一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF92蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及属于生物技术领域，特别涉及一株ⅱ型鲤疱疹病毒orf92蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术：

鲫(cruciancarp)饲养成本低，养殖地域广，在我国淡水养鱼上占有重要地位，我国鲫鱼养殖主要集中在东部、中部和南部地区，如江苏、湖北、江西、安徽、山东、广东、四川、辽宁、湖南、浙江等省。据统计，2013年我国鲫鱼年产量达259.44万吨，其中主要养殖品种为异育银鲫(carassiusauratusgibelio)。近年来，疱疹病毒性造血器官坏死病(herpesviralhaematopoieticnecrosis，hvhn)频发，对我国鲫鱼养殖业造成了严重影响。hvhn是鲫的一种高致病性病毒病，其病原为ii型鲤疱疹病毒(cyprinidherpesvirus2，cyhv-2)。cyhv-2与分离自鲤科鱼类的另外两种病毒鲤疱疹毒1(cyprinidherpesvirus1，cyhv-1)和鲤疱疹病毒3(cyprinidherpesvirus3，cyhv-3)亲缘关系较近，与沟鲶疱疹病毒(ictaluridherpesvirus1，ichv-1)关系相对较远。jung等在1995年对cyhv-2进行了第一次报道，发现cyhv-2是金鱼造血器官坏死病的致病病原。接着，美国、澳大利亚、中国台湾、英国养殖的金鱼也爆发该病。自从2011年匈牙利首次在养殖的鲫体内检测到cyhv-2后，近几年来关于cyhv-2感染鲫的报道也逐渐增多，捷克、意大利先后报道了cyhv-2感染鲫并引起鲫大批量死亡的情况。在我国，多个实验室在2012年和2013年先后报道了cyhv-2感染鲫的情况。虽cyhv-2有比较高的致死率，但其可以感染的种类比较少，只可以感染金鱼、鲫以及它的普通变种。组织病理学研究表明，被病毒感染的鲫体表出血，伴随眼球膨出，腹部膨胀，内脏器官严重出血，鳔壁斑点状出血。这些报道均表明cyhv-2是一种新生养殖鲫鱼病毒病，其发病区域在逐年扩大。cyhv-2病害已经引起我国水产养殖业管理部门及养殖户高度重视。

技术实现要素：

本发明公开一株ⅱ型鲤疱疹病毒orf92蛋白的单克隆抗体及其应用，本发明成功克隆了pgex-4t-3-orf92质粒，筛选出一株抗ⅱ型鲤疱疹病毒orf92蛋白的细胞株cyhv-2-orf92-1b7，首次获得了抗cyhv-2-orf92的单克隆抗体，可特异性识别cyhv-2病毒粒子和orf92重组蛋白，可用于制备关于cyhv-2检测诊断试剂或设备中的应用。

为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

一株ⅱ型鲤疱疹病毒orf92蛋白的单克隆抗体,所述单克隆抗体由保藏号为cctccno:c2017208杂交瘤细胞分泌，所述单克隆抗体特异性识别cyhv-2病毒粒子和orf92重组蛋白。

所述杂交瘤细胞制备方法如下：以gst-orf92重组蛋白为抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞。

所述gst-orf92重组蛋白为抗原免疫的小鼠脾细胞的获得方法为：第一次免疫为腹腔注射，抗原与弗氏完全佐剂等体积充分乳化后免疫；14天后进行第二次免疫，抗原与弗式不完全佐剂等体积充分乳化后对小鼠腹腔注射免疫；7天后第三次免疫采用不加佐剂的抗原皮下注射免疫；7天后进行第四次不加佐剂的抗原皮下注射免疫。

所述的gst-orf92重组蛋白的制备方法为：从ⅱ型鲤疱疹病毒pcr扩增出orf92基因，将orf92基因克隆至pgex-4t-3质粒上，获得重组质粒pgex-4t-3-orf92；将pgex-4t-3-orf92质粒转染到大肠杆菌中诱导表达出gst-orf92重组蛋白。

所述单克隆抗体特异性识别cyhv-2病毒粒子和orf92重组蛋白，用于制备关于cyhv-2检测诊断试剂或设备中的应用。

所述杂交瘤细胞在2017年10月20日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctccno:c2017208。

所述杂交瘤细胞制备方法如下：以gst-orf92重组蛋白为抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞。

本发明的有益效果是：本发明成功克隆了pgex-4t-3-orf92质粒，筛选出一株抗ⅱ型鲤疱疹病毒orf92蛋白的细胞株cyhv-2-orf92-1b7，首次获得了抗cyhv-2-orf92的单克隆抗体，可特异性识别cyhv-2病毒粒子和orf92重组蛋白，可用于制备关于cyhv-2检测诊断试剂或设备中的应用。

附图说明

图1为dot-blot法筛选出效果最佳的细胞株结果图。

图2为dot-blot验证后，扩大培养1b7细胞株，1b7细胞株分泌上清在western-blotting中特异性识别cyhv-2病毒中的orf92蛋白，验证表明该株细胞为orf92重组蛋白抗体的细胞株。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例1

orf92原核表达：

1.orf92基因片段扩增

根据cyhv-2orf92的基因序列设计特异性引物

(f:5'-ggaattccatgtctagtcaacagtacatcatc-3'；r:5'-gcggccgcaaaaggaaaactcggtgcagatga-3')，在上下游引物序列中分别插入ecori和noti酶切位点，以经蔗糖梯度离心纯化过的cyhv-2病毒粒子中所提出的dna为模板，对orf92基因进行pcr扩增，pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳，割胶后用纯化回收试剂盒对目的片段进行回收。

2.orf92基因的克隆

将纯化回收得到的pcr产物和空载体质粒pgex-4t-3双酶切处理(体系：ecori1μl，noti1μl，10×buffer3μl，pcr纯化回收产物≤200ng，加灭菌水到30μl；质粒体系：ecori1μl，noti1μl，10×buffer5μl，质粒≤1μg，加灭菌水到50μl)，37℃1h后，酶切后用t4dna连接酶连接orf92目的片段和pgex-4t-3[t4liqase1μl，t4liqasebuffer2.5μl，pgex-4t-3100ng，orf92目的片段200ng，加灭菌水到25μl]，将连接后的产物转化到dh5α大肠杆菌中，筛选阳性克隆，菌液pcr鉴定为阳性的提取其重组质粒，经测序鉴定正确后，命名为pgex-4t-3-orf92。

3.诱导表达和可溶性分析

将pgex-4t-3-orf92转化到bl21大肠杆菌中，挑取lb/amp平板筛选的阳性克隆，接种阳性菌落pgex-4t-3-orf92到2mllb(ampr⁺)培养基中，37℃摇床培养过夜。接着按照1:100的比例转移至刚配制的lb(ampr⁺)液体培养基中培养，37℃，150r/min恒温摇床培养3-4h，加入终浓度为0.2mmol/l的iptg诱导，诱导5h后收集表达细菌，4℃，8500r/min离心30min；1×pbs洗涤两次，用适量1×pbs重悬后进行超声破碎处理约为120次(超声6s间隔6s，功率60％)至溶液澄清。4℃，12000r/min离心10min后分别收集上清和沉淀，制样后进行sds-page电泳，鉴定表达蛋白的可溶性。

4.目的蛋白纯化

诱导出表达大量目的蛋白后，将沉淀分别用2mol/l，4mol/l，6mol/l，8mol/l的尿素处理15min，每步均在4℃下8500r/min，离心20min，而后将洗脱下的蛋白用透析袋透析，依次放入含6、4、2和0mol/l尿素的pbs溶液中透析，每个浓度透析4h。透析后用bca法测定微量蛋白浓度测定试剂盒，测其浓度，于-80℃保存。

实施例2

单抗制备：

1.sp2/0小鼠骨髓瘤细胞及实验用小鼠

sp2/0小鼠骨髓瘤细胞由本实验室保存，免疫前进行复苏并培养，使其处于对数生长期。实验用spf级babl/c小鼠购自上海市实验动物研究中心，免疫前实验室暂养7天。

2.免疫程序

用已纯化好的目的蛋白免疫小鼠，免疫剂量为100μg/只。第一次免疫为腹腔注射，抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀后免疫；第一次免疫后14天进行第二次免疫，仍为腹腔注射，抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分乳化后对小鼠进行免疫。随后的第三次免疫是不加佐剂的纯抗原进行腹腔注射。在免疫以后第三天，对小鼠眼角采血，检测其血清是否为阳性；若为阳性，则可以在第七天进行最后一次免疫。

3.细胞融合及培养

经过4次免疫后的第三天，麻醉小鼠后拉颈将其处死并将其浸泡在75％的乙醇溶液中，将没有经过处理的2只4周龄小鼠也以同样方法处死浸泡在75％的乙醇溶液消毒处理。在无菌条件下取免疫小鼠的脾脏和未免疫小鼠的胸腺细胞，分别在100目网筛上进行研磨，用rpmi1640培养液吹下形成单细胞悬液，在25℃条件下，1000rpm离心3min，去上清，用预热的1％hat选择培养基重悬细胞沉淀，备用。将小鼠脾脏细胞的悬液和处于对数生长期的sp2/0小鼠骨髓瘤细胞混合均匀，25℃离心3min，弃去上清，握拳击打离心管下壁约20下，使其混合，然后缓慢滴加50％peg溶液1ml，缓慢滴加37℃rpmi1640培养液10ml，5分钟后补加rpmi1640培养液至40ml，25℃条件下1000rpm，离心5min，去上清。然后加入预热的1％hat选择性培养基至40ml，滴至96孔板中，每孔200μl，在5％co2恒温培养箱内37℃的恒温培养。

4.采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆

用hat选择培养液培养小鼠骨髓瘤细胞的细胞，培养7～10d后，将有单个细胞堆的孔换用ht选择培养基，培养3～4d后，用rpmi1640完全培养基对阳性孔内细胞进行稀释至96孔细胞培养板中，选择单个细胞的阳性孔再一次进行克隆，直至达100％阳性孔率，总共进行了3次亚克隆。并采用dot-blot法检测，筛选阳性杂交瘤细胞，结果如图1所示，选出效果最佳的细胞株为1b7，转孔并扩大培养并建立细胞株用dmso保存。

5.对阳性细胞上清液进行westernblot验证

将纯化过的cyhv-2病毒加入2×sds-page上样缓冲液，制备样品，进行10％sds-page凝胶电泳，采用电转膜法(100v，120min)转至硝酸纤维素膜，5％脱脂牛奶室温封闭2h。用0.1mpbst清洗三次，将dot-blot法删选到的抗cyhv-2-orf92-1b7的阳性杂交瘤细胞上清作为一抗(室温2h，4℃过夜)，0.1mpbst清洗三次，hrp作为二抗(1：5000稀释，室温，2h)孵育硝酸纤维素膜，期间保持缓慢摇动，0.1mpbst清洗三次，用dab显色缓冲液避光显色，观察条带大小，拍照记录。具体结果如图2所示。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。