本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种通过两个阶段的发酵制得柠檬酸发酵液的方法。
背景技术：
柠檬酸是典型的生物发酵产品，是产量最大的有机酸。其主要生产方法为微生物深层发酵法。柠檬酸发酵的工业生产已经发展多年并且基本形成了成熟的生产工艺，但是生产工艺仍然有很多方面需要改进完善。目前，传统柠檬酸发酵工艺是：先将黑曲霉孢子培养成种子液，然后将种子液转接至发酵罐内培养获得发酵液。柠檬酸生产主要以玉米作为原料，将玉米粉碎经过两次加酶两次喷射，得到玉米液化液，将80％玉米液化液经过板框过滤得到糖液。未过滤的玉米液化液氮源含量高，营养丰富，主要用来配制种子培养基和为发酵培养基提供氮源；而糖液中大部分蛋白质被过滤掉，氮源浓度低，主要为发酵培养基提供碳源。
在同步糖化发酵生产柠檬酸的工艺中，菌体活力至关重要，主要表现在产糖化酶的能力和产酸速率，其中产糖化酶能力是将糊精转化成葡萄糖的能力，更是发酵指标好坏的基础。因此，在柠檬酸发酵中，如何培养分泌糖化酶能力强和产酸速率快的高活力黑曲霉菌体是提高发酵指标的重要途径。
黑曲霉分泌糖化酶能力和产酸速率与培养基营养物质组分、ph环境密切相关。目前，对于黑曲霉菌体活力表征的研究较少，如何通过营养物质组分(c/n)提高黑曲霉菌体活力，并调控黑曲霉生长和产酸的两阶段发酵未见报道，大多数文献只是按照传统的分批发酵模式进行发酵工艺优化。因此，有必要开发一种以糖化酶活力和产酸速率等作为活力表征的，以营养物质组分作为调控手段的黑曲霉发酵生产柠檬酸的方法。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种通过两阶段发酵生产柠檬酸的方法。本发明两阶段培养，通过营养物质(c/n)的调控，避免了发酵前期ph下降和营养物质浓度对菌体生长的影响，增加糖化酶活力，提高淀粉质原料的利用效率和利用率，降低发酵残糖，提高糖酸转化率；增加产酸速率，缩短发酵周期。
本发明的技术方案如下：
一种通过两阶段发酵生产柠檬酸发酵液的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)取黑曲霉麸曲孢子，加入无菌水，制成孢子悬液，转接至种子罐内培养16～24h，得到种子液；
(2)在发酵罐内加入占发酵罐有效体积8～12％的玉米液化液，将温度降至35～39℃；
(3)将步骤(1)所得的种子液转至发酵罐内培养2～8h；
(4)再在发酵罐内加入占有效体积60～64％的糖液继续培养，还原糖低于5g/l停止发酵，得到柠檬酸发酵液。
步骤(2)中所述玉米液化液的制备方法为：将玉米进行粉碎后，过60目筛；所得玉米粉与自来水按1:3的质量比混合均匀，用ca(oh)2将粉浆ph调至6.0，按25u/g玉米粉的添加量加入α—高温淀粉酶；所得粉浆先经过97℃喷射，保温1.5h后再经过127℃喷射，经过闪蒸将料液温度降至95℃，保温1h，碘试呈浅棕色后得到合格玉米液化液。
步骤(4)中所述糖液的制备方法为：将玉米液化液经过板框过滤去掉滤渣，得到糖液。
步骤(3)中所述种子液的接种比例为发酵罐有效体积的6～8％。
步骤(4)中所述糖液在罐外先经过螺旋板式换热器处理，温度达到35～39℃后加入发酵罐内。
步骤(4)中所述糖液需要在2～12h内完成补加。
本发明采用两阶段发酵，发酵第一阶段，在发酵罐内只加入玉米液化液，降温后加入成熟种子液，保证前期培养基c/n(c/n≤25)与种子罐接近，促使菌体在较高氮源浓度的条件下进行快速生长，提高种子活力。培养2-8h后进入发酵第二阶段，在发酵罐内加入糖液，提高发酵培养基c/n(c/n≥65)，促进产酸，继续培养结束得到发酵液。
第一阶段：菌体生长阶段，高氮源浓度，低c/n，与种子罐接近，有利于菌体生长，提高菌体活力。
第二阶段：快速产酸阶段，加入糖液，降低氮源浓度，提高c/n，有利于产酸，增加溶解氧，提高产酸速率。
本发明有益的技术效果在于：
本发明将菌体分泌糖化酶活力和产酸速率作为菌体活力的表征指标，将抽象指标用数据衡量，判断更准确。
本发明将未过滤玉米液化液作为主要氮源，糖液作为主要碳源，工艺简单，操作方便；通过调控碳源和氮源比例(c/n)将发酵分成菌体生长和快速产酸两个阶段。发酵第一阶段，以未过滤液化液作为培养基，氮源浓度高，c/n低。菌体在营养物质丰富、ph下降缓慢的条件下快速生长，并分泌大量糖化酶，促使淀粉质原料能快速转化成可被利用的葡萄糖。发酵第二阶段，加入糖液，提供大量碳源，c/n迅速升高。高活力的菌体快速进入产酸阶段，并且在糖化酶的作用下，提高淀粉质原料的利用率，不仅可降低发酵残糖，提高糖酸转化率，还会减轻柠檬酸提取工段除杂的负荷；并且发酵周期缩短、强度增加。
本发明将糖液在发酵一定时间后再加入，改变了传统工艺中先投料后接种的方式，节省了糖液投料等辅助时间，平均每罐节省2h。
本发明在发酵第一阶段给菌体提供继续生长的时间，种子罐培养时间则可以大幅度缩短。种子培养时间缩短后，种子液ph相对更高，接种后更有利于快速恢复生长。另外，由于发酵第一阶段培养基组分与种子培养基相同，菌体适应性更好。相比传统工艺，本发明工艺中种子培养时间平均缩短7h，总生产周期节省13h，将大幅提高设备利用率，提高发酵产能。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
以下实施例和对比例所涉及原料和试剂均为市售商品；黑曲霉菌种来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)，保藏编号cicc40021。总糖、还原糖测定均采用菲林滴定法，氮源测定采用凯氏定氮法，柠檬酸测定采用0.1429mol/l的naoh滴定，孢子计数采用血球计数板。如无特殊说明，均采用本领域常用设备和工艺方法。
实施例1
将玉米进行粉碎后，过60目筛；所得玉米粉与自来水按1:3的质量比混合均匀，用ca(oh)2将粉浆ph调至6.0，按25u/g玉米粉的添加量加入α—高温淀粉酶；所得粉浆先经过97℃喷射，保温1.5h后再经过127℃喷射，经过闪蒸将料液温度降至95℃，保温1h，碘试呈浅棕色后得到合格玉米液化液。将玉米液化液经过板框过滤去掉滤渣，得到糖液。
500l种子罐内加入200l玉米液化液和100l自来水作为种子培养基。取黑曲霉麸曲孢子，加入无菌水，制成孢子悬液，转接至种子罐内培养16h，得到种子液。
发酵第一阶段，在5000l发酵罐内加入400l玉米液化液，c/n控制在25，将温度降至35℃后，将300l种子液转至发酵罐内培养8h；发酵第二阶段，将糖液在罐外先经过螺旋板式换热器降温，温度达到35℃后，加入发酵罐内，2h内完成补加，糖液体积3200l，将c/n控制在85，还原糖低于5g/l停止发酵，得到柠檬酸发酵液。
实施例2
玉米液化液和糖液制备方法与实施例1相同，主要考察种子培养和两阶段发酵的效果。
500l种子罐内加入250l玉米液化液和150l自来水作为种子培养基。取黑曲霉麸曲孢子，加入无菌水，制成孢子悬液，转接至种子罐内培养24h，得到种子液。
发酵第一阶段，在5000l发酵罐内加入600l玉米液化液，c/n控制在15，将温度降至39℃后，将400l种子液转至发酵罐内培养2h；发酵第二阶段，将糖液在罐外先经过板式换热器降温，温度达到39℃后，加入发酵罐内，12h内完成补加，糖液体积3000l，将c/n控制在55，还原糖低于5g/l停止发酵，得到柠檬酸发酵液。
实施例3
玉米液化液和糖液制备方法与实施例1相同，主要考察种子培养和两阶段发酵的效果。
500l种子罐内加入225l玉米液化液和125l自来水作为种子培养基。取黑曲霉麸曲孢子，加入无菌水，制成孢子悬液，转接至种子罐内培养20h，得到种子液。
发酵第一阶段，在5000l发酵罐内加入500l玉米液化液，c/n控制在20，将温度降至37℃后，将350l种子液转至发酵罐内培养6h；发酵第二阶段，将糖液在罐外先经过板式换热器降温，温度达到37℃后，加入发酵罐内，6h内完成补加，糖液体积3100l，将c/n控制在70，还原糖低于5g/l停止发酵，得到柠檬酸发酵液。
实施例4
玉米液化液和糖液制备方法与实施例1相同，主要考察种子培养和两阶段发酵的效果。
500l种子罐内加入230l玉米液化液和120l自来水作为种子培养基。取黑曲霉麸曲孢子，加入无菌水，制成孢子悬液，转接至种子罐内培养20h，得到种子液。
发酵第一阶段，在5000l发酵罐内加入600l玉米液化液，c/n控制在20，将温度降至37℃后，将350l种子液转至发酵罐内培养6h；发酵第二阶段，将糖液在罐外先经过板式换热器降温，温度达到37℃后，加入发酵罐内，6h内完成补加，糖液体积3100l，将c/n控制在65，还原糖低于5g/l停止发酵，得到柠檬酸发酵液。
对比例1
玉米液化液和糖液制备方法与实施例1相同，主要考察种子培养和发酵的效果。
500l种子罐内加入225l玉米液化液和125l自来水作为种子培养基。取黑曲霉麸曲孢子，加入无菌水，制成孢子悬液，转接至种子罐内培养27h，得到种子液。
在5000l发酵罐内加入500l玉米液化液和3100l糖液，90℃灭菌30min后，将温度降至37℃，将350l种子液转至发酵罐内培养，还原糖低于5g/l停止发酵，得到柠檬酸发酵液。
实施例1～4与对比例1中菌体活力、生产时间、发酵结果等比较分别如表1、2、3所示。
表1
由表1中实施例1～4与对比例1中菌体活力比较可知，以糖化酶活力和产酸速率表征菌体活力，在实施例两阶段发酵过程中菌体活力提升幅度较大，菌体能分泌更多的糖化酶；同时产酸速率具有明显的优势。
表2
由表2中实施例1～4与对比例1的生产周期比较可知，实施例中种子培养培养时间平均缩短7h；辅助时间缩短2h，主要是节省了糖液投料时间和加热冷却时间；发酵周期平均缩短4h；总生产周期平均节省13h。
表3
由表3中实施例1～4与对比例1的发酵结果比较可知，在相近发酵浓度下，实施例平均转化率提高幅度较大，从96.8％提高至98.5％；发酵残总糖下降明显，从24g/l下降至20g/l，下降幅度达到16.7％；实施例平均发酵强度达到2.80gl-1h-1，相对对比例提高8.6％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。