用于大肠癌诊断的尿液microRNA生物标志物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测
技术领域：
，更具体地，涉及用于rna
技术领域：
，特别是涉及一组用于大肠癌诊断的尿液microrna生物标志物、试剂盒及其应用。
背景技术：
：大肠癌(colorectalcancer，crc)，也称结直肠癌，自大肠粘膜上皮起源的恶性肿瘤，也是胃肠道中常见的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌(都是大肠的一部分)。大肠癌的发病率从高到低依次为直肠、乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠及横结肠。大肠癌是全世界仅次于肺癌和乳腺癌的第三大常见恶性肿瘤，全球每年新增病例超过100万。近年来，随着社会经济的发展，居民生活习惯、饮食结构的改变以及人口老龄化的进程加快，我国大肠癌发病率和死亡率呈逐步上升趋势。大肠癌早期无症状，或症状不明显，仅感不适、消化不良、大便潜血等，因此初诊的大肠癌以中晚期为主。现有的大肠癌诊断主要有乙状结肠镜和纤维结肠镜检查、x线检查、癌胚抗原(cea)试验。肠镜检查能够检视肿瘤大小、形态、部位、活动度等，并对可疑病灶能定向镜取组织进行活检，因此是目前大肠癌诊断最有效的手段，在大肠癌普查中，常作为评价各种初筛检效果的金标准。但事实上很多高危人群因为不愿接受痛苦的肠镜而拒绝1-2年的定期筛查。另外，x线检查也是诊断大肠癌的有效手段，一般均行钡餐灌肠检查，主要征象为粘膜局部变形、蠕动异常等，但对较小的，特别是对于直径小于2cm的癌显示常有困难。此外，癌胚抗原(cea)试验由于特异性并不强，在一些非消化道肿瘤及良性病变中血清水平亦可升高，对早期病例的诊断价值不大，只是对推测预后和判断复发有一定的帮助。因此，需要寻找新型无痛无创、高灵敏度和特异性的生物标志物来对大肠癌进行检测。microrna(mirna)是一类内生的、长度约为18-25nt的非编码rna，在细胞内具有多种重要的调节作用，普遍认为与人类疾病的发生有密切联系。有证据表明，mirna在肿瘤发生中起着类似于癌基因或抑癌基因的重要作用，可被运用到肿瘤的诊断和治疗监测中。此外，mirna在体外很稳定，研究认为循环中mirna主要由细胞分泌释放入血液，以外泌体(exosome)或蛋白复合体的形式存在，能够抵抗rna酶的消化作用和苛刻的条件，从而在细胞之间传递生物信息。因此，已有文献报道了血清或血浆中的特定mirna或mirna组合用于大肠癌的检测中。wang(wangs,etal.2015)等研究显示血浆中的mirna可用于大肠癌的早期检测，sun(yansun,etal.2016)等研究了血浆中的mirna用于不同分期的大肠癌检测。但这些检测方式的样本均会给受检者造成一定的痛苦。另一方面，尿液在维护机体健康，维持生命正常运转方面，发挥着不可替代的重要作用。由于尿液直接来源于血液，当血液流过肾小球毛细血管时，除血细胞和大分子蛋白质外，几乎所有血浆成分，包括少量分子量较小的血浆蛋白都能通过肾小球膜，滤到肾小球囊内形成原尿，因此尿液可以反映出很多有机体的生理变化。同时，尿液以代谢废物的方式排出，与血液类(如血清、血浆)样本相比，尿液可以非侵入的方式大量获得，不会对受检者造成额外痛苦。2004年科学家就发现人尿液中也存在着外泌体。然而，此前尿液样本只能用于泌尿系统癌症(如膀胱癌、肾癌)检测(kristinas,etal.2016；iddoz,etal.2014)。2015年，thalia等报道了尿液中的mirna用于乳腺癌检测的可行性，这首次突破了尿液样本只能用于泌尿系统癌症检测的局限。但是，尿液样本是否还适用于其它非泌尿系统癌症(例如大肠癌)的检测，这仍是需要本领域技术人员通过大量的理论研究和实验才能解决的难题。技术实现要素：本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种用于大肠癌诊断的尿液microrna生物标志物，以克服现有技术中的不足。本发明的第二目的还在于提供一种用于大肠癌诊断的试剂盒及其应用。为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：本发明实施例提供了micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p中的任意一种或两种以上的组合作为诊断大肠癌的生物标志物的用途。在一些较为具体的实施方案中，所述hsa-mir-92b-5p的核苷酸序列如seqidno：1所示，所述hsa-mir-4706的核苷酸序列如seqidno：2所示，所述hsa-mir-3665的核苷酸序列如seqidno：3所示，所述hsa-mir-3652的核苷酸序列如seqidno：4所示，所述hsa-mir-3714的核苷酸序列如seqidno：5所示，所述hsa-mir-550a-3-5p的核苷酸序列如seqidno：6所示。进一步的，所述的micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p来源于尿液。本发明实施例还提供了一种用于大肠癌诊断的microrna生物标志物，其包含micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p中的任意一种或两种以上的组合。在一些较为具体的实施方案中，所述hsa-mir-92b-5p的核苷酸序列如seqidno：1所示，所述hsa-mir-4706的核苷酸序列如seqidno：2所示，所述hsa-mir-3665的核苷酸序列如seqidno：3所示，所述hsa-mir-3652的核苷酸序列如seqidno：4所示，所述hsa-mir-3714的核苷酸序列如seqidno：5所示，所述hsa-mir-550a-3-5p的核苷酸序列如seqidno：6所示。进一步的，所述的micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p来源于尿液。本发明实施例还提供了一种用于大肠癌诊断的试剂盒，其包含对患者尿液中micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p中的任意一种或两种以上的组合的表达量进行检测的试剂。本发明实施例还提供了一种用于大肠癌诊断的芯片，其包含用于对micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p中的任意一种或两种以上的组合进行检测的mirna探针。本发明实施例还提供了前述的用于大肠癌诊断的microrna生物标志物在制备用于检测受试者中存在大肠癌的体外方法中的产品中的用途，所述的方法包括：测定来源于受试者的尿液的生物标志物的表达水平以获得测定值，所述的生物标志物选自micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p中的任意一种或两种以上的组合；将所述的测定值与参考值比较，若测定值高于参考值(参考值可以是通过测定来源于健康人群的尿液的生物标志物的表达水平而获得)，则确定受试者患有大肠癌。本发明发明人通过研究证实，大肠癌病人的尿液与正常对照相比，hsa-mir-92b-5p、hsa-mir-4706、hsa-mir-3665、hsa-mir-3652、hsa-mir-3714和hsa-mir-550a-3-5p的表达都上调。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明所提供的这6个microrna生物标志物及其相应引物组和探针可以用于制备诊断试剂盒，且其在应用于尿液样本的大肠癌诊断时，具有优异的灵敏度与特异性。进一步地，本案发明人通过研究证实，这6种microrna联合起来的auc值可以达到0.987，灵敏度和特异性分别为88.89％和100％。这6种microrna可以作为人大肠癌尿液样本诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性高于单一microrna诊断的灵敏度与特异性，有利于推动我国大肠癌的早期诊断、预测治疗、监测复发的发展。附图说明图1示出了本发明一典型实施例中由聚类分析产生的显著差异表达的microrna(p<0.01，差异大于2倍)分析结果示意图，其中有14个microrna在5对大肠癌患者尿液和正常对照中差异表达。图2a-图2f分别示出了本发明一典型实施例中6个microrna单独用于区分大肠癌患者和正常对照的roc曲线图。图2g示出了本发明一典型实施例中6个microrna联合用于区分大肠癌患者和正常对照的roc曲线图。图3a-图3f分别示出了本发明一典型实施例中6个mirna在19个大肠癌和19个健康人尿液样本中的表达水平变化示意图(所有p<0.01)。具体实施方式下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。本发明实施例的一个方面提供了micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p中的任意一种或两种以上的组合作为诊断大肠癌的生物标志物的用途。在一些较为具体的实施方案中，所述hsa-mir-92b-5p的核苷酸序列如seqidno：1所示，所述hsa-mir-4706的核苷酸序列如seqidno：2所示，所述hsa-mir-3665的核苷酸序列如seqidno：3所示，所述hsa-mir-3652的核苷酸序列如seqidno：4所示，所述hsa-mir-3714的核苷酸序列如seqidno：5所示，所述hsa-mir-550a-3-5p的核苷酸序列如seqidno：6所示。进一步地，所述mirna生物标志物为人尿液mirna生物标志物。进一步的，所述的micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p来源于尿液。本发明实施例的另一个方面提供了一种用于大肠癌诊断的microrna生物标志物，其包含micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p中的任意一种或两种以上的组合。在一些较为具体的实施方案中，所述hsa-mir-92b-5p的核苷酸序列如seqidno：1所示，所述hsa-mir-4706的核苷酸序列如seqidno：2所示，所述hsa-mir-3665的核苷酸序列如seqidno：3所示，所述hsa-mir-3652的核苷酸序列如seqidno：4所示，所述hsa-mir-3714的核苷酸序列如seqidno：5所示，所述hsa-mir-550a-3-5p的核苷酸序列如seqidno：6所示。进一步地，所述mirna生物标志物为人尿液mirna生物标志物。进一步的，所述的micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p来源于尿液。本发明实施例的另一个方面还提供了一种用于大肠癌诊断的试剂盒，其包含对患者尿液中micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p中的任意一种或两种以上的组合的表达量进行检测的试剂。在一些较为具体的实施方案中，所述试剂盒包含用于对micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p中的任意一种或两种以上的组合进行pcr检测的microrna引物组和microrna探针的组合。具体的，所述microrna的引物、探针包括：hsa-mir-92b-5p引物、探针，hsa-mir-4706引物、探针，hsa-mir-3665引物、探针，hsa-mir-3652引物、探针，hsa-mir-3714引物、探针，hsa-mir-550a-3-5p引物、探针。进一步的，所述microrna引物组包括反转录引物、pcr前引物和pcr后引物。在一些较为具体的实施方案中，所述hsa-mir-92b-5p的反转录引物序列如seqidno：7所示，pcr前引物序列如seqidno：13所示，pcr后引物序列如seqidno：19所示；所述hsa-mir-4706的反转录引物序列如seqidno：8所示，pcr前引物序列如seqidno：14所示，pcr后引物序列如seqidno：19所示；所述hsa-mir-3665的反转录引物序列如seqidno：9所示，pcr前引物序列如seqidno：15所示，pcr后引物序列如seqidno：19所示；所述hsa-mir-3652的反转录引物序列如seqidno：10所示，pcr前引物序列如seqidno：16所示，pcr后引物序列如seqidno：19所示；所述hsa-mir-3714的反转录引物序列如seqidno：11所示，pcr前引物序列如seqidno：17所示，pcr后引物序列如seqidno：19所示；所述hsa-mir-550a-3-5p的反转录引物序列如seqidno：12所示，pcr前引物序列如seqidno：18所示，pcr后引物序列如seqidno：19所示；所述microrna探针的序列如seqidno：20所示。进一步的，所述试剂盒还包括qpcr扩增检测的常规组件，所述qpcr扩增检测的常规组件包括逆转录酶、缓冲液、dntps、mgcl2、ddh2o、荧光染料、taq酶、标准品和对照物。在一些较为具体的实施方案中，本发明实施例的另一个方面还提供了一种用于大肠癌诊断的芯片，其包含用于对micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p中的任意一种或两种以上的组合进行检测的mirna探针。优选的，其中任一种mirna探针均具有与该探针的检测对象的全长成熟mirna完全互补的序列。本发明实施例的另一个方面还提供了前述的用于大肠癌诊断的microrna生物标志物在制备用于检测受试者中存在大肠癌的体外方法中的产品中的用途，所述的方法包括：测定来源于受试者的尿液的生物标志物的表达水平以获得测定值，所述的生物标志物选自micrornahsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p中的任意一种或两种以上的组合；将所述的测定值与参考值比较，若测定值高于参考值，则确定受试者患有大肠癌。其中，参考值可以是通过测定来源于健康人群的尿液的生物标志物的表达水平而获得。在一些实施例中，所述的方法具体包括：提取受试者的尿液中的生物标志物；提供与所述生物标志物对应的引物组和探针；以及，通过pcr检测方法测得所述测定值；其中，hsa-mir-92b-5p的反转录引物序列如seqidno：7所示，pcr前引物序列如seqidno：13所示，pcr后引物序列如seqidno：19所示；所述hsa-mir-4706的反转录引物序列如seqidno：8所示，pcr前引物序列如seqidno：14所示，pcr后引物序列如seqidno：19所示；所述hsa-mir-3665的反转录引物序列如seqidno：9所示，pcr前引物序列如seqidno：15所示，pcr后引物序列如seqidno：19所示；所述hsa-mir-3652的反转录引物序列如seqidno：10所示，pcr前引物序列如seqidno：16所示，定量pcr后引物序列如seqidno：19所示；所述hsa-mir-3714的反转录引物序列如seqidno：11所示，pcr前引物序列如seqidno：17所示，pcr后引物序列如seqidno：19所示；所述hsa-mir-550a-3-5p的反转录引物序列如seqidno：12所示，pcr前引物序列如seqidno：18所示，pcr后引物序列如seqidno：19所示；所述microrna探针的序列如seqidno：20所示。进一步的，所述方法具体包括：提取受试者的尿液中的生物标志物；提供检测芯片，所述检测芯片上载有具有与所述生物标记物的全长成熟mirna完全互补序列的mirna探针；以及，以所述检测芯片测得所述检测值。本案发明人通过研究证实，大肠癌病人的尿液与正常对照相比，hsa-mir-92b-5p、hsa-mir-4706、hsa-mir-3665、hsa-mir-3652、hsa-mir-3714和hsa-mir-550a-3-5p的表达都上调。这6个mirna的的auc值分别是0.918、0.902、0.876、0.866、0.873和0.886，灵敏度和特异性分别是66.67％和100％，83.33％和88.24％，94.44％和70.59％，77.78％和88.24％，66.67％和94.12％，77.78％和94.12％。进一步地，本案发明人通过研究证实，这6种microrna联合起来的auc值可以达到0.987，灵敏度和特异性分别为88.89％和100％。这6种microrna可以作为人大肠癌尿液样本诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性高于单一microrna诊断的灵敏度与特异性。以下结合附图和若干实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明。本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不祈祷限制性作用。本领域技术人员可由本说明书所解释的内容清楚的了解本发明的特点与功效，本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或运用。实施例中未说明具体条件的实验，通常按照常规条件如厂商说明书、实验指南或教科书内容的条件。在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。实施例1尿液中差异表达microrna(下文简称为mirna)的芯片筛选实验1、在取得患者知情同意后，从南通肿瘤医院收集12例确诊为大肠癌患者的尿液样本及12例健康人作为正常对照的尿液样本。尿液取样时选择晨尿的中段，留取4ml储存于-80℃冰箱中。2、使用mirneasyserum/plasmakit试剂盒(#217184,qiagen,hilden,germany)提取大肠癌患者和正常人尿液中的rna，操作步骤按照手册进行，并做了部分修改，具体步骤如下：(1)将4ml收集的尿液样本与8ml的qiazol裂解液彻底混匀，室温放置5分钟；(2)加入2.14ml的氯仿，彻底混匀，室温放置5分钟；(3)在12000g的条件下，4℃离心15分钟；(4)吸出上清约4ml，加入1.5倍体积的100％乙醇(6ml)，温柔混匀；(5)将1份混合液加入2个离心柱中，每次加入700ul，在8000g的条件下室温离心15秒，并倒去离出废液；(6)重复(5)的操作，分多次反复将混合液离心完；(7)在离心柱中加入700ul的rwt，在8000g的条件下室温离心15秒，并倒去离出废液；(8)在离心柱中加入500ul的rpe，在8000g的条件下室温离心15秒，并倒去离出废液；(9)在离心柱中加入500ul的80％的乙醇(现配现用)，在8000g的条件下室温离心2分钟，并倒去离出废液；(10)将离心柱放入新的收集管中，开盖，离心机室温全速离心5分钟，用于甩干离心柱膜上的有机溶剂；(11)将离心柱放入新的1.5ml收集管中，27ul的rnase-free水加入膜中央，离心机室温全速离心2分钟，收集溶解了rna的溶液25ul(有2ul死体积)，并将相同起始样品的2管合并，共50ul，放入-20℃冰箱收藏待用。3、在发现实验中，可以任选地使用人类unitagtmmirna表达谱芯片检测平台，对样本中差异表达的mirna进行分析。该芯片含有人类2017个mirna来自sangerdatabasev.19.0。(1)将提取得到的50ulrna样品加入到50ul的杂交液中(5×ssc，0.2％sds，100nm专用荧光报告探针，rnase-free水补至50ul)，吹打混匀；(2)将上述液体100ul全部加到unitagtmmirna芯片上，加盖4孔agilent硅化盖玻片(agilent，g2534-60011)，并放入芯片杂交盒中；(3)将杂交盒放入杂交炉(agilent，2545a)中15rpm、44℃杂交过夜，通常杂交时间在16小时；(4)杂交结束后，先在400ml37℃的5×ssc溶液中打开芯片和盖片，然后在400ml37℃的含有0.02％sds的5×ssc溶液中洗涤2次，每次3分钟，之后在400ml27℃的0.2×ssc溶液中洗涤2次，每次3分钟，一共四次洗涤，都是将液体在摇床上以100rpm进行漂洗；(5)将芯片从洗液中取出，在玻片离心机上甩干；(6)芯片用luxscan10k双通道激光扫描仪(capitalbio公司)进行扫描，数据提取用luxscan3.0图像分析(capitalbio公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号。4、基因芯片数据扣除背景信号后，用r语言中的limma包对数据进行quantile归一化，使用spss19.0软件进行配对t-检验获得p<0.01，差异大于2倍的差异表达基因，并用cluster3.0进行聚类分析。5、利用mirna芯片对12对大肠癌患者和正常对照的尿液进行差异表达分析，共筛选出14个差异表达的mirna，分别是has-mir-10b-5p、has-mir-3652、has-mir-4706、has-mir-4723-5p、has-mir-185-3p、has-mir-4419b、has-mir-92b-5p、has-mir-3714、has-mir-575、has-mir-3665、has-mir-550a-5p、has-mir-550a-3-5p、has-mir-6131、has-mir-4446-3p，且与正常对照相比，在大肠癌尿液中上述mirna都上调表达(参见图1)。实施例2：尿液中mirna的qrt-pcr实验1、根据mirna芯片结果，选择芯片结果中信号值大于1000的6个mirna用qrt-pcr方法进行进一步的实验(其中，1000是一个人为的阈值，信号值高，mirna的含量相对高，更容易被检测到)。所选择的hsa-mir-92b-5p、has-mir-4706、has-mir-3665、has-mir-3652、has-mir-3714和has-mir-550a-3-5p的引物见下表。对大肠癌患者和正常对照的尿液单个个体进行mirna的qrt-pcr检测，在整个研究中实施严格质控，每个样本连续检测至少三次。2、在取得患者知情同意后，从南通肿瘤医院收集75例确诊为大肠癌患者的尿液样本及75例健康人作为正常对照的尿液样本。尿液取样时选择晨尿的中段，留取1ml储存于-80℃冰箱中。3、使用mirneasyserum/plasmakit试剂盒(#217184,qiagen,hilden,germany)提取大肠癌患者和正常人尿液中的rna，操作步骤按照手册进行，并做了部分修改。(1)将1ml收集的尿液样本与2ml的qiazol裂解液彻底混匀，室温放置5分钟；(2)加入0.54ml的氯仿，彻底混匀，室温放置5分钟；(3)在12000g的条件下，4℃离心15分钟；(4)吸出上清约1ml，加入1.5倍体积的100％乙醇(1.5ml)，温柔混匀；(5)将混合液加入离心柱中，每次加入700ul，在8000g的条件下室温离心15秒，并倒去离出废液；(6)重复(5)的操作，分多次反复将混合液离心完；(7)在离心柱中加入700ul的rwt，在8000g的条件下室温离心15秒，并倒去离出废液；(8)在离心柱中加入500ul的rpe，在8000g的条件下室温离心15秒，并倒去离出废液；(9)在离心柱中加入500ul的80％的乙醇(现配现用)，在8000g的条件下室温离心2分钟，并倒去离出废液；(10)将离心柱放入新的收集管中，开盖，离心机室温全速离心5分钟，用于甩干离心柱膜上的有机溶剂；(11)将离心柱放入新的1.5ml收集管中，20ul的rnase-free水加入膜中央，离心机室温全速离心2分钟，收集溶解了rna的溶液18ul(有2ul死体积)，放入-20℃冰箱收藏待用。4、使用primescripttmrtmastermix(cat#rr037a,takara)和反转录引物按操作手册进行逆转录反应。(1)按照下表进行反应溶液的配置，至总体积20ul；成分终浓度体积5×逆转录缓冲液1×4μlhasu6/microrna反转录引物(2um)1pmol1μlrna模板----5μlprimescript逆转录酶混合液1----1μldepc水至20μl(2)将上述配制的反应液用移液器轻轻混匀短暂离心后，37℃反应15分钟，85℃反应5秒，完成后置于冰上，加入20μl的ddh2o稀释待用。5、使用480sybrgreenimaster(cat#04707516001,roche)进行qpcr反应，仪器使用罗氏lightcycler480(roche公司)。(1)按照下表进行反应溶液的配置，至总体积20ul；成分终浓度体积2×定量pcr反应混合液1×10μlhasu6/microrna前引物(10um)0.5μm1μlhasu6/microrna后引物(10um)0.5μm1μlcdna模板----1μl双蒸水至20μl(2)将上述配制的反应液短暂离心后，进行pcr反应，按下述程序进行反应；6、pcr扩增结果用ct值表示，即pcr反应中荧光信号达到所设定阈值时的循环数。尿液样品中的mirna表达量可用方程2-△ct表示，其中△ct＝ctmirna-ctu6。7、采用spss19.0软件进行数据处理，mann-whitneyu检验用于比较大肠癌病人组和正常对照组中尿液mirna的表达差异，p<0.05倍认为有统计学意义。用medcalc15.8软件进行roc曲线分析，并计算出灵敏度和特异性。8、数据分析结果显示，hsa-mir-92b-5p、hsa-mir-4706、hsa-mir-3665、hsa-mir-3652、hsa-mir-3714和hsa-mir-550a-3-5p的差异表达具有显著性(p<0.05)，且5个mirna的roc曲线下面积(auc)分别如下：hsa-mir-92b-5p，0.918(95％置信区间，0.775-0.984)；hsa-mir-4706，0.902(95％置信区间，0.753-0.976)；hsa-mir-3665，0.876(95％置信区间，0.720-0.963)；hsa-mir-3652，0.866(95％置信区间，0.708-0.957)；hsa-mir-3714，0.873(95％置信区间，0.716-0.961)；hsa-mir-550a-3-5p，0.886(95％置信区间，0.733-0.968)(图2a-图2f)。在最佳的cutoff值下，mirna的灵敏度和特异性如下：hsa-mir-92b-5p，分别为66.67％和100％；hsa-mir-4706分别为83.33％和88.24％；hsa-mir-3665分别为94.44％和70.59％；hsa-mir-3652分别为77.78％和88.24％；hsa-mir-3714分别为66.67％和94.12％；hsa-mir-550a-3-5p分别为77.78％和94.12％。这5个mirnas联合起来的auc值可达到0.987，(95％置信区间，0.876-1.000)，灵敏度和特异性分别为88.89％和100％(图2g)，优于单个mirna。这些结果表明，hsa-mir-92b-5p、hsa-mir-4706、hsa-mir-3665、hsa-mir-3652、hsa-mir-3714和hsa-mir-550a-3-5p联合起来对大肠癌尿液进行检测，对大肠癌的诊断具有非常高的灵敏度和特异性。实施例3：人大肠癌诊断用qpcr试剂盒上述实施例表明，hsa-mir-92b-5p、hsa-mir-4706、hsa-mir-3665、hsa-mir-3652、hsa-mir-3714和hsa-mir-550a-3-5p对大肠癌尿液检测具有较高的诊断价值(高灵敏度和特异性)，因此可基于hsa-mir-92b-5p、hsa-mir-4706、hsa-mir-3665、hsa-mir-3652、hsa-mir-3714和hsa-mir-550a-3-5p制作人大肠癌诊断用试剂盒。该试剂盒包括hsa-mir-92b-5p引物，hsa-mir-4706引物，hsa-mir-3665引物，hsa-mir-3652引物，hsa-mir-3714引物，hsa-mir-550a-3-5p引物，以及通用探针。各引物具体包括反转录引物、定量pcr前引物和通用的定量pcr后引物，且通用的定量pcr后引物与通用的探针预混合在一起方便使用。当然试剂盒中还应该包括相应pcr反应所需的常规酶和试剂，如逆转录酶、缓冲液、dntps、mgcl2、ddh2o、荧光染料、taq酶及标准品和对照物等。下表为引物和探针的一种设计。引物和探针的设计是本领域常规技术手段，也可设计成其他序列。此试剂盒的价值在于只需要尿液样本(晨尿最佳)，而不需要组织、血液样本，就可以用于大肠癌的诊断。实施例4：人大肠癌诊断用芯片试剂盒同理，基于芯片的mirna检测也可用于大肠癌尿液的诊断。通过制作少量探针的芯片，即可检测hsa-mir-92b-5p、hsa-mir-4706、hsa-mir-3665、hsa-mir-3652、hsa-mir-3714和hsa-mir-550a-3-5p的表达，从而对尿液样本进行大肠癌的诊断。1、mirna芯片中所有设计的mirna探针序列与它们对应检测的全长成熟mirna完全互补。检测的mirna包括hsa-mir-92b-5p、hsa-mir-4706、hsa-mir-3665、hsa-mir-3652、hsa-mir-3714和hsa-mir-550a-3-5p。此外，设计了2个寡核苷酸探针序列acaggcgattccggttccg((seqidno.24)、cctcatgctccaaaaaaacac(seqidno.25)，它们与已知的mirna序列不同源，用于对应合成的外参rna的检测(cggaaccggaaucgccugu(seqidno.26)，guguuuuuuuggagcaugagg(seqidno.27))，从而质控mirna芯片。为了将探针固定化到醛基修饰的玻片表面，这些探针序列的5’端加上15个碱基的polya，并有c6的5’-氨基修饰。寡核苷酸探针在takara合成，溶解在easyarraytm点样溶液中，浓度为20μm。使用smartarraytm点样仪(博奥生物公司)，每个探针重复点样3次。2、尿液(晨尿最佳)的总rna的提取用trizol试剂，小rna用ambion的mirnaisolationkit提取，并加入2条合成的外参rna各200pm。使用t4rna连接酶标记技术对小rna进行标记，即将4μg的小rna和500ng的5’-phosphate-cytidyl-uridyl-cy3-3’(dharmacon，lafayette)混合，在t4rna连接酶(newenglandbiolabs)作用下进行标记。标记反应在4℃进行2小时。之后用0.3m乙酸钠和2.5倍体积乙醇沉淀，再用乙醇洗涤，干燥后悬浮在50μl含有5×ssc，0.2％sds的杂交缓冲液中。3、芯片杂交在agilent杂交盒(agilent，g2534a)中进行，采用8孔硅化盖玻片(agilent，g2534a-60014)，杂交盒在杂交炉(agilent，2545a)中15rpm、44℃杂交过夜，杂交时间为16小时。4、芯片在37℃的5×ssc溶液中打开芯片和盖片，用0.02％sds的5×ssc洗涤溶液洗涤3分钟，2次，之后在27℃的0.2×ssc溶液中洗涤3分钟，2次。完成后，将芯片从洗液中取出，在玻片离心机上甩干。5、芯片用luxscan10k扫描仪扫描(capitalbio公司)，用luxscan3.0图像分析(capitalbio公司)分析获得的图像。当芯片中检测到的外参rna探针信号高于5000，则表示芯片质控合格。然后，基因芯片数据扣除背景信号后，进行quantile归一化，确定这些mirnas的表达情况，并与对照样品进行比较，根据logistic回归分析方程对提供的人尿液样品进行诊断。对19个大肠癌和19个健康人尿液中的hsa-mir-92b-5p、hsa-mir-4706、hsa-mir-3665、hsa-mir-3652、hsa-mir-3714和hsa-mir-550a-3-5p进行芯片检测，结果表明在两组人尿液中的mirnas表达有显著差异(p<0.01)，如图3a-图3f。综上所述，藉由上述技术方案，本发明所提供的这6个microrna生物标志物及其相应引物组和探针可以用于制备诊断试剂盒，且其在应用于尿液样本的大肠癌诊断时，具有优异的灵敏度与特异性。进一步地，本案发明人通过研究证实，这6种microrna联合起来的auc值可以达到0.987，灵敏度和特异性分别为88.89％和100％。这6种microrna可以作为人大肠癌尿液样本诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性高于单一microrna诊断的灵敏度与特异性，有利于推动我国大肠癌的早期诊断、预测治疗、监测复发的发展。应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所<120>用于大肠癌诊断的尿液microrna生物标志物、试剂盒及其应用<160>27<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>rna<213>人工序列(人工序列)<400>1agggacgggacgcggugcagug22<210>2<211>25<212>rna<213>人工序列(人工序列)<400>2agcggggaggaagugggcgcugcuu25<210>3<211>18<212>rna<213>人工序列(人工序列)<400>3agcaggugcggggcggcg18<210>4<211>18<212>rna<213>人工序列(人工序列)<400>4cggcuggaggugugagga18<210>5<211>22<212>rna<213>人工序列(人工序列)<400>5gaaggcagcagugcuccccugu22<210>6<211>20<212>rna<213>人工序列(人工序列)<400>6agugccugagggaguaagag20<210>7<211>57<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>7gtcgggatccagagcagggtccgaggtacacgttcgctctggatcccgaccactgca57<210>8<211>57<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>8gtcgggatccagagcagggtccgaggtacacgttcgctctggatcccgacaagcagc57<210>9<211>56<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>9gtcgggatccagagcagggtccgaggtacacgttcgctctggatcccgaccgccgc56<210>10<211>57<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>10gtcgggatccagagcagggtccgaggtacacgttcgctctggatcccgactcctcac57<210>11<211>56<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>11gtcgggatccagagcagggtccgaggtacacgttcgctctggatcccgacacaggg56<210>12<211>57<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>12gtcgggatccagagcagggtccgaggtacacgttcgctctggatcccgacctcttac57<210>13<211>17<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>13ctttagggacgggacgc17<210>14<211>18<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>14ctttagcggggaggaagt18<210>15<211>17<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>15gcctttagcaggtgcgg17<210>16<211>17<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>16gcctttcggctggaggt17<210>17<211>18<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>17ctttgaaggcagcagtgc18<210>18<211>19<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>18gcctttagtgcctgaggga19<210>19<211>17<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>19agagcagggtccgaggt17<210>20<211>8<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>20tcgggatc8<210>21<211>19<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>21ggaacgcttcacgaatttg19<210>22<211>23<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>22attggaacgatacagagaagatt23<210>23<211>19<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>23ggaacgcttcacgaatttg19<210>24<211>19<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>24acaggcgattccggttccg19<210>25<211>21<212>dna/rna<213>人工序列(人工序列)<400>25cctcatgctccaaaaaaacac21<210>26<211>19<212>rna<213>人工序列(人工序列)<400>26cggaaccggaaucgccugu19<210>27<211>21<212>rna<213>人工序列(人工序列)<400>27guguuuuuuuggagcaugagg21当前第1页12