本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种检测的试剂盒，尤其是一种自闭症检测的试剂盒。
背景技术：
：自闭症谱系障碍(asd，简称自闭症)是一组发育障碍，包括完全的孤独症，阿斯伯格综合症，和其他广泛性发育障碍。如今自闭症的检出率超过1％，患病率在不断增加，而且自闭症患者中男性占了8成。自闭症孩子不肯改变其原来形成的习惯和行为方式，难以适应新环境，多数患儿同时还表现无目的活动，活动过度，单调重复地蹦跳、拍手、挥手、奔跑旋转，也有的甚至出现自伤自残，如反复挖鼻孔、抠嘴、咬唇、吸吮等动作。自闭症患儿的语言与正常人的语言在逻辑、内容、形式上互不相容，他们的内在世界精彩纷呈，但与正常人的内心世界互不相通，他们的思维活动是“关起门来唱大戏”，表面平静，内部活动很激烈。这种语言的不相容性导致孤独症患儿行为古怪、不可理解。自闭症儿童由于缺乏想象力和预测行为结果的能力，他们无法进行建设性游戏。但他们知道纸可以撕、硬的东西扔到地上可以发出声音的道理，为了寻找这种撕纸或扔东西的快乐，常常出现诸如此类的破坏行为。自闭症患儿往往没有恐惧感，不能预料他们行为所产生的后果。突然穿越马路；打开煤气开关只是为了听到叭、叭、叭的响声；摆弄自己感兴趣的电源、开关；把身体探出窗外；在高处攀爬行走。自闭症在初期可能出现的危害并不严重，许多家长认为孩子只是胆小内向，只要长大点就好了，殊不知，自闭症如果不治疗，后期症状会一直延续，而且愈演愈烈。自闭症如果不接受专业治疗，患儿终生都要大人照料。目前自闭症基于智力测验和行为、实验室诊断、脑电图检查等检测结果并在语言病理学家、心理学家和儿科医生的共识基础上进行确诊。自闭症目前常规确认手段只能在患者出现自闭症症状之后进行诊断，延误了治疗的时机。技术实现要素：本发明通过大理石掩埋测试、社交能力的评估实验、高架十字迷宫实验空场实验等行为学研究以及实时定量pcr和westernblot检测、甲基化特异性pcr分析和染色质免疫沉淀(chip)检测、过表达erβ基因和下调erβ基因表达后的自闭症行为学研究发现骨髓和外周血cd34阳性细胞erβ、sod2和errα基因表达与产生自闭症样行为密切相关，表明骨髓和外周血cd34阳性细胞erβ基因及其相关基因是asd患者的诊断的良好生物标志物。因此，本发明提供了cd34阳性细胞中erβ基因及相关基因在制备自闭症标志物中的应用。其中，所述erβ相关基因为erα、sod2、errα、oxt、oxtr、gper、pgr或ar基因。本发明还提供了一种自闭症检测试剂盒，包括erβ、erα、sod2、errα、oxt、oxtr、gper、pgr或ar基因中至少一种的引物。在一些实施方案中，所述erβ基因的引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。在一些实施方案中，所述erα基因的引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示。在一些实施方案中，所述sod2基因的引物序列如seqidno.5和seqidno.6所示。在一些实施方案中，所述errα基因的引物序列如seqidno.7和seqidno.8所示。在一些实施方案中，所述oxt基因的引物序列如seqidno.9和seqidno.10所示。在一些实施方案中，所述oxtr基因的引物序列如seqidno.11和seqidno.12所示。在一些实施方案中，所述gper基因的引物序列如seqidno.13和seqidno.14所示。在一些实施方案中，所述pgr基因的引物序列如seqidno.15和seqidno.16所示。在一些实施方案中，所述ar基因的引物序列如seqidno.17和seqidno.18所示。进一步的，本发明所述的试剂盒还包括rt反应液、taqdna聚合酶、dntp、荧光探针、荧光染料、cd34阳性细胞分离液中至少一种。其中，在一些实施方案中，rt反应液组成为bufferrt、dntpmix、rnase-freewater；所述cd34阳性细胞分离液组成为ficoll、cd34microbeads、fcrblockingreagent。在一些实施方案中，所述荧光探针为taqman探针，荧光染料为sybrgreeni。在一些实施方案中，本发明所述的试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。阴性质控品和阳性质控品可用作检测结果直接判定样本中erβ相关基因表达水平是否与自闭症显著性相关。由上述技术方案可知，本发明提供了一种自闭症检测试剂盒。本发明发现骨髓和外周血cd34阳性细胞erβ及其相关基因的表达与产生自闭症样行为密切相关，可以作为自闭症的标志物，用于自闭症的检测以及预筛。本发明所述自闭症检测试剂盒可以快速、灵敏、特异的用于临床对自闭症的检测以及预筛根据检测结果可以对自闭症患儿采取有效的预防和干预治疗措施。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示产前妊娠大鼠经复方口服避孕药(coc)暴露后导致子代大脑中的erβ基因表达下调；(a-c)rt-pcr检测雄性和雌性子代中的erβ(a)、sod2(b)和errα(c)基因的mrna表达水平，n＝5；(d、e)westernblot定量检测雄性后代中的三个基因的蛋白质表达水平，n＝5；(f、g)westernblot定量检测雌性后代中的三个基因的蛋白质表达水平，n＝5；(h)雄性和雌性后代中的杏仁核的sod2酶活性水平，n＝5；*代表p＜0.05；图2示产前左炔诺孕酮暴露通过增加杏仁核中erβ基因的启动子甲基化水平从而抑制erβ基因的表达；(a、b)甲基化特异性pcr分析法检测雄性和雌性子代的杏仁核神经细胞中erβ基因启动子甲基化水平，n＝5；(c、d)chip技术测量雄性和雌性子代的erβ启动子的表观遗传学改变，n＝5；*代表p＜0.05；图3示产前孕酮暴露可诱导子代在出生后10周出现自闭症样行为，并且雄性子代的效果比雌性子代明显；(a)大理石掩埋测试，n＝8；(b)社交时间，n＝8；(c)在高架十字迷宫实验中开臂中的活动时间，n＝8；(d)在高架十字迷宫实验中闭臂中的活动时间，n＝8；(e)在空场实验中中央区域的活动时间，n＝9；(f)在空场实验中外周区域的活动时间，n＝9；(g)在空场实验中的自发活动次数，n＝9；*代表p＜0.05；图4示过表达杏仁核中的erβ基因可使因产前孕酮暴露诱导10周龄子代出现自闭症样行为得到恢复，而敲除erβ基因则可同样导致自闭症样行为出现；(a)大理石掩埋测试，n＝8；(b)社交时间，n＝8；(c)在高架十字迷宫实验中开臂中的活动时间，n＝8；(d)在高架十字迷宫实验中闭臂中的活动时间，n＝8；(e)在空场实验中中央区域的活动时间，n＝9；(f)在空场实验中外周区域的活动时间，n＝9；(g)在空场实验中的自发活动次数，n＝9；*代表p＜0.05；图5示产前孕酮暴露可抑制10周龄雄性子代cd34阳性细胞中的erβ及其靶基因表达，而在雌性子代中效果较低；(a-c)来源于骨髓的cd34阳性细胞中erβ(a)、sod2(b)和errα(c)的表达水平；(d-f)来源于骨髓的cd34阳性细胞中erβ(d)、sod2(e)和errα(f)的表达水平；n＝5，*代表p＜0.05；图6示两组研究对象外周血cd34阳性细胞中erβ(a)、erα(b)、sod2(c)、errα(d)、oxt(e)、oxtr(f)、gper(g)、pgr(h)和ar(i)的相对表达量分布图；n＝20，****代表p＜0.0001。具体实施方式本发明公开了一种自闭症检测试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实施例1：自闭症的发病与产前口服避孕药(coc)暴露后导致子代大脑中的erβ基因表达下调有关将3月龄的怀孕sd大鼠，分为4组：空白对照组(veh)、左炔诺孕酮组(lng)、乙炔雌二醇组(ee)和左炔诺孕酮/乙炔雌二醇组(lng/ee)，连续21天分别给予皮下注射0.1ml生理盐水、20μg左炔诺孕酮、10μg乙炔雌二醇和20μg左炔诺孕酮加10μg乙炔雌二醇。待子代出生后第10周，每组随机挑取若干只雄性子代和雌性子代进行以下实验：1、自闭症行为学研究：使用以下广泛认可的标准方法来评估子代鼠的自闭症行为，分析产前妊娠大鼠经复方口服避孕药(coc)暴露后是否导致子代出现自闭症行为。(1)大理石掩埋测试将大鼠单独放入35cm×23cm×19cm(长×宽×高)的盒子中，盒中放5cm深的玉米芯垫料，在笼子内放20颗直径1cm的大理石珠子，放5排，每排4颗。将大鼠放入笼中，在红色灯光和白色噪声下测试30min，统计埋起来的珠子颗数。珠子埋入垫料一半及以上则记入埋珠数。(2)社交能力的评估实验每只子代鼠被放置在中央区，左边包含一个装有陌生鼠1号的铁丝笼，右边为空室。计算测试子代鼠在左右两侧所呆的时间差异。如果测试子代鼠表现出显著低于正常水平的社交能力(在陌生鼠1号左侧室比空室花更少的时间)将被认定为自闭症样行为。(3)高架十字迷宫实验(epm)epm是由开臂(openarms)和闭臂(closedarms)各两条组成，呈十字形交叉，交叉部分为中央区，距地面有一定高度。其原理是：由于面对新事物(开臂)子代鼠会产生好奇心去探究，而它们有嗜暗的天性(闭臂)，两者之间产生探究与回避的冲突行为，产生焦虑心理。整个迷宫距离地面的高度相当于人类站在悬崖边，易导致动物产生恐惧不安的心理。可以通过比较子代鼠在开臂和闭臂的滞留时间和路程来评价子代鼠的焦虑行为。(4)空场实验(openfieldtest)用空场实验观察子代鼠进入新环境的自发活动特点，利用空场计算机图像实时检测分析系统进行测试。该空场测试箱为40cm直径圆桶(桶内中央直径为20cm的区域划分为中央区)，将实验时间设置为30min，记录分别在中央区域和外周区域的活动时间和自发活动次数。2、实时定量pcr和westernblot检测:将这些子代动物进行处死，分离大脑不同部位的组织，提取杏仁核中的神经细胞的mrna，采用实时定量pcr和western印迹法进行erβ及其靶基因sod2和errα的基因表达检测，分析产前妊娠大鼠经复方口服避孕药(coc)暴露后是否导致子代大脑中的erβ基因表达下调；3、甲基化特异性pcr分析和染色质免疫沉淀(chip)检测：检测erβ启动子的甲基化水平，分析产前妊娠大鼠经复方口服避孕药(coc)暴露后是否导致子代大脑中的erβ基因启动子甲基化从而导致表达下调；4、过表达erβ基因和下调erβ基因表达后再进行自闭症行为学研究：选取来自空白对照组的8周龄的子代，分别定位移植空白的慢病毒载体和敲除erβ基因的慢病毒载体，另外选取来自左炔诺孕酮组的雄性后代，定位移植空白的慢病毒载体和过表达erβ基因的慢病毒载体，然后进行自闭症行为学研究，分析子代大脑杏仁核中的erβ基因表达水平与产生自闭症样行为的关系。结果1显示：与空白对照组相比，在左炔诺孕酮组和左炔诺孕酮/乙炔雌二醇组中，雄性和雌性子代的erβ、sod2和errα基因在杏仁核中的表达显著降低(p＜0.05)，并且雄性子代比雌性子代更敏感；单独的左炔诺孕酮暴露导致子代中erβ、sod2和errα基因表达下调最强，左炔诺孕酮和乙炔雌二醇组联合暴露导致erβ、sod2和errα基因表达下调略低，但仍有显著性差异(p＜0.05)，而单独的乙炔雌二醇暴露与空白对照组相比没有显著性差异(p＞0.05)。这表明左炔诺孕酮暴露在抑制子代的erβ及其靶基因表达中发挥主导作用(见图1)。结果2显示：与空白对照组相比，在左炔诺孕酮组和左炔诺孕酮/乙炔雌二醇组中，雄性和雌性子代的杏仁核神经细胞中erβ基因启动子甲基化水平显著增加(p＜0.05)，而乙炔雌二醇组无显著性差异(图2a,2b)；同时，在左炔诺孕酮组和左炔诺孕酮/乙炔雌二醇组中，雄性和雌性子代的杏仁核神经细胞中erβ基因启动子中的组蛋白h3k9二甲基化(h3k9me2)和组蛋白h3k27(h3k27me3)三甲基化水平显著增高(p＜0.05)，而乙炔雌二醇组无显著性差异(图2c,2d)。这表明产前左炔诺孕酮暴露是通过增加杏仁核中erβ基因的启动子甲基化水平从而抑制erβ基因的表达。结果3显示：与空白对照组对比，在左炔诺孕酮组和左炔诺孕酮/乙炔雌二醇组中的雄性子代的掩埋大理石颗数和社交时间均显著减少(图3a，3b)，在epm实验中的开臂活动时间显著减少，在闭臂中的活动时间显著增加(图3c，3d)，以及在空场实验中的中央区域活动时间显著减少、外周区域活动时间显著增加(图3e，3f)，且自发运动次数无显著性差异(图3g)。而雌性子代的效果则不明显。这表明产前孕酮暴露可诱导子代在出生后10周出现自闭症样行为，并且雄性子代的效果比雌性子代明显。结果4显示：与空白对照组(veh/emp)相比，在来自左炔诺孕酮组的雄性后代中过表达erβ基因(lng/↑erβ)，其大理石掩埋颗数、社交时间、epm实验和空场实验结果均无显著性差异；而下调子代大脑中erβ基因表达后(veh/sherβ)，其大理石掩埋颗数、社交时间、epm实验和空场实验结果与空白对照组相比有显著性差异。这表明过表达杏仁核中的erβ基因可使因产前孕酮暴露诱导10周龄子代出现自闭症样行为得到恢复，而敲除erβ基因则可同样导致自闭症样行为出现(见图4)。综上所述，产前口服避孕药(coc)暴露可通过增加子代大脑中的erβ启动子甲基化水平导致erβ基因表达下调，从而导致子代产生自闭症样行为。实施例2：检测从子代骨髓和外周血中分离的cd34阳性细胞中的erβ及其靶基因表达可作为诊断自闭症的生物标志物将3月龄的怀孕sd大鼠，分为4组：空白对照组(veh)、左炔诺孕酮组(lng)、乙炔雌二醇组(ee)和左炔诺孕酮/乙炔雌二醇组(lng/ee)，连续21天分别给予皮下注射0.1ml生理盐水、20μg左炔诺孕酮、10μg乙炔雌二醇和20μg左炔诺孕酮加10μg乙炔雌二醇。待子代出生后第10周，每组随机挑取若干只雄性子代和雌性子代，分别抽取骨髓和外周血进行cd34阳性细胞分离，然后提取mrna，采用实时定量pcr法检测erβ及其靶基因sod2和errα的基因表达水平，分析产前经复方口服避孕药(coc)暴露后，子代骨髓和外周血中分离的cd34阳性细胞中的erβ及其靶基因表达是否下调。结果显示：与对照组相比，在左炔诺孕酮组和左炔诺孕酮/乙炔雌二醇组中，雄性和雌性子代的骨髓和外周血cd34阳性细胞erβ、sod2和errα基因表达显著降低。此外，雄性子代的erβ表达显著低于雌性子代，这可能是男性asd症状普遍高于女性的原因，这进一步说明外周血cd34阳性细胞中erβ表达下调是asd患者的诊断的良好生物标志物(见图5)。实施例3：一种自闭症检测试剂盒包括rt反应液(rna逆转录反应)、taqdna聚合酶、pcr扩增检测试剂、引物组成。其中：rt反应液组成如表1所示。表1rt反应液组成组分用量10×bufferrt30μldntpmix(5mm)20μlrnase-freewater1mlpcr扩增检测试剂包括：dntp、阴性质控品和阳性质控品。引物为erβ、erα、sod2、errα、oxt、oxtr、gper、pgr或ar其中之一的正向引物和反向引物组成。各引物长度约为21bp，序列见表2。其中β-actin或gapdh作为内参。表2引物序列自闭症基因检测试剂盒还包括taqman荧光探针和sybrgreeni荧光染料。自闭症基因检测试剂盒还包括cd34阳性细胞分离液，其中：cd34阳性细胞分离液组成如表3所示。表3cd34阳性细胞分离液组成组分用量ficoll250mlcd34microbeads2mlfcrblockingreagent2ml实施例420例自闭症患者和20例非自闭症患者进行erβ相关基因表达分析检测1、收集临床诊断为自闭症的患者，诊断标准依据为美国精神障碍诊断统计手册第五版(dsm-v)和icd10中儿童期自闭症的诊断标准，抽取6～20ml的外周血利用edta、肝素、柠檬酸钠或枸橼酸葡萄糖等作为抗凝剂保存；同时选取年纪和性别相仿的非自闭症患者作为对照组，处理方法一致；2、收集后的血液样本立即保存至4℃的冰箱或冰盒中，当天尽快从收集的血液样本中分离提取cd34阳性细胞；3、利用流式细胞仪对分离出来的cd34阳性细胞进行细胞计数及纯度检测；4、从分离的cd34阳性细胞中提取mrna,利用分光光度仪检测mrna的纯度和量；5、反转录合成cdna，采用实施例3所述试剂盒进行rt-pcr检测；6、利用管家基因β-actin或gapdh作为内参，将erβ及相关基因的ct值减去内参ct值得到δct值，再将所得到的δct值减去对照组的δct值得到δδct值，最终通过2-δδct法计算出每个目的基因的相对表达量。采用spss22.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差表示，采用t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。7、本实施例通过对20名健康对照组和20名自闭症患者运用qrt-pcr法检测外周血cd34阳性细胞的erβ、erα、sod2、errα、oxt、oxtr、gper、pgr和ar基因表达水平，计算各样本的相对表达量(2-δδct)并进行t检验，结果显示：上述所有基因在自闭症患者(实验组)中的表达水平较的非自闭症患者(对照组)均降低，差异具有统计学意义(结果如图6所示)。序列表<110>广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司<120>一种自闭症检测的试剂盒<130>mp1714330<160>18<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atgatgatgtccctgaccaag21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2acatcagccccatcattaaca21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gggaagctactgtttgctcct21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ttgaggcacacaaactcctct21<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gcctacgtgaacaacctgaac21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tgaggtttgtccagaaaatgc21<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gggcattgagcctctctacat21<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ccatcctcctcttccttgtg20<210>9<211>2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