一种用于高表达单克隆抗体的培养基的制作方法

本发明属于细胞培养领域，具体地说，涉及一种用于高表达单克隆抗体的培养基。

背景技术：

近年来制药工业领域在以酶、抗体和细胞因子(例如促红细胞生成素、干扰素、纤溶酶原激活物等)为基础的产品方面取得巨大成功。全世界对蛋白质治疗药物的需求逐年增加。治疗性单克隆抗体(mabs,monoclonalantibodies)在蛋白质治疗药物中是重要一类。它们被称为单克隆抗体，因为相对于多克隆抗体，它们是由衍生自单个抗体形成细胞的免疫细胞(细胞克隆)分泌的。单克隆抗体的特征在于它们每个仅直接对抗免疫原性物质的一个表位，从而仅对抗一个抗原决定簇，并且因此在治疗疾病中可以非常特异地应用。

中国仓鼠卵巢细胞--cho细胞(chinesehamsterovarycell)目前被广泛用于生产单克隆抗体产品。适合用于cho细胞培养的培养基，根据它的来源及成分的明确程度来划分，其发展大致可分为三个阶段：即天然培养基阶段(直接采用某些组织凝块、生物性液体和组织提取液等作为细胞的培养基)，合成培养基阶段(如mem，dmem，rpmi1640，f12等)和无血清培养基阶段。合成培养基通常需在其中添加一些诸如血清(常用的如小牛血清、胎牛血清等，一般在5-15％)等天然的体液性补充物才能较长时间地维持细胞生长，但是血清可能造成在培养过程中贴壁而不适用于大规模培养的问题。无血清培养基的优势很大程度上体现在避免了血清的缺点，此外它还具有血清培养难以比拟的优点，如保存和应用方便；使用该种培养基制备的产品易于纯化，提高回收率；成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；可根据不同细胞株设计和优化出适合其高密度生长或高水平目的产物表达的培养基等。

市售可得的可用于大规模cho细胞培养的无血清培养基包括excell325^pf等，然而其在使用过程中存在着细胞密度和蛋白表达量低等问题。因此，有必要开发一种用于高表达单克隆抗体的细胞培养基，以便最大限度地提高生产效率，降低生产成本。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于高表达单克隆抗体的培养基。

为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种用于高表达单克隆抗体的培养基，包括基础培养基和添加物，所述添加物包括：

根据本发明的一个优选实施例，所述添加物包括：

根据本发明的一个优选实施例，所述添加物包括：

根据本发明的一个优选实施例，所述添加物包括：

根据本发明的一个优选实施例，所述基础培养基为dmem/f12。

根据本发明的一个优选实施例，所述单克隆抗体的生产细胞为cho细胞。

根据本发明的一个优选实施例，所述单克隆抗体为抗egfr单克隆抗体。

有益效果：本发明以dmem/f12商业培养基作为基础培养基并进行优化，发现使用优化后的培养基培养表达抗egfr单克隆抗体的生产菌株，能够显著提高生产时的细胞密度以及抗egfr单克隆抗体的表达量，从而能够提高生产效率，降低生产成本，具有广泛的工业应用前景。

附图说明

图1为细胞密度检测结果图。

图2为目的产物抗egfr单克隆抗体表达量检测结果图。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明，下述实施例不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和单克隆抗体筛选及纯化的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括sambrook,j.,fritsch,e.f.andmaniais,t.(1989)molecularcloning：alaboratorymanual,2^ndedition,coldspringharborlaboratorypress.

在本发明的下述实施例中，使用的培养基为在基础培养基dmem/f12(购自sigma公司)中加入：

在本发明的下列实施例中，示例性地选用表达抗egfr单克隆抗体(c225)的cho细胞株(按中国发明专利申请cn201010148069.0实施例中公开的方法获得)作为生产用细胞株。

实施例1、培养基的制备

在基础培养基dmem/f12的基础上，按表1的配方添加额外的组分并分别制备培养基。

表1、培养基配方

实施例2、菌株培养和检测

2.1、培养

将表达抗egfr单克隆抗体(c225)的cho细胞株分别接种到培养基1、培养基2和培养基3中培养，培养方法和参数如下：用上述配制好的培养基在摇瓶中扩增表达抗egfr单克隆抗体(c225)的cho细胞株，培养条件：37℃，5％co2，120rpm，每日取样，检测细胞密度，根据需要添加新鲜培养液或转移至合适体积的摇瓶，维持细胞密度在1×10⁶/ml左右；细胞悬液体积扩增至3l时，转入b.braunbiostatb5l生物反应器中，连续灌注法培养，控制参数：温度37℃，ph6.9，搅拌150rpm，po250％，每日取样，检测细胞密度及残糖浓度，根据需要调节循环速度，维持残糖浓度在150mg/dl左右；当活细胞率低于60％时，结束培养，收获培养上清，检测目的蛋白表达量。

同时，以市售的无血清培养基excell325^pf(购自jrh公司)按上述方法培养表达抗egfr单克隆抗体(c225)的cho细胞株，作为对照。

2.2、检测

细胞密度的检测结果如图1所示，与市售的无血清培养基excell325^pf相比，使用本发明的培养基在5l生物反应器中经过8天生产培养后，表达抗egfr单克隆抗体(c225)的cho细胞的细胞密度达到6×10⁶细胞/ml以上，并在经过12天生产培养后仍能维持5×10⁶细胞/ml以上。

抗egfr单克隆抗体的表达量检测结果如图2所示，与市售的无血清培养基excell325^pf相比，使用本发明的培养基经过12天生产培养后，目的产物抗egfr单克隆抗体(c225)的产量达到500mg/l以上，达到对照(320mg/l)的至少1.5倍以上。

以上结果说明使用本发明所提供的培养基培养表达单克隆抗体的cho细胞菌株，能够显著提高生产时的细胞密度以及单克隆抗体的表达量。