本发明涉及生物检测领域，具体来说是一种检测乳糖和果糖代谢相关基因的方法。
背景技术：
就全球而言，有半数以上人口存在乳糖酶缺乏的问题,特别是东方人，对牛奶消化吸收不良者所占比例更大,乳糖不耐受可对各年龄人口构成危害，这不仅是一个医学问题，而且也是关系到世界人口营养和健康问题,如何解决这个问题，已越来越多地收国内外众多学者的重视。
人类乳糖酶与其他双糖酶不同，并非诱导酶，不直接受作用底物的调节，不能靠延长哺乳期或连续饮乳使之活性维持下去,乳糖酶是一种小肠内细胞产生的酶,这种酶依附乳糖并将其分裂成半乳糖和葡萄糖分子,葡萄糖被马上吸收,但是如果不能产生足够的乳糖酶，在代谢乳糖时就会出现问题，缺乏乳糖酶会导致乳糖不耐症，表现为腹胀，肠胃气胀和腹泻等症状。
随着对mcm6基因多态性位点的调节乳糖酶基因转录的作用机制的研究不断深入，有学者提出等位基因t和c在基因转录过程中具有不同的调控能力，oldslc等通过体外实验，利用荧光素报告载体将人类c/t-13910位点的基因片段进行克隆，并将重组载体转染人小肠上皮细胞中，发现该多态性位点位于lct基因的增强子区域，并且-13910t位点较-13910c位点可提高乳糖酶基因启动子4倍的活性，利用电泳迁移率检测-13910区段蛋白质和dna的相互作用情况，发现在转录过程中，核因子与-13910t结合较强，而与-13910c结合较弱，此研究结果为mcm6基因rs4988235(c/t-13910)位点多态性与乳糖酶基因缺乏提供了更多基因转录方面的依据，目前在欧洲的一些实验室中，改基因的多态性位点已经作为乳糖耐受的遗传性标记进行常规临床诊断。
遗传性果糖不耐受症是果糖代谢病的一种，为常染色体隐性遗传病，是由于醛缩酶b基因(aldob基因)突变导致b型醛缩酶缺乏或活性降低，从而导致患者出现果糖的代谢异常，欧洲发病率约1:26100，而我国发病率目前尚不清楚，随着人民生活水平的提高，对糖的消费越来越多，果糖不耐受症发病率会逐渐增多。
临床上遗传性果糖不耐受症患儿较少见，由于各种配方奶粉中大多含有蔗糖，所以出生后即人工喂养的新生儿在2-3天内即出现呕吐、腹泻、脱水、休克和出血倾向等急性肝功能衰竭症状，本病的临床诊断需要依靠血液生化检查和果糖耐量试验，但是这两种方法均是损伤性的，而且检测准确度不是很高，需要进行进一步的改进。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的存在损伤性、检测准确度不高的缺陷，而提供一种检测乳糖和果糖代谢相关基因的方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种检测乳糖和果糖代谢相关基因的方法，具体步骤如下：
(1)、用检测者的口腔黏膜细胞提取dna；
(2)、以口腔黏膜细胞提取的dna为模板进行pcr反应，分别用seqno1和seqno2为引物扩增mcm6基因snprs4988235位点，用seqno3和seqno4为引物扩增mcm6基因snprs182549位点，用seqno5和seqno6为引物扩增aldob基因snprs1800588位点，用seqno7和seqno8为引物扩增aldob基因snprs4994位点；
(3)、将上述4对引物进行普通pcr扩增后，将pcr扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳；
(4)、将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用天跟的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；
(5)、进行测序反应；
(6)、将测序反应产物进行纯化：
测序反应产物中加3uledta和18ul无水乙醇，3700r/min，离心30min，然后倒置，800r/min离心10s，然后取出，加50ul80％乙醇，3700r/min，离心15min，然后倒置，800r/min离心10s取出；
(7)、变性，上3730测序仪测序：
在测序反应产物纯化后的样本中加10ulhidi，上pcr仪变性，条件为94℃变性2min，4℃保存3min后上3730测序仪测序；
(8)、根据测序结果分析6个snp基因型。
作为优选，所述的步骤(1)中，采用口腔拭子dna提取试剂盒提取dna。
作为优选，所述的步骤(1)中，提取的dna浓度不低于10ng/ul，260/280＝1.9±2。
作为优选，所述的步骤(2)中，pcr反应体系为25ul，其包括：
模板：2ul、seqno1:1ul、seqno2：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去离子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno3:1ul、seqno4：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去离子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno5:1ul、seqno6：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去离子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno7:1ul、seqno8：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去离子水：16.2ul。
作为优选，所述的步骤(2)中，针对snprs4988235位点、snprs182549位点、snprs1800588位点、snprs4994位点的引物组如下：
针对mcm6基因snprs4988235的引物组：
seqno1：caatgtactagtaggcctctgc
seqno2：ccactgacctatcctcgtgg
针对mcm6基因snprs182549的引物组：
seqno3：tcttgagtagctgggaccaca
seqno4：cctgggaagggtgctgtataa
针对aldob基因snprs1800588的引物组：
seqno5：gacttgcagggcttgatgg
seqno6：gctgacagatgctggcgta
针对aldob基因snprs4994的引物组：
seqno7：gaccaaatctttccctaccaca
seqno8：ttgccgaccagtgtccatc。
作为优选，所述的步骤(2)中，pcr反应条件为：
95℃预变性5min后进入循环反应，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40个循环，之后72℃延伸5min，4℃保存。
作为优选，所述的步骤(5)中，测序反应体系为5ul：引物1ul，胶回收产物为模板和水共3ul，bigdye1ul；
作为优选，所述的步骤(5)中，测序反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。
作为优选，所述的步骤(8)中，用chromas软件分析6个snp基因型。
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：
本发明提供一种检测乳糖和果糖代谢相关基因的方法，包括如下步骤：获取受检者核酸，所述核酸包含dna片段，所述的dna片段使用口腔拭子刮取口腔黏膜细胞，用天跟口空拭子提取试剂盒提取dna；检测乳糖mcm6基因的rs4988235和rs182549的2个snp位点的基因型，果糖aldob基因的rs1800546和rs76917243的2个snp位点的基因型，其中包括4对引物扩增包含所述4个snp位点的dna片段，确定所述snp位点的碱基类型；
对mcm6基因多态性位点的调节乳糖酶基因转录的作用机制的研究不断深入，有学者提出等位基因t和c在基因转录过程中具有不同的调控能力，oldslc等通过体外实验，利用荧光素报告载体将人类c/t-13910位点的基因片段进行克隆，并将重组载体转染人小肠上皮细胞中，发现该多态性位点位于lct基因的增强子区域，并且-13910t位点较-13910c位点可提高乳糖酶基因启动子4倍的活性，利用电泳迁移率检测-13910区段蛋白质和dna的相互作用情况，发现在转录过程中，核因子与-13910t结合较强，而与-13910c结合较弱，此研究结果为mcm6基因rs4988235(c/t-13910)位点多态性与乳糖酶基因缺乏提供了更多基因转录方面的依据，遗传性果糖不耐受症是果糖代谢病的一种，为常染色体隐性遗传病，是由于醛缩酶b基因(aldob基因)突变导致b型醛缩酶缺乏或活性降低，从而导致患者出现果糖的代谢异常；
本发明针对乳糖mcm6基因的rs4988235和rs182549的2个snp位点分别设计一对特异性引物，针对果糖aldob基因的rs1800546和rs76917243的2个snp位点分别设计一对特异性引物，可以在同一个pcr体系扩增和条件下进行实验，该方法是一种成本低，速度快、无损伤性、高准确度的对乳糖和果糖相关基因进行分型的方法。
附图说明
图1为实施例1中以将李某进行乳糖和果糖代谢相关基因检测中4对引物进行普通pcr扩增后pcr扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳后得到的2％的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为mcm6基因snprs4988235位点chromas分析结果图；
图3为mcm6基因snprs182549位点chromas分析结果图；
图4为aldob基因snprs1800588位点chromas分析结果图；
图5为针对aldob基因snprs4994位点chromas分析结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种检测乳糖和果糖代谢相关基因的方法，具体步骤如下：
(1)、用检测者的口腔黏膜细胞提取dna；
(2)、以口腔黏膜细胞提取的dna为模板进行pcr反应，分别用seqno1和seqno2为引物扩增mcm6基因snprs4988235位点，用seqno3和seqno4为引物扩增mcm6基因snprs182549位点，用seqno5和seqno6为引物扩增aldob基因snprs1800588位点，用seqno7和seqno8为引物扩增aldob基因snprs4994位点；
(3)、将上述4对引物进行普通pcr扩增后，将pcr扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳；
(4)、将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用天跟的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；
(5)、进行测序反应；
(6)、将测序反应产物进行纯化：
测序反应产物中加3uledta和18ul无水乙醇，3700r/min，离心30min，然后倒置，800r/min离心10s，然后取出，加50ul80％乙醇，3700r/min，离心15min，然后倒置，800r/min离心10s取出；
(7)、变性，上3730测序仪测序：
在测序反应产物纯化后的样本中加10ulhidi，上pcr仪变性，条件为94℃变性2min，4℃保存3min后上3730测序仪测序；
(8)、根据测序结果分析6个snp基因型。
作为优选，所述的步骤(1)中，采用口腔拭子dna提取试剂盒提取dna。
作为优选，所述的步骤(1)中，提取的dna浓度不低于10ng/ul，260/280＝1.9±2。
作为优选，所述的步骤(2)中，pcr反应体系为25ul，其包括：
模板：2ul、seqno1:1ul、seqno2：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去离子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno3:1ul、seqno4：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去离子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno5:1ul、seqno6：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去离子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno7:1ul、seqno8：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去离子水：16.2ul。
作为优选，所述的步骤(2)中，针对snprs4988235位点、snprs182549位点、snprs1800588位点、snprs4994位点的引物组如下：
针对mcm6基因snprs4988235的引物组：
seqno1：caatgtactagtaggcctctgc
seqno2：ccactgacctatcctcgtgg
针对mcm6基因snprs182549的引物组：
seqno3：tcttgagtagctgggaccaca
seqno4：cctgggaagggtgctgtataa
针对aldob基因snprs1800588的引物组：
seqno5：gacttgcagggcttgatgg
seqno6：gctgacagatgctggcgta
针对aldob基因snprs4994的引物组：
seqno7：gaccaaatctttccctaccaca
seqno8：ttgccgaccagtgtccatc。
作为优选，所述的步骤(2)中，pcr反应条件为：
95℃预变性5min后进入循环反应，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40个循环，之后72℃延伸5min，4℃保存。
作为优选，所述的步骤(5)中，测序反应体系为5ul：引物1ul，胶回收产物为模板和水共3ul，bigdye1ul；
作为优选，所述的步骤(5)中，测序反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。
作为优选，所述的步骤(8)中，用chromas软件分析6个snp基因型。
实施例1
将李某进行乳糖和果糖代谢相关基因检测
(1)、用李某的口腔黏膜细胞用口腔拭子dna提取试剂盒提取dna，测试得dna浓度30ng/ul，260/280＝1.85；
(2)、以口腔黏膜细胞提取dna为模板进行pcr反应：分别用seqno1和seqno2为引物扩增mcm6基因snprs4988235位点，用seqno3和seqno4为引物扩增mcm6基因snprs182549位点，用seqno5和seqno6为引物扩增aldob基因snprs1800588位点，用seqno7和seqno8为引物扩增aldob基因snprs4994位点；
以25ulpcr反应体系为例，其包括：
模板：2ul、seqno1:1ul、seqno2：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去离子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno3:1ul、seqno4：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去离子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno5:1ul、seqno6：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去离子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno7:1ul、seqno8：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去离子水：16.2ul；
pcr反应条件如下：
95℃预变性5min后进入循环反应95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40个循环，之后72℃延伸5min，4℃保存；
(3)、将上述4对引物进行普通pcr扩增后pcr扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，胶图如下图1；
(4)、将1％的琼脂糖凝胶电泳mcm6基因snprs4988235位点目的条带大小为151bp，mcm6基因snprs182549位点目的条带大小为491bp，aldob基因snprs1800588位点目的条带大小为168bp，针对aldob基因snprs4994位点目的条带大小为302bp，用天跟的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收；
(5)、测序反应
测序反应5ul体系：引物1ul，胶回收产物为模板和水共3ul，bigdye1ul；
测序反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存；
(6)、测序反应产物纯化
测序反应产物中加3uledta和18ul无水乙醇，3700r/min，离心30min，然后倒置，800r/min离心10s后，取出加50ul80％乙醇，3700r/min，离心15min，然后倒置，800r/min离心10s取出；
(7)、变性，上3730测序仪测序：
将测序反应产物纯化后的样本中加10ulhidi，上pcr仪变性，条件94℃变性2min，4℃保存3min后上3730测序；
(8)、将测序结果用chromas软件分析4个snp基因型，分析结果见图2-5；
(9)、李某乳糖mcm6基因2个snp位点和果糖aldob基因的2个snp位点分型结果如下表1：
表1
(10)、乳糖和果糖检测结果
乳糖代谢弱：乳糖不耐症风险高，应多次少量使用；果糖代谢正常，正常饮食即可。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。