本发明涉及一种提取方法，适用于免疫调节肽的生产，尤其适用于利用芽孢杆菌生产免疫调节肽。具体的说，涉及一种芽孢杆菌生产免疫调节肽的生产和提取方法，属于生物技术领域。
背景技术：
许多功能性肽对免疫具有调节作用。免疫调节肽是一类具有免疫调节活性的分子量相对较小的小(寡)肽，这类物质可从多个层面上广泛地调节机体的免疫功能，对提高机体的免疫力、增强机体的免疫功能以及保持机体健康具有重要意义。
免疫调节肽，是先天免疫反应进化过程中相对保守的成分。在所有生物类别都有相类似的生物肽。免疫调节肽除了可以直接杀死细菌，也有一些免疫调节功能，可参与清除感染，包括能够改变宿主基因的表达，作为类趋化因子或诱导趋化因子的产生，抑制内毒素诱导的炎性细胞因子产生，促进伤口愈合,调制树突状细胞的反应和调节免疫细胞的适应性免疫反应。
在禽畜饲料中添加免疫调节肽，有助于提高禽畜机体免疫力，从而提高其抗病能力，是一种预防禽畜疾病的有效思路。因此，通过多种途径从生物体和微生物发酵液中获取具有免疫调节活性的小(寡)肽以增强机体免疫能力是过去20年研究营养与免疫关系的重要内容之一，也是寻求营养措施以增强禽畜免疫功能、提高禽畜出栏率的一种新策略。研究发现，免疫调节肽可以从多个层面广泛地调节机体的免疫功能，对提高机体免疫力、增强机体免疫功能以及确保禽畜健康具有重要的意义。此外由于肽类具有多种生物学活性，是一种安全无公害的营养添加剂，近年来已有诸多作为饲料添加剂的报道。
技术实现要素：
本发明利用芽孢杆菌生产免疫调节肽zy肽产品(zy胎是本发明人对于本发明提取出来的肽的定义)，选用优化发酵配方和方法，提供了一种高含量zy肽的发酵生产和后期处理方法。所解决的技术问题是针对现有技术的不足，以芽孢杆菌为生产菌株，通过对发酵液的后期处理将其加工成zy肽成品，具有操作方法简单、生产成本低、产品效价高等优点。
制备该免疫调节肽方法按以下步骤实现：
本发明的一种芽孢杆菌生产免疫调节肽的生产和提取工艺，其特征在于：所述的生产和提取工艺包括依次进行：1)配料、2)发酵、3)放罐、4)离心、5)预处理、6)膜分离、7)喷雾干燥，得到成品。
上述步骤1)配料的方法如下：所述的培养基成分为在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10-15g，酵母提取物5-8g，nacl10-12g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l，在0.1mpa、121℃蒸汽灭菌20min。冷却至室温备用。
上述步骤2)发酵的方法如下：将过夜培养的芽孢杆菌，以10％的接种量将种子液接入装有3l上述培养基的5l发酵罐中，在37℃条件下连续培养3-5天。
上述步骤3)放罐步骤如下：本步骤利用罐压(0.05mpa)将发酵液从出料管道排出至收集容器中。
上述步骤4)离心。发酵液通过连续离心机离心，弃去沉淀，留上清液备用，离心操作的条件为3000rpm离心力。
上述步骤5)预处理，方法如下：每升发酵液中加入50g的硫酸铵固体，充分搅拌溶解后在3000rpm条件下离心15min，收集沉淀样品溶解在200ml去离子水中，煮沸15min后置于冰上彻底冷却，随后再添加200ml有机溶剂，在室温下孵育20min，将样品在3000rpm条件下离心15min，样品将分为水相和有机相两相，取有机相样品在真空干燥器中干燥，即获得初步提纯的zy肽。
上述的预处理步骤5)中所用有机溶剂可以是甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等低级醇，可以是乙酸乙酯、乙酸丁酯等低级酯，也可以是丙酮、丁酮等低级酮，还可以是氯仿，或是它们的混合物，优选氯仿。
上述步骤6)膜分离的方法如下：将上述获得的zy肽粗品，溶解在10mmpbs缓冲液中通过5-50万分子量的陶瓷膜进行分级过滤，以除去杂蛋白，并充分保持抗菌肽活性，首先选用50万分子量陶瓷膜进行一级过滤，收集小于50万分子量的清液再依次采用35万、15万和5万分子量陶瓷膜分别进行二级、三级和四级过滤，过滤温度40-60摄氏度，优选45℃，操作进口压力为0.2mpa，出口压力0.1mpa，将清液以0.5m3/h的流速沿陶瓷膜流过，小分子物质透过陶瓷膜形成过滤清液，大分子组分被截留在陶瓷膜内，实现多肽样品的分离。
上述步骤7)喷雾干燥，收集膜分离后的清液，在其中添加盐酸调节ph至3.0，静置24h后下层出现沉淀，取沉淀浓缩液(为初始体积的50％)加入25％的麦芽糊精作为赋形剂，混匀按照50l/h的处喷雾干燥进风温度为160℃，出风温度为80℃。
上述步骤7)喷雾干燥的ph调节酸可以为盐酸、磷酸、柠檬酸或醋酸。
附图说明
附图1zy肽分离提取方法流程图
附图2zy肽促进人t细胞增值图
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明所述的技术手段均为本领域技术人员所知的方法。此外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围。本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。
实施例1
本发明的一种芽孢杆菌生产免疫调节肽的生产和提取工艺，其特征在于：所述的生产和提取工艺包括依次进行：1)配料、2)发酵、3)放罐、4)离心、5)预处理、6)膜分离、7)喷雾干燥，得到成品。
上述步骤1)配料的方法如下：所述的培养基成分为在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l，在0.1mpa、121℃蒸汽灭菌20min。冷却至室温备用。
上述步骤2)发酵的方法如下：将过夜培养的芽孢杆菌，以10％的接种量将种子液接入装有3l上述培养基的5l发酵罐中，在37℃条件下连续培养3天。
上述步骤3)放罐步骤如下：本步骤利用罐压(0.05mpa)将发酵液从出料管道排出至收集容器中。
上述步骤4)离心。发酵液通过连续离心机离心，弃去沉淀，留上清液备用，离心操作的条件为3000rpm。
上述步骤5)预处理，方法如下：每升发酵液中加入50g/l的硫酸铵固体，充分搅拌溶解后在3000rpm条件下离心15min，收集沉淀样品溶解在200ml去离子水中，煮沸15min后置于冰上彻底冷却，随后再添加200ml有机溶剂，在室温下孵育20min，将样品在3000rpm条件下离心15min，样品将分为水相和有机相两相，取有机相样品在真空干燥器中干燥，即获得初步提纯的zy肽。
上述的预处理步骤5)中所用有机溶剂是氯仿。
上述步骤6)膜分离的方法如下：将上述获得的zy肽粗品，溶解在10mmpbs缓冲液中通过5-50万分子量的陶瓷膜进行分级过滤，以除去杂蛋白，并充分保持抗菌肽活性，首先选用50万分子量陶瓷膜进行一级过滤，收集小于50万分子量的清液再依次采用35万、15万和5万分子量陶瓷膜分别进行二级、三级和四级过滤，过滤温度40℃，操作进口压力为0.2mpa，出口压力0.1mpa，将清液以0.5m3/h的流速沿陶瓷膜流过，小分子物质透过陶瓷膜形成过滤清液，大分子组分被截留在陶瓷膜内，实现多肽样品的分离。
上述步骤7)喷雾干燥，收集膜分离后的清液，在其中添加盐酸调节ph至3.0，静置24h后下层出现沉淀，取沉淀浓缩液(为初始体积的50％)加入25％的麦芽糊精作为赋形剂，混匀按照50l/h的处喷雾干燥进风温度为160℃，出风温度为80℃。
上述步骤7)喷雾干燥的ph调节酸为柠檬酸。
实施例2
本发明的一种芽孢杆菌生产免疫调节肽的生产和提取工艺，其特征在于：所述的生产和提取工艺包括依次进行：1)配料、2)发酵、3)放罐、4)离心、5)预处理、6)膜分离、7)喷雾干燥，得到成品。
上述步骤1)配料的方法如下：所述的培养基成分为在950ml去离子水中加入胰蛋白胨15g，酵母提取物8g，nacl12g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l，在0.1mpa、121℃蒸汽灭菌20min。冷却至室温备用。
上述步骤2)发酵的方法如下：将过夜培养的芽孢杆菌，以10％的接种量将种子液接入装有3l上述培养基的5l发酵罐中，在37℃条件下连续培养5天。
上述步骤3)放罐步骤如下：本步骤利用罐压(0.05mpa)将发酵液从出料管道排出至收集容器中。
上述步骤4)离心。发酵液通过连续离心机离心，弃去沉淀，留上清液备用，离心操作的条件为3000rpm。
上述步骤5)预处理，方法如下：每升发酵液中加入80g/l的硫酸铵固体，充分搅拌溶解后在3000rpm条件下离心15min，收集沉淀样品溶解在200ml去离子水中，煮沸15min后置于冰上彻底冷却，随后再添加200ml有机溶剂，在室温下孵育20min，将样品在3000rpm条件下离心15min，样品将分为水相和有机相两相，取有机相样品在真空干燥器中干燥，即获得初步提纯的zy肽。
上述的预处理步骤5)中所用有机溶剂是异丙醇。
上述步骤6)膜分离的方法如下：将上述获得的zy肽粗品，溶解在10mmpbs缓冲液中通过5-50万分子量的陶瓷膜进行分级过滤，以除去杂蛋白，并充分保持抗菌肽活性，首先选用50万分子量陶瓷膜进行一级过滤，收集小于50万分子量的清液再依次采用35万、15万和5万分子量陶瓷膜分别进行二级、三级和四级过滤，过滤温度45℃，操作进口压力为0.2mpa，出口压力0.1mpa，将清液以0.5m3/h的流速沿陶瓷膜流过，小分子物质透过陶瓷膜形成过滤清液，大分子组分被截留在陶瓷膜内，实现多肽样品的分离。
上述步骤7)喷雾干燥，收集膜分离后的清液，在其中添加盐酸调节ph至3.0，静置24h后下层出现沉淀，取沉淀浓缩液(为初始体积的50％)加入25％的麦芽糊精作为赋形剂，混匀按照50l/h的处喷雾干燥进风温度为160℃，出风温度为80℃。
上述步骤7)喷雾干燥的ph调节酸为磷酸。
实施例3
本发明的一种芽孢杆菌生产免疫调节肽的生产和提取工艺，其特征在于：所述的生产和提取工艺包括依次进行：1)配料、2)发酵、3)放罐、4)离心、5)预处理、6)膜分离、7)喷雾干燥，得到成品。
上述步骤1)配料的方法如下：所述的培养基成分为在950ml去离子水中加入胰蛋白胨12g，酵母提取物6g，nacl11g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l，在0.1mpa、121℃蒸汽灭菌20min。冷却至室温备用。
上述步骤2)发酵的方法如下：将过夜培养的芽孢杆菌，以10％的接种量将种子液接入装有3l上述培养基的5l发酵罐中，在37℃条件下连续培养4天。
上述步骤3)放罐步骤如下：本步骤利用罐压(0.05mpa)将发酵液从出料管道排出至收集容器中。
上述步骤4)离心。发酵液通过连续离心机离心，弃去沉淀，留上清液备用，离心操作的条件为3000rpm。
上述步骤5)预处理，方法如下：每升发酵液中加入80g/l的硫酸铵固体，充分搅拌溶解后在3000rpm条件下离心15min，收集沉淀样品溶解在200ml去离子水中，煮沸15min后置于冰上彻底冷却，随后再添加200ml有机溶剂，在室温下孵育20min，将样品在3000rpm条件下离心15min，样品将分为水相和有机相两相，取有机相样品在真空干燥器中干燥，即获得初步提纯的zy肽。
上述的预处理步骤5)中所用有机溶剂是甲醇。
上述步骤6)膜分离的方法如下：将上述获得的zy肽粗品，溶解在10mmpbs缓冲液中通过5-50万分子量的陶瓷膜进行分级过滤，以除去杂蛋白，并充分保持抗菌肽活性，首先选用50万分子量陶瓷膜进行一级过滤，收集小于50万分子量的清液再依次采用35万、15万和5万分子量陶瓷膜分别进行二级、三级和四级过滤，过滤温度60℃，操作进口压力为0.2mpa，出口压力0.1mpa，将清液以0.5m3/h的流速沿陶瓷膜流过，小分子物质透过陶瓷膜形成过滤清液，大分子组分被截留在陶瓷膜内，实现多肽样品的分离。
上述步骤7)喷雾干燥，收集膜分离后的清液，在其中添加盐酸调节ph至3.0，静置24h后下层出现沉淀，取沉淀浓缩液(为初始体积的50％)加入25％的麦芽糊精作为赋形剂，混匀按照50l/h的处喷雾干燥进风温度为160℃，出风温度为80℃。
上述步骤7)喷雾干燥的ph调节酸为盐酸。
实施例4
本发明的一种芽孢杆菌生产免疫调节肽的生产和提取工艺，其特征在于：所述的生产和提取工艺包括依次进行：1)配料、2)发酵、3)放罐、4)离心、5)预处理、6)膜分离、7)喷雾干燥，得到成品。
上述步骤1)配料的方法如下：所述的培养基成分为在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g，酵母提取物8g，nacl10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l，在0.1mpa、121℃蒸汽灭菌20min。冷却至室温备用。
上述步骤2)发酵的方法如下：将过夜培养的芽孢杆菌，以10％的接种量将种子液接入装有3l上述培养基的5l发酵罐中，在37℃条件下连续培养5天。
上述步骤3)放罐步骤如下：本步骤利用罐压(0.05mpa)将发酵液从出料管道排出至收集容器中。
上述步骤4)离心。发酵液通过连续离心机离心，弃去沉淀，留上清液备用，离心操作的条件为3000rpm。
上述步骤5)预处理，方法如下：每升发酵液中加入60g/l的硫酸铵固体，充分搅拌溶解后在3000rpm条件下离心15min，收集沉淀样品溶解在200ml去离子水中，煮沸15min后置于冰上彻底冷却，随后再添加200ml有机溶剂，在室温下孵育20min，将样品在3000rpm条件下离心15min，样品将分为水相和有机相两相，取有机相样品在真空干燥器中干燥，即获得初步提纯的zy肽。
上述的预处理步骤5)中所用有机溶剂是乙酸乙酯。
上述步骤6)膜分离的方法如下：将上述获得的zy肽粗品，溶解在10mmpbs缓冲液中通过5-50万分子量的陶瓷膜进行分级过滤，以除去杂蛋白，并充分保持抗菌肽活性，首先选用50万分子量陶瓷膜进行一级过滤，收集小于50万分子量的清液再依次采用35万、15万和5万分子量陶瓷膜分别进行二级、三级和四级过滤，过滤温度55℃，操作进口压力为0.2mpa，出口压力0.1mpa，将清液以0.5m3/h的流速沿陶瓷膜流过，小分子物质透过陶瓷膜形成过滤清液，大分子组分被截留在陶瓷膜内，实现多肽样品的分离。
上述步骤7)喷雾干燥，收集膜分离后的清液，在其中添加盐酸调节ph至3.0，静置24h后下层出现沉淀，取沉淀浓缩液(为初始体积的50％)加入25％的麦芽糊精作为赋形剂，混匀按照50l/h的处喷雾干燥进风温度为160℃，出风温度为80℃。
上述步骤7)喷雾干燥的ph调节酸为醋酸。
实施例5
本发明的一种芽孢杆菌生产免疫调节肽的生产和提取工艺，其特征在于：所述的生产和提取工艺包括依次进行：1)配料、2)发酵、3)放罐、4)离心、5)预处理、6)膜分离、7)喷雾干燥，得到成品。
上述步骤1)配料的方法如下：所述的培养基成分为在950ml去离子水中加入胰蛋白胨15g，酵母提取物8g，nacl10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l，在0.1mpa、121℃蒸汽灭菌20min。冷却至室温备用。
上述步骤2)发酵的方法如下：将过夜培养的芽孢杆菌，以10％的接种量将种子液接入装有3l上述培养基的5l发酵罐中，在37℃条件下连续培养4天。
上述步骤3)放罐步骤如下：本步骤利用罐压(0.05mpa)将发酵液从出料管道排出至收集容器中。
上述步骤4)离心。发酵液通过连续离心机离心，弃去沉淀，留上清液备用，离心操作的条件为3000rpm。
上述步骤5)预处理，方法如下：每升发酵液中加入65g/l的硫酸铵固体，充分搅拌溶解后在3000rpm条件下离心15min，收集沉淀样品溶解在200ml去离子水中，煮沸15min后置于冰上彻底冷却，随后再添加200ml有机溶剂，在室温下孵育20min，将样品在3000rpm条件下离心15min，样品将分为水相和有机相两相，取有机相样品在真空干燥器中干燥，即获得初步提纯的zy肽。
上述的预处理步骤5)中所用有机溶剂是丙酮。
上述步骤6)膜分离的方法如下：将上述获得的zy肽粗品，溶解在10mmpbs缓冲液中通过5-50万分子量的陶瓷膜进行分级过滤，以除去杂蛋白，并充分保持抗菌肽活性，首先选用50万分子量陶瓷膜进行一级过滤，收集小于50万分子量的清液再依次采用35万、15万和5万分子量陶瓷膜分别进行二级、三级和四级过滤，过滤温度45℃，操作进口压力为0.2mpa，出口压力0.1mpa，将清液以0.5m3/h的流速沿陶瓷膜流过，小分子物质透过陶瓷膜形成过滤清液，大分子组分被截留在陶瓷膜内，实现多肽样品的分离。
上述步骤7)喷雾干燥，收集膜分离后的清液，在其中添加盐酸调节ph至3.0，静置24h后下层出现沉淀，取沉淀浓缩液(为初始体积的50％)加入25％的麦芽糊精作为赋形剂，混匀按照50l/h的处喷雾干燥进风温度为160℃，出风温度为80℃。
上述步骤7)喷雾干燥的ph调节酸为柠檬酸。
表1膜分离控制参数对杂蛋白去除效果及免疫调节肽(抑菌肽)效价的影响
评估提纯得到的zy肽的生物活性
采用
结果如图2所示。与空白对照pbs相比，zy肽处理的t细胞淋巴细胞增值能力显著增强。