种系发生家族选择具有高结合活性和有效的中和活性的4个代表性rabmab(epi-6、epi-19、epi-34和epi-43)作为用于cdr移植的供体抗体。基于它们在分泌elisa中的有利活性(参见图2)选择另外4个(4)rabmab(epi-1、epi-15、ep-35和ep-42)用于cdr移植。实施例3:兔供体抗体的cdr移植和功能性人源化与使用与非人供体抗体共有最大序列同源性的人抗体受体构架的常规人源化方法不同，将兔cdr移植入使用质量控制测定就期望的功能性质(溶解性和稳定性)预先选择的人构架(fw1.4)。虽然稳定且可溶的构架序列展示与rabmab的高度同源性，但选择的受体抗体不是可获得的最同源的序列。对每一个rabmab产生许多cdr移植物。如本文中使用的，术语"min-graft"或"min"是指通过将来自兔可变结构域的兔cdr移植入天然存在的人受体构架(fw1.4，seqidno.172)而产生的人源化的可变结构域。在构架区中不进行改变。就期望的功能性质(溶解性和稳定性)预先选择构架本身。如本文中使用的，术语"max-graft"或"max"是指通过将来自兔可变结构域的兔cdr移植入“兔源化的”人受体构架"rabtor"(rfw1.4，seqidno.173)或移植入称为rfw1.4(v2)的其衍生物(seqidno.174)而产生的人源化的可变结构域。通过整合通常参与兔可变结构域结构和稳定性的构架位置处的保守兔残基(另外其在其他物种中是高度可变的)来制备"rabtor"构架，目的在于产生可通用的构架，所述构架几乎接受任何兔cdr组而无需移植供体构架残基(除了在这样的位置上，所述位置在它们的假定祖先序列中不同，例如在体细胞高度突变过程中被改变从而可能促进抗原结合)。假定的祖先序列定义为最接近的兔种系对应物，并且在不能确定最接近的种系对应物的情况下，定义为兔亚型共有序列或具有高相似性百分数的兔序列的共有序列。"min-max"或"minmax"是指由"min-graft"可变轻链与"max-graft"可变重链组成的人源化可变结构域，而"max-min"或"maxmin"是指由"max-graft"可变轻链与"min-graft"可变重链组成的人源化可变结构域。表2显示源于8个不同的单克隆兔抗体或rabmab(ep1，ep6，ep15，ep19，ep34，ep35，ep42和ep43)的人源化单链抗体的详细表征数据的概述。所谓的"min"移植物(例如eplmin)是指对于其只移植兔供体cdr的构建体，而对于所谓的"max"移植物，不仅移植cdr而且还移植供体构架中的一些氨基酸位置。此外，表2显示关于两个his标记的单链抗体(ep34min_c-his和ep19max_c-his)以及wo2006/131013中描述的参照单链抗体esba105的数据。称为“l929”的第三栏显示与esba105的潜能相比较的不同单链抗体的相对潜能，如在l929分析中测定的。kon、koff和kd的值分别以单位m-1s-1、s-1和m提供。第7栏提供了用ft-ir测定的热诱导的去折叠的中点。最后一栏表示在重折叠方法后从溶解的内含体获得的正确折叠的蛋白质的相对产量。图3中提供了进入表2的biacore数据的一些实例：显示了esba105(图3a)、ep43max(图3b)和ep34max结合人tnfα的结合动力学。细胞潜能测定的实例示于图4，其在l929测定中将esba105(实心圆)与ep43max(空心方块)进行比较。比较ep34max与市售抗体英利昔单抗和阿达木单抗的细胞潜能测定的其他实例示于图9和10中。表2：4个兔单克隆(ep6、ep19、ep34和ep43)以及其cdr移植变体的详细表征数据的概述。*l929[ec50-e105/ec50-x]，以质量单位[ng/ml]表示的与esba105(wo06/131013)的性能的比较**(mg/l重折叠溶液)；***未测定的实施例4：ep43max，有效的tnfα结合剂的溶解性和稳定性优化选择ep43max以基于其有效的tnf结合活性进行进一步优化。该免疫结合剂的生物物理学特征显示，其在热去折叠测定(ftir)中展示高变性中点(tm>70℃)(参见图5)。尽管如此，将ep43max经历溶解性优化以缩窄其在热去折叠中的宽转换相。为了改善天然ep43max的溶解性，用具有更高亲水性的氨基酸置换vh链中的3个残基位置12、103或144。该组合经显示增加天然蛋白质的溶解性而不影响稳定性或结合活性。引入(在aho位置12处的v→s，在aho位置103处的v→t和在aho位置144处的l→t)以替代ep43max的可变重链(vh)区的v-c结构域界面中的疏水性残基。除了增强溶解性的突变外，在ep43max中鉴定了9个稳定性突变(vl中的t10s、k47r、y57s、l91f和t103v以及vh中的e1q、e6q、s7t和v103l)(参见表3)。根据esbatech's质量控制(qc)构架的功能性共有序列分析鉴定了这些稳定性突变。在vl的位置1和3处以及vh的位置89处的稳定性残基已存在于ep43max分子中。在vl的位置4处鉴定到另外的稳定性突变(m→l)，但考虑到其在抗原结合中的预测的作用，将其消除。表3:ep43max中的稳定性突变实施例5:ep43max，有效的tnfα结合剂的经优化的变体表4和5显示了ep43max的3个经优化的变体的特征数据。ep43_maxdhp是ep43max的溶解性增强变体并且包含上述3个增强溶解性的突变(在aho位置12处的v→s，在aho位置103处的v→t和在aho位置144处的l→t)。通过"min"与"max"移植物之间的结构域改组产生ep43_maxmin和ep43_minmax变体。例如，"minmax"变体包含轻链的最小移植物(仅cdr-移植物)形式和重链的最大移植物形式(即，移植的兔cdr和参与抗原结合的兔构架残基)，而"maxmin"变体包含轻链的最大移植物形式和重链的最小移植物形式。表4:ep43max和其变体的特征数据*l929[ec50-e105/ec50-x]，以质量单位[ng/ml]表示的比较表5：ep43max和其变体的特征数据通过ftir分析比较ep43max和其经优化的变体的热变性曲线(参见图6和表6)。发现ep43minmax具有比ep43max低的去折叠中点。表6：通过ftir分析比较ep43max与其经优化的变体的热变性曲线ep43maxdhpep43maxmin(959)ep43max(676)ep43minmax(958)tm℃60，1565，8177，7851，76斜率2，6182，90810，434，297r20，99740，99690，98550，9936此外，mimax变体展示一步去折叠转变，表明两个结构域在非常相似的温度下去折叠。在热胁迫测试中进一步比较ep43max(图7a)和其ep43minmax变体(图7b)。在不断增加的温度(50、60和70℃)下热浓缩后评估β折叠含量和可溶性蛋白质的浓度。ep43minmax在60℃的中间温度下远比ep43max更稳定。实施例6：ep34max与可商购获得的tnfα结合剂的比较如上文所述在l929测定中比较ep34max、阿达木单抗和英利昔单抗阻断1000pg/ml重组人tnfα的细胞毒性活性的能力。在kym-1测定中估量ep43max、阿达木单抗和英利昔单抗阻断10pg/ml重组人tnfα的细胞毒性活性的能力。结果分别示于图9a、b和图10a、b中。图9a举例说明ep34max和阿达木单抗阻断1000pg/ml重组人tnfα的细胞毒性活性(鼠l929细胞)的潜能。ep34max和阿达木单抗的ic50分别被测定为1.03ng/ml和8.45ng/ml。图9b举例说明阿达木单抗和ep34max阻断10pg/ml重组人tnfα的细胞毒性活性(人kym-1细胞)的潜能。阿达木单抗和ep34max(791)的ic50分别被测定为66.2ng/ml和0.69ng/ml。图10a举例说明ep34max和英利昔单抗阻断1000pg/ml重组人tnfα的细胞毒性活性(鼠l929细胞)的潜能。ep34max和英利昔单抗的ic50分别被测定为1.04ng/ml和13.9ng/ml。图10b举例说明英利昔单抗和ep34max(791)阻断10pg/ml重组人tnfα的细胞毒性活性(人kym-1细胞)的潜能。英利昔单抗和ep34max的ic50分别被测定为14.98ng/ml和0.63ng/ml。因此，在两种情况下，ep34max都显示比英利昔单抗更好的性能。本发明涉及以下实施方式：1.特异性结合人tnfα的免疫结合剂，所述免疫结合剂包含:(i)人重链可变构架序列和源于兔免疫结合剂的cdrh1、cdrh2和cdrh3序列；和/或(ii)人轻链可变构架序列和源于兔免疫结合剂的cdrl1、cdrl2和cdrl3序列。2.实施方式1的免疫结合剂，其中所述人重链可变区构架与seqidno:1具有至少90％的同一性和/或所述人轻链可变区构架序列与seqidno:2具有至少85％的同一性。3.实施方式2的免疫结合剂，其中所述人重链可变区构架是或包含seqidno:1和/或所述人轻链可变区构架序列是或包含seqidno:2。4.实施方式2的免疫结合剂，其中所述人重链可变区构架是或包含seqidno:89或seqidno:90和/或所述人轻链可变区构架序列是或包含seqidno:91。5.实施方式1或2的任一项的免疫结合剂，其在重链构架(vh)中在选自根据aho编号系统的位置h24、h25、h56、h82、h84、h89和h108的位置处包含一个或多个置换；和/或在轻链构架(vl)中在根据aho编号系统的位置l87处包含置换。6.实施方式5的免疫结合剂，其中所述置换选自根据aho编号系统的位置h24处的苏氨酸(t)、位置h25处的缬氨酸(v)、位置h56处的甘氨酸(g)或丙氨酸(a)、位置h82处的赖氨酸(k)、位置h84处的苏氨酸(t)、位置h89处的缬氨酸(v)和位置h108处的精氨酸(r)及位置l87处的苏氨酸(t)。7.前述实施方式的任一项的免疫结合剂，其中所述免疫结合剂在重链氨基酸位置12、103和144(aho编号)中的至少一个位置处包含增强溶解性的置换。8.实施方式7的免疫结合剂，其中所述增强溶解性的置换选自：(a)位置12处的丝氨酸(s)；(b)位置103处的苏氨酸(t)；和(c)位置144处的苏氨酸(t)。9.前述实施方式的任一项的免疫结合剂，其还包含与选自seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7和seqidno:8的序列至少80％同一的一个或多个cdr序列。10.实施方式9的免疫结合剂，其在根据aho编号系统的轻链可变区(vl)的位置22，74，95，97和99中的至少一个位置处具有置换，优选位置l22处的苏氨酸(t)、位置l74处的苯丙氨酸(f)或酪氨酸(y)、位置l95处的谷氨酸(e)和位置l99处的丙氨酸(a)。11.实施方式9-10的任一项的免疫结合剂，其包含与选自seqidno:51、seqidno:53和seqidno:55的序列具有至少90％的序列同一性的重链可变区(vh)，和/或与选自seqidno:52、seqidno:54、seqidno:56、seqidno:57、seqidno:58和seqidno:59的序列具有至少90％的序列同一性的轻链可变区(vl)。12.实施方式9-11的任一项的免疫结合剂，其与seqidno:94、seqidno:95、seqidno:96、seqidno:97、seqidno:98、seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101和seqidno:102具有至少90％的序列同一性，优选100％的序列同一性。13.实施方式1-8的任一项的免疫结合剂，其还包含与选自seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13和seqidno:14的序列至少80％同一的一个或多个cdr序列。14.实施方式13的免疫结合剂，其包含与选自seqidno:60和seqidno:62的序列具有至少90％的序列同一性的重链可变区(vh)，和/或与选自seqidno:61和seqidno:63的序列具有至少90％的序列同一性的轻链可变区(vl)。15.实施方式14的免疫结合剂，其与seqidno:103、seqidno:104或seqidno:105具有至少90％的序列同一性，优选100％的序列同一性。16.实施方式1-8的任一项的免疫结合剂，其还包含与选自seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19和seqidno:20的序列至少80％同一的一个或多个cdr序列。17.实施方式15的免疫结合剂，其在根据aho编号系统的轻链可变区(vl)的位置87、89和92中的至少一个位置处具有置换。18.实施方式16至17的任一项的免疫结合剂，其包含与选自seqidno:64和seqidno:66的序列具有至少90％的序列同一性的重链可变区(vh)，和/或与选自seqidno:65和seqidno:67的序列具有至少90％的序列同一性的轻链可变区(vl)。19.实施方式15至18的任一项的免疫结合剂，其与seqidno:106、seqidno:107或seqidno:108具有至少90％的序列同一性，优选100％的序列同一性。20.实施方式1至8的任一项的免疫结合剂，其还包含与选自seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25和seqidno:26的序列至少80％同一的一个或多个cdr序列。21.实施方式20的免疫结合剂，所述重链构架在根据aho编号系统的构架位置85和88处具有缺失。22.实施方式20至21的任一项的免疫结合剂，其包含与选自seqidno:68和seqidno:70的序列具有至少90％的序列同一性的重链可变区(vh)，和/或与选自seqidno:69和seqidno:71的序列具有至少90％的序列同一性的轻链可变区(vl)。23.实施方式19至22的任一项的免疫结合剂，其与seqidno:109、seqidno:110或seqidno:111具有至少90％的序列同一性，优选100％的序列同一性。24.实施方式1至8的任一项的免疫结合剂，其还包含与选自seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31和seqidno:32的序列至少80％同一的一个或多个cdr序列。25.实施方式24的免疫结合剂，所述重链构架在根据aho编号系统的构架位置85和88处具有缺失。26.实施方式24至25的任一项的免疫结合剂，其在根据aho编号系统的轻链可变区(vl)的位置86和87中的至少一个位置处具有置换，优选位置l87处的苏氨酸(t)和位置l88处的谷氨酰胺(q)。27.实施方式24至26的任一项的免疫结合剂，其包含与选自seqidno:73和seqidno:75的序列具有至少90％的序列同一性的重链可变区(vh)，和/或与选自seqidno:74和seqidno:76的序列具有至少90％的序列同一性的轻链可变区(vl)。28.实施方式24至27的任一项的免疫结合剂，其与seqidno:112或seqidno:113具有至少90％的序列同一性，优选100％的序列同一性。29.实施方式1至8的任一项的免疫结合剂，其还包含与选自seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37和seqidno:38的序列至少80％同一的一个或多个cdr序列。30.实施方式29的免疫结合剂，所述重链构架在根据aho编号系统的构架位置85和88处具有缺失。31.实施方式29至30的任一项的免疫结合剂，其在根据aho编号系统的轻链可变区(vl)的位置15、48、90中的至少一个位置处具有置换。32.实施方式29至31的任一项的免疫结合剂，其包含与选自seqidno:77和seqidno:79的序列具有至少90％的序列同一性的重链可变区(vh)，和/或与选自seqidno:78和seqidno:80的序列具有至少90％的序列同一性的轻链可变区(vl)。33.实施方式29至32的任一项的免疫结合剂，其与seqidno:114或seqidno:115具有至少90％的序列同一性，优选100％的序列同一性。34.实施方式1至8的任一项的免疫结合剂，其还包含与选自seqidno:39、seqidno:40、seqidno:41、seqidno:42、seqidno:43和seqidno:44的序列至少80％同一的一个或多个cdr序列。35.实施方式34的免疫结合剂，其在根据aho编号系统的轻链可变区(vl)的位置57和87中的至少一个位置处具有置换，优选位置l57处的缬氨酸(v)和位置l87处的苏氨酸(t)。36.实施方式34至35的任一项的免疫结合剂，所述重链构架在根据aho编号系统的构架位置85和88处具有缺失。37.实施方式34至36的任一项的免疫结合剂，其在根据aho编号系统的轻链可变区的位置1、3、4、10、47、57、91和103中的至少一个位置处具有增强稳定性的置换，优选增强稳定性的置换选自(a)位置1处的谷氨酸(e)、(b)位置3处的缬氨酸(v)、(c)位置4处的亮氨酸(l)、(d)位置10处的丝氨酸(s)、(e)位置47处的精氨酸(r)、(e)位置57处的丝氨酸(s)、(f)位置91处的苯丙氨酸(f)和(g)位置103处的缬氨酸(v)。38.实施方式34至37的任一项的免疫结合剂，其包含与选自seqidno:81和seqidno:83的序列具有至少90％的序列同一性的重链可变区(vh)，和/或与选自seqidno:82和seqidno:84的序列具有至少90％的序列同一性的轻链可变区(vl)。39.实施方式34至38的任一项的免疫结合剂，其与seqidno:116、seqidno:117或seqidno:118具有至少90％的序列同一性，优选100％的序列同一性。40.实施方式1至8的任一项的免疫结合剂，其还包含与选自seqidno:45、seqidno:46、seqidno:47、seqidno:48、seqidno:49和seqidno:50的序列至少80％同一的一个或多个cdr序列。41.实施方式40的免疫结合剂，所述重链构架在根据aho编号系统的构架位置85和88处具有缺失。42.实施方式40至41的任一项的免疫结合剂，其在根据aho编号系统的轻链可变区的位置1、3、4、10、47、57、91和103中的至少一个位置处具有增强稳定性的置换，优选增强稳定性的置换选自(a)位置1处的谷氨酸(e)、(b)位置3处的缬氨酸(v)、(c)位置4处的亮氨酸(l)、(d)位置10处的丝氨酸(s)、(e)位置47处的精氨酸(r)、(e)位置57处的丝氨酸(s)、(f)位置91处的苯丙氨酸(f)和(g)位置103处的缬氨酸(v)。43.实施方式40至42的任一项的免疫结合剂，其包含与选自seqidno:85和seqidno:87的序列具有至少90％的序列同一性的重链可变区(vh)，和/或与选自seqidno:86和seqidno:88的序列具有至少90％的序列同一性的轻链可变区(vl)。44.实施方式40至43的任一项的免疫结合剂，其与seqidno:119、seqidno:120或seqidno:121具有至少90％的序列同一性，优选100％的序列同一性。45.前述实施方式的任一项的免疫结合剂，其是抗体、scfv、fab或dab。46.具有与seqidno:3-50的任何cdr不同的cdr的免疫结合剂，其与前述实施方式的任一项的免疫结合剂竞争对人tnfα的结合。47.具有与seqidno:3-50的任何cdr不同的cdr的免疫结合剂，其结合与前述实施方式的任一项的免疫结合剂结合的相同的人tnfα上的表位。48.包含前述实施方式的任一项的免疫结合剂和药学上可接受的载体的组合物。49.编码前述实施方式的任一项的可变重链区(vh)和/或可变轻链区(vl)的分离的核酸分子。50.包含实施方式49的核酸分子的表达载体。51.包含实施方式50的表达载体的宿主细胞。52.治疗或预防受试者中的人tnfα介导的疾病的方法，其包括给所述受试者施用前述实施方式的任一项的抗体以便治疗所述受试者的tnfα介导的疾病。53.实施方式52的方法，其中所述tnfα介导的疾病选自：一般炎症的慢性和/或自身免疫性状态、免疫介导的一般炎性病症、炎性cns疾病、影响眼、关节、皮肤、粘膜、中枢神经系统、胃肠道、泌尿道或肺的炎性疾病、一般葡萄膜炎的状态、视网膜炎、hla-b27+葡萄膜炎、贝切特氏病、干眼综合征、青光眼、干燥综合征、糖尿病(包括糖尿病性神经病变)、胰岛素抵抗、一般关节炎的状态、类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎和赖特综合征、青少年关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、格-巴二氏综合征、重症肌无力、肌萎缩性侧索硬化、结节病、肾小球肾炎、慢性肾病、膀胱炎、银屑病(包括银屑病性关节炎)、化脓性汗腺炎、脂膜炎、坏疽性脓皮病、sapho综合征(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、痤疮、斯威特氏综合征、天疱疮、克罗恩病(包括肠外表现)、溃疡性结肠炎、支气管哮喘、超敏性肺炎、普通变态反应、变应性鼻炎、变应性鼻窦炎、慢性阻塞性肺病(copd)、肺纤维化、韦格纳氏肉芽肿、川崎综合征、巨细胞动脉炎、变应性肉芽肿性血管炎、结节性多动脉炎、烧伤、移植物抗宿主病、宿主抗移植物反应、器官或骨髓移植后的排斥事件、一般脉管炎的全身性和局部状态、系统性和盘状红斑狼疮、多肌炎和皮肌炎、硬皮病、先兆子痫、急性和慢性胰腺炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、手术后炎症例如眼手术(例如白内障(晶状体置换)或青光眼手术)、关节手术(包括关节镜手术)、关节相关结构(例如韧带)上的手术，口腔和/或牙科手术、微创心血管手术(例如ptca，旋切术，支架放置)，腹腔镜和/或内窥镜腹膜内和妇科学手术、内窥镜泌尿学手术(例如前列腺手术、输尿管镜检查术、膀胱镜检查、间质性膀胱炎)后的炎症或一般地手术期间的炎症(预防)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、贝尔麻痹、克雅病、癌症相关骨质溶解、癌症相关炎症、癌症相关疼痛、癌症相关恶病质、骨转移瘤、急性和慢性疼痛，无论此类疼痛是否由tnfα的中心或外周作用引起以及无论它们是被分类为炎性、伤害性还是神经病性疼痛、坐骨神经痛、腰痛、腕管综合征、复杂性局部疼痛综合征(crps)、痛风、疱疹后神经痛、纤维肌痛、局部疼痛状态、转移性肿瘤引起的慢性疼痛综合征、痛经、细菌性、病毒性或真菌性脓毒症、肺结核、aids、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、高血压、血脂异常、心功能不全和慢性心力衰竭。其他实施方案应理解，本发明还包括附录a-e中所示的任何方法、参照和/或组合物。等同物根据前述说明，本发明的许多变化和备选实施方案对于本领域技术人员来说是显然的。因此，本说明书被解释为仅示例性的并且是用于教导本领域技术人员的用于进行本发明的最佳模式。结构的细节可显著改变而不背离本发明的精神，并且保留落在所附权利要求的范围内的所有变化的排他性使用。本发明意欲只限定至所附权利要求和适用的法律法规要求的程度。本说明书中引用的所有文献和类似材料包括专利、专利申请、文章、书籍、论文、学术论文、网页、图和/或附件，无论此类文献和类似材料的形式如何，都以其全文通过引用明确地合并入本文。如果一个或多个合并的文献和类似材料与本申请不同或相矛盾，包括定义的术语、术语的用法、描述的技术等，那么以本申请为准。本文中使用的章节标题仅为了组织目的，并且不被理解为以任何方式限定所述主题。虽然已结合多种实施方案和实施例描述了本发明，但本教导无意限定于此类实施方案或实施例。相反，本发明包括各种备选方案、变化和等同物，如本领域技术人员所理解的。除非另外指出，否则权利要求不应当理解为限定于所描述的顺序或元素。应当理解，可进行形式和内容上的各种变化而不背离所附权利要求的范围。因此，要求保护落在下列权利要求的范围和精神内的所有实施方案和其等同物。序列表<110>esbatechag<120>抑制tnfα的稳定和可溶的抗体<130>p103779pc00<160>121<170>patentinversion3.5<210>1<211>230<212>prt<213>智人<220><221>cdr<222>(24)..(73)<223>cdr1;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>cdr<222>(89)..(138)<223>cdr2;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>cdr<222>(170)..(219)<223>cdr3;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<400>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<210>2<211>232<212>prt<213>智人<220><221>cdp<222>(26)..(75)<223>cdr1;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>cdp<222>(90)..(139)<223>cdr2;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>cdp<222>(172)..(221)<223>cdr3;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<400>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<210>3<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>ep43cdr-h1<400>3glypheserleuserserglyalametser1510<210>4<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>ep43cdr-h2<400>4valileileserserglyalathrtyrtyralasertrpalalysgly151015<210>5<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>ep-43cdr-h3<400>5glyglyproaspaspserasnsermetglythrpheasppro1510<210>6<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>ep43cdr-l1<400>6glnalaserglnserileserasptrpleuala1510<210>7<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>ep43cdr-l2<400>7glyalaserargleualaser15<210>8<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>ep43cdr-l3<400>8glnglnglytrpseraspsertyrvalaspasnleu1510<210>9<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>ep1cdr-h1<400>9glyileaspleuserasnaspalaileser1510<210>10<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>ep1cdr-h2<400>10tyrileserasptrpserileargtyrtyralaasntrpalaglngly151015<210>11<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>ep1cdr-h3<400>11glyalaproglyalaglyaspasnglyile1510<210>12<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>ep1cdr-l1<400>12glnserthrgluservaltyrlysasnasntyrleuala1510<210>13<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>ep1cdr-l2<400>13aspalaserthrleualaser15<210>14<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>ep1cdr-l3<400>14alaglytyrtyrargserglyserglythralaasnglyser1510<210>15<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>ep6cdr-h1<400>15glypheserleuserargtyrglyvalser1510<210>16<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>ep6cdr-h2<400>16thrileglyglualaglyargalatyrtyralaasntrpalaargser151015<210>17<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>ep6cdr-h3<400>17glygluvalpheasnasnglytrpglyalapheasnile1510<210>18<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>ep6cdr-l1<400>18glnalasergluseriletyrserglyleuala1510<210>19<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>ep6cdr-l2<400>19glnalaserthrleualaser15<210>20<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>ep6cdr-l3<400>20glnglnglypheglythrserasnvalgluasnpro1510<210>21<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>ep15cdr-h1<40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221>cdr<222>(90)..(139)<223>cdr2;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>cdr<222>(172)..(221)<223>cdr3;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<400>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<210>90<211>232<212>prt<213>人工序列<220><223>rfw1.4(v2)的可变重链构架<220><221>cdr<222>(26)..(75)<223>cdr1;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>cdr<222>(90)..(139)<223>cdr2;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>cdr<222>(172)..(221)<223>cdr3;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<400>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<210>91<211>231<212>prt<213>人工序列<220><223>fw1.4的经置换的可变轻链构架<220><221>cdr<222>(24)..(73)<223>cdr1;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>cdr<222>(89)..(138)<223>cdr2;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>cdr<222>(170)..(219)<223>cdr3;至少3个和直至50个氨基酸可以存在或不存在；xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(220)..(220)<223>xaa可以是任何天然发生的氨基酸<400>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<210>92<211>483<212>prt<213>人工序列<220><223>rfw1.4<220><221>misc_feature<222>(24)..(73)<223>xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(89)..(138)<223>xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(171)..(220)<223>xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(277)..(326)<223>xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(341)..(390)<223>xaa可以是任何天然发生的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(423)..(472)<223>xaa可以是任何天然发生的氨基酸<400>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