酶法生产乳果糖的制作方法
【专利说明】
[0001](一)
技术领域
本发明涉及乳果糖，具体涉及酶法生产乳果糖。
[0002](二)
【背景技术】
乳果糖口服溶液英文名称:Lactulose Oral Solut1n汉语拼音:RuguotangKoufurongye,本品主要成份为乳果糖。化学名称:4_0_ β-D-卩比喃半乳糖基-D-果糖。性状为淡棕黄色澄明黏稠液体。有降低血氨及缓泻作用，主要用于治疗氨性肝昏迷、高血氨症及习惯性便秘等病症。
[0003]国内外研宄人员将乳果糖生产的研宄重点集中于不同催化剂的使用和分离方法的开发，CN1093410采用加热溶解乳糖，然后保持沸腾，滴加碱溶液，反应结束后调节pH至4-4.5，脱色，采用阴、阳离子交换树脂脱盐，然后真空浓缩、冷却结晶可制得乳果糖浆。但是，产物得率低、工序复杂，成本高仍是化学法乳果糖制备中有待解决的问题。与之相比，酶法乳果糖制备可以避免产物降解和有色副产物生成等问题，目前国内外的研宄尚处在起步阶段。因此，开发可以进行酶法转化制备乳果糖的乳糖酶及其微生物生产菌种具有一定的经济效益和社会效益。
[0004]2011年08月31，公布的一种节杆菌突变株、利用该突变株生产乳糖酶的方法及用乳糖酶制备乳果糖的方法中，公开了一种节杆菌突变株，该菌株分类命名为Arthrobactersp.jnsb-2，目前该菌株保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，登记入册的编号是CCTCC M 209210，保藏日期是:2009年9月27日。
[0005]该菌株具有下述性质:
1、形态特征:菌株在乳糖酵母膏蛋白胨固体培养基上生长良好，菌落为淡黄色，电子显微镜下显示细胞为杆状，两端钝圆。
[0006]2、生理生化特性:
(I)培养温度:在20-37°C。最适温度为30°C。
[0007](2)明胶液化淀粉水解:阳性。
[0008](3)革蓝氏:阳性。
[0009](4)乳糖发酵:阳性。
[0010](5) H2S 生成:阴性。
[0011]3、16S rDNA序列分析:长度1383bp，序列与GenBank中的节杆菌属16SrDNA 具有较高的同源性，其中与 Arthrobacter sp.CDB 1、Arthrobacter sp.AGL 5、Arthrobactersp.2-12的相似性为99%。上述方案反应条件温和，没有有色副产物生成，操作方便，但是其产物纯度及反应时间仍有待提高。
[0012](三)
【发明内容】
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种酶法生产乳果糖，操作方便，过程易于控制，反应时间短，产物纯度高，有利于工业化生产。
[0013]本发明是通过如下技术方案实现的:
一种酶法生产乳果糖，其特殊之处在于:包括以下步骤: (1)节菌突变株生产乳糖酶:将节杆菌突变株经固体斜面活化、种子培养后再进行发酵培养，其中，
发酵培养的培养基:碳源可选用葡萄糖、乳糖或甘油中的任一种，其质量体积比浓度为1% -2% ;氮源可选用酵母膏、蛋白胨或玉米浆中的一种或多种，其质量体积比浓度为0.5-12% ;无机盐可选用氯化钙、Zn2+、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或氯化铁中的一种或多种，其浓度为12-28mmol/L，其浓度为；发酵培养的条件为:25_30°C培养；将生成的发酵液经5000-6000rpm离心得到菌体，随后经破碎细胞、10000-12000rpm离心取上清液即为酶液；
(2)底物溶液的配制:用pH5.5-8.0的磷酸缓冲液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖浓度为300g/L，果糖浓度为250g/L ；
(3)水解和转苷反应
向底物溶液中加入600U/L乳糖酶，Zn2+ 1mmoI/L，氯化铁4-6 mmol/L在20_25°C反应0.5-1.5h，进行水解和转苷反应，得到酶解液；
(4)酶解液的后处理
向酶解液中加入无水乙醇，使其终浓度为65-70%，经离心后取上清液经60-65°C加热浓缩后处理即可制得乳果糖浆。
[0014]本发明的有益效果:本发明用于生产乳果糖操作简单、作用条件温和、易掌握，没有有色副产物生成，产物纯度高，易纯化。菌株培养条件粗放，产酶周期短，操作方便，大大提高了酶法生产乳果糖的产量，是发酵工艺中的重大的创新，值得推广。
[0015](四)【具体实施方式】实施例1
本发明的节杆菌突变株Arthrobacter sp.jnsb_2可应用于发酵生产乳糖酶，具体如下:
(I)培养基的配制
固体培养基:蛋白胨I%、酵母提取物0.5%、NaCll%，pH 7.0，琼脂2%，121°C灭菌20min。种子培养基:蛋白胨I %、酵母提取物0.5%、NaCll%，pH 7.0，121°C灭菌20min。
[0016]发酵培养基:乳糖2%，酵母膏 1.4 %，氯化1? 0.5mmol/L Zn2+1 Ommo I/L，FeCl3L Smmol /T,, pH7.0，121°C灭菌 20min。
[0017](2)菌种发酵培养
将节杆菌突变株Arthrobacter sp.jnsb-2固体斜面活化2h，然后接一环此菌至种子培养基，30°C恒温培养lh，摇瓶转速200r/min。将上述种子菌悬液以10% (v/v)接种至发酵培养基，25°C恒温培养lh，摇瓶转速200r/min。
[0018](3)将发酵液以5000rpm离心1min收集细胞，用同体积磷酸缓冲液(10mmol/L，pH7.0)重悬，经超声波破碎细胞，12000rpm，离心lOmin，取上清即为酶液。
[0019]利用本实施的经节杆菌突变株生产得到的乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具体为:
(I)底物溶液的配制
用PH5.5-8.0的磷酸缓冲液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖浓度为300g/L，果糖浓度为 250g/L ；
(2)水解和转苷反应向步骤(I)的溶液中加入600U/L乳糖酶，Zn2+ 10mmol/L，氯化铁4 mmol/L，在20°C反应1.5h，进行水解和转苷反应，得到酶解液；
(3)酶解液的后处理
向步骤(2)中得到的酶解液中加入无水乙醇，使其终浓度为65%，12000rpm，离心lOmin，上清液经60°C加热浓缩。经检测，乳果糖含量为94.1%。
[0020]实施例2
与实施例1基本相同，其不同之处在于:
步骤(I)中所用发酵培养基为葡萄糖1%，玉米浆2.5%，氯化钙0.5!1111101/1，Zn2+10mmol/L , FeCl3 1.5mmo 1/L ;步骤(2)中接种后的发酵培养条件为:25°C恒温培养0.8h，摇瓶转速 200r/min。
[0021]步骤(3)中发酵液以5000rpm离心15min收集细胞，用同体积磷酸缓冲液(10mmol/L，pH7.0)重悬，经超声波破碎细胞，lOOOOrpm，离心15min，取上清即为酶液。
[0022]利用本发明的经节杆菌突变株生产得到的乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具体为:
(1)底物溶液的配制
用pH5.5-8.0的磷酸缓冲液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖浓度为300g/L，果糖浓度为 250g/L ；
(2)水解和转苷反应
向步骤(I)的溶液中加入600U/L乳糖酶，在25°C反应lh，进行水解和转苷反应，得到酶解液；
(3)酶解液的后处理
向步骤(2)中得到的酶解液中加入无水乙醇，使其终浓度为70%，12000rpm，离心lOmin，上清液经60°C加热浓缩。经检测，乳果糖含量为93.7%。
[0023]实施例3
与实施例1基本相同，不同之处在于:发酵培养基为甘油0.2%，蛋白胨1%，酵母膏 0.5%,KH2P0415mmol/L,MgS04.7H20 2.5mmol/L，氯化钙0.5mmol/L，Zn2+10mmol/L ;步骤
(2)中接种后的发酵培养条件为:
25°C恒温培养1.5h，摇瓶转速200r/min。
[0024]利用本发明的经节杆菌突变株生产得到的乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具体为:
(1)底物溶液的配制
用pH 5.5-8.0的磷酸缓冲液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖浓度为300g/L，果糖浓度为 250g/L ；
(2)水解和转苷反应
向步骤(I)的溶液中加入600U/L乳糖酶，在25°C反应1.5h，进行水解和转苷反应，得到酶解液；
(3)酶解液的后处理
向步骤(2)中得到的酶解液中加入无水乙醇，使其终浓度为70%，12000rpm，离心lOmin，上清液经65°C加热浓缩。经检测，乳果糖含量为90.7%。
[0025] Zn2+可以为 ZnS04、ZnCl2。
【主权项】
1.一种酶法生产乳果糖，其特征在于:包括以下步骤: (1)节菌突变株生产乳糖酶:将节杆菌突变株经固体斜面活化、种子培养后再进行发酵培养，其中， 发酵培养的培养基:碳源可选用葡萄糖、乳糖或甘油中的任一种，其质量体积比浓度为1% -2% ;氮源可选用酵母膏、蛋白胨或玉米浆中的一种或多种，其质量体积比浓度为0.5-12% ;无机盐可选用氯化钙、Zn2+、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或氯化铁中的一种或多种，其浓度为12-28mmol/L，其浓度为；发酵培养的条件为:25_30°C培养；将生成的发酵液经5000-6000rpm离心得到菌体，随后经破碎细胞、10000-12000rpm离心取上清液即为酶液； (2)底物溶液的配制:用pH5.5-8.0的磷酸缓冲液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖浓度为300g/L，果糖浓度为250g/L ； (3)水解和转苷反应 向底物溶液中加入600U/L乳糖酶，Zn2+ 1mmoI/L，氯化铁4-6 mmol/L在20_25°C反应0.5-1.5h，进行水解和转苷反应，得到酶解液； (4)酶解液的后处理 向酶解液中加入无水乙醇，使其终浓度为65-70%，经离心后取上清液经60-65°C加热浓缩后处理即可制得乳果糖浆。
【专利摘要】本发明涉及一种酶法生产乳果糖，包括以下步骤：节菌突变株生产乳糖酶；用pH5.5-8.0的磷酸缓冲液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖浓度为300g/L，果糖浓度为250g/L；向底物溶液中加入600U/L乳糖酶，Zn2+10mmol/L，氯化铁4-6mmol/L在20-25℃反应0.5-1.5h，进行水解和转苷反应，得到酶解液；向酶解液中加入无水乙醇，经离心即可制得乳果糖浆。本发明用于生产乳果糖操作简单、作用条件温和、易掌握，没有有色副产物生成，产物纯度高，易纯化。菌株培养条件粗放，产酶周期短，操作方便，大大提高了酶法生产乳果糖的产量，是发酵工艺中的重大的创新，值得推广。
【IPC分类】C12P19-14, C12R1-06, C12P19-12
【公开号】CN104805152
【申请号】CN201410726572
【发明人】窦宝德, 张继红, 窦光朋
【申请人】山东百龙创园生物科技有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2014年12月4日