一种滇黄精多糖的提取纯化方法与流程

本发明涉及提纯
技术领域：
，具体涉及一种滇黄精多糖的提取纯化方法。
背景技术：
：滇黄精polygonatumkingianumcoll.ethemsl为百合科黄精属多年生草本植物，以根茎入药，是我国常用的传统中药，被历版中国药典收载。具有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效。用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳等症。其主产于云南，习称“大黄精”，质量较佳，是云南重要的道地药材。滇黄精主要成分为黄精多糖、皂甙、黄酮、维生素、微量元素等。现代植物化学和药理实验证明，滇黄精多糖是滇黄精中的主要活性成分之一，具有各种重要生物活性，例如免疫调节，抗氧化，抗糖尿病，抗动脉粥样硬化等作用。多糖又称多聚糖，是由糖苷键线性或分枝连接而成的链状聚合物。水提醇沉后的多糖通常还会含有较多的杂质，如蛋白质，色素，小分子物质等。目前，脱蛋白的方法主要有蛋白酶解法、sevage法、三氯乙酸法等，操作复杂且使用有机溶剂；植物多糖除色素的方法有活性碳脱色、纤维素阴离子交换树脂脱色等，大多对多糖有破坏作用；常用除小分子方法有超滤、凝胶过滤等，成本高且重复性低。因此，滇黄精多糖高效提取，以及提纯方法的改进和创新是目前亟需解决的问题。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种滇黄精多糖的提取纯化方法，能最有效的提取滇黄精中的多糖，且能更彻底地除去多糖中的色素、蛋白质、小分子类物质等杂质，不会破坏多糖的结构，并且减少了有机试剂的用量，提高了多糖纯度，是滇黄精多糖提纯方法上的创新。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种滇黄精多糖的提取纯化方法，包括如下步骤：s1、精确称取干燥的滇黄精药材粗粉适量，按m(药材)∶m(95％乙醇)＝1∶2进行回流脱脂2h，过滤得渣，挥干溶剂，备用；s2、将脱脂后的滇黄精粉末按液料比10∶1加入适量水，浸提3次，每次提40分钟，合并滤液，60℃减压浓缩至1∶1.5(原药材量∶药液量)，加入加入体积分数为95％的乙醇，搅拌均匀后，以乙醇终浓度70％在室温下进行醇沉，24小时后收集沉淀；将醇沉后的上清液减压浓缩到原药材重量的1.0倍体积，再加入95％的乙醇，以乙醇终浓度70％在室温下再进行醇沉24小时，收集沉淀；合并沉淀部分，冷冻干燥，得滇黄精粗多糖；s3、将所得的滇黄精粗多糖配成0.3g～0.5g/ml的溶液后上d-101大孔树脂脱色素，每次上样量为27g(大孔树脂量g∶上样量g＝30∶1)；蒸馏水洗脱，洗脱流速为2ml/min，洗脱至无糖，苯酚-硫酸比色成阴性；收集洗脱液浓缩，加95％乙醇使溶液乙醇浓度达到70％，醇沉24小时，收集沉淀，干燥得滇黄精粗多糖；s4、采用等点电法除去所得的滇黄精粗多糖中的蛋白；s5、将脱蛋白后的粗多糖溶液置于透析袋中，再将透析袋置于加满水的玻璃容器中，放置于磁力搅拌器上，用蒸馏水透析4次，每12h换一次水，最后将袋内液体浓缩然后加95％乙醇使溶液乙醇浓度达到70％以达到多糖析出的目的，静置，4000rpm离心15min，弃上清，沉淀减压干燥后即得滇黄精多糖。优选地，所述步骤s3中d-101大孔树脂的柱子内径为4.8cm×50cm(1bv＝543ml)，优选地，所述步骤s4具体包括如下步骤：准确称取一定量去色素后的滇黄精粗多糖溶于蒸馏水中，配置成5mg/ml的粗多糖溶液，加6mol/l盐酸调节ph值至2，放置24小时，离心，去除沉淀，取上清液。优选地，所述步骤s5中的透析袋的截留分子量为3500d，使用前，需先剪成15cm/每段，然后置于沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净；使用时先将一端夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，装液时要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中透析的小分子量较大时袋外的水和缓冲液过量，从而进入袋内将袋涨破。本发明具有以下有益效果：本发明对滇黄精多糖的提取方法进行了研究，以多糖提取率为指标，通过正交试验设计，并利用方差分法对实验结果进行分析，使得优化提取方法更接近实际、更具可行性。能最有效的提取滇黄精中的多糖，且能更彻底地除去多糖中的色素、蛋白质、小分子类物质等杂质，不会破坏多糖的结构，纯化全过程无需使用有机溶剂，纯化后多糖纯度达90％以上，大大提高了经济效益。附图说明图1为本发明实施例中各ph值多糖损失率图。图2为本发明实施例中除蛋白后的多糖uv图。具体实施方式为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实验例步骤一、滇黄精多糖的脱脂处理精确称取干燥的滇黄精药材粗粉适量，按m(药材)∶m(95％乙醇)＝1∶2进行回流脱脂2h，过滤得渣，挥干溶剂，备用。步骤二、滇黄精多糖提取的正交试验选择煎煮时间、液料比(所用水与药材的质量比)、煎煮次数为考察因素，进行l9(34)的正交试验，各因素的水平设计如表1。表1正交设计的因素和水平精密称取脱脂后的滇黄精粗多糖9份，每份10g，分别按l9(34)表中给出的条件进行提取，合并滤液，滤液60℃减压浓缩至1∶1.5(原药材量∶药液量)，加入95％的乙醇，搅拌均匀，以乙醇终浓度70％在室温下进行醇沉，24小时后收集沉淀；醇沉后的上清液减压浓缩到原药材重量的1.0倍体积，再加入95％的乙醇，以乙醇终浓度70％在室温下再进行醇沉24小时，收集沉淀；合并沉淀部分，冷冻干燥得滇黄精粗多糖。用紫外分光光度计在波长487nm处测定各样品吸光度值(a)，根据标准曲线y＝28.94x+0.07计算滇黄精多糖的含量。以多糖提取率(多糖提取率＝滇黄精粗多糖干膏重量×干膏中多糖的纯度/原生药材重量×100％)为指标，进行正交和方差分析结果分别见表2和表3。由r值可知，以提取率为指标，各因素主次关系为b＞c＞a。通过方差分析可知，3个因素中，b具有显著影响(p＜0.10)，其他因素均不具有显著性影响。正交试验分析得出滇黄精多糖提取的最佳组合为a3b3c3，即提取时间为40min，液料比为15∶1，提取次数3次。但是我们可以从结果中看出，液料比在10∶1的基础上再加大时，多糖的提取率增高不明显，反而加入大量的水，浓缩较麻烦。所以最终确定最佳提取工艺为：提取时间为40min，液料比为10∶1，提取次数3次。表2提取工艺正交试验结果编号煎煮时间液料比煎煮次数空白提取率(％)1212314.552223120.693321316.294313217.145111111.906122216.127332119.628231217.109133316.70k114.9114.5315.1017.40/k217.4517.7016.7616.79/k317.6817.8118.1815.85/r2.783.283.081.56/表3提取工艺正交试验的方差分析结果方差来源偏差平方和自由度f值显著性p值a(时间)14.21728.858＞0.10b(液料比)20.79729.858＜0.10c(次数)14.26227.577＞0.10空白(误差)3.68721.428/步骤三、滇黄精多糖纯化上d-101大孔树脂脱色素柱子内径为4.8cm×50cm(1bv＝543ml)，每次上样量为27g(大孔树脂量g∶上样量g＝30∶1)。蒸馏水洗脱，洗脱流速为2ml/min，洗脱至无糖，苯酚-硫酸比色成阴性。收集洗脱液浓缩，加95％乙醇使溶液乙醇浓度达到70％，醇沉24小时，收集沉淀，干燥得滇黄精多糖。测得多糖纯度为60％。等电点法除蛋白准确称取一定量去色素后的滇黄精粗多糖溶于蒸馏水中，配置成5mg/ml的粗多糖溶液。取样品溶液50ml共5份分别置于烧杯中，加6mol/l盐酸调节ph值至2、2.5、3、3.5、4，放置24小时，离心，去除沉淀，取上清液。测定上清液中多糖含量，并在260～280nm波长处扫描是否含有蛋白质。1～5号经处理后的样品均可清楚地看到蛋白质沉淀。各样品处理后的多糖损失率【多糖损失率％＝(原始溶液中多糖含量-脱蛋白处理后溶液中多糖的含量)/原始溶液中多糖含量×100％】见图1，从图中可看出当ph值为2时多糖损失率最低，且该样品溶液在260nm和280nm处没吸收峰，见图2，说明该多糖溶液中已不含蛋白质。因此，确定多糖溶液ph值为2作为最佳脱蛋白条件。透析去小分子将透析袋(截留分子量3500d)剪成15cm/每段，至沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。使用时先将一端夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，装液时要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中透析的小分子量较大时袋外的水和缓冲液过量，从而进入袋内将袋涨破。脱蛋白后的粗多糖溶液置于透析袋中，再将透析袋置于加满水的玻璃容器中，放置于磁力搅拌器上，用蒸馏水透析4次，每12h换一次水，最后将袋内液体浓缩然后加95％乙醇使溶液乙醇浓度达到70％以达到多糖析出的目的，静置，离心(4000rpm×15min)，弃上清，沉淀减压干燥后即得滇黄精多糖。经测定该滇黄精多糖纯度为93％。实施例1s1、取过3号筛的滇黄精粉末200g，加入400g95％乙醇进行回流脱脂2h，过滤得渣，挥干溶剂，备用。s2、将脱脂后的滇黄精粉末按液料比10∶1加入适量水，提取3次，每次提40分钟。合并滤液，60℃减压浓缩至1∶1.5(原药材量∶药液量)，加入95％的乙醇，搅拌均匀，以乙醇终浓度70％在室温下进行醇沉，24小时后收集沉淀；醇沉后的上清液减压浓缩到原药材重量的1.0倍体积，再加入95％的乙醇，以乙醇终浓度70％在室温下再进行醇沉24小时，收集沉淀；合并沉淀部分，冷冻干燥得滇黄精粗多糖31.26g。s3、将将上述制得的滇黄精粗多糖配成0.3～0.5g/ml的溶液后上d-101大孔树脂脱色素，每次上样量为27g(大孔树脂量g∶上样量g＝30∶1)；蒸馏水洗脱，洗脱流速为2ml/min，洗脱至无糖，苯酚-硫酸比色成阴性；收集洗脱液浓缩，加95％乙醇使溶液乙醇浓度达到70％，醇沉24小时，收集沉淀，干燥得滇黄精粗多糖；s4、采用等点电法除去所得的滇黄精粗多糖中的蛋白；s5、将脱蛋白后的粗多糖溶液置于透析袋中，再将透析袋置于加满水的玻璃容器中，放置于磁力搅拌器上，用蒸馏水透析4次，每12h换一次水，最后将袋内液体浓缩然后加95％乙醇使溶液乙醇浓度达到70％以达到多糖析出的目的，静置，4000rpm离心15min，弃上清，沉淀冷冻干燥，即得纯化后滇黄精多糖25.18g，得率为80.56％，纯度为93.54％。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12