本发明涉及一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用,属于基因工程领域。
背景技术:
糖尿病是一种患病率很高的代谢紊乱疾病,目前超过4亿人受到糖尿病的困扰,而这一人数还在持续增加。(2s,3r,4s)-4-羟基异亮氨酸(4-hil)是一种天然的非蛋白氨基酸,具有促进胰岛素分泌,降低肝脏、肌肉、脂肪等外周组织对胰岛素的抵抗,调节血脂异常等生理功能,在治理糖尿病及其并发症方面有良好的应用前景。目前4-hil的主要制备方法是从葫芦巴种子中提取,但是产量很低,难以满足市场需求。于是从2002年开始,人们不断寻找化学-酶法合成4-hil的方法,但是由于步骤太长、得率较低、纯度较低而没有深入下去。α-酮戊二酸依赖性异亮氨酸双加氧酶能够催化l-异亮氨酸的c4位发生羟基化反应,生成4-hil。利用异亮氨酸双加氧酶通过微生物发酵法合成4-hil是到目前为止发现的最简单、有效和经济的方法。
利用基因工程技术过量表达异亮氨酸双加氧酶编码基因,从而提高4-hil产量的研究已有相关报道。在这个研究领域中,主要是将来源于苏云金芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶编码基因btido导入到大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌中使其高效表达,利用工程菌表达出的异亮氨酸双加氧酶将l-异亮氨酸转变成4-hil,从而生产出4-hil。但是在大肠杆菌工程菌中需要加入大量比较昂贵的l-异亮氨酸作为底物,而在谷氨酸棒杆菌工程菌中则是利用菌体自身合成的l-异亮氨酸作为底物,因此采用谷氨酸棒杆菌工程菌生产4-hil更为经济、有效。
谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种sn01(保藏编号为:cctccno:m2014410,记载和公布于applmicrobiolbiotechnol,2015,99(9):3851-3863)是一株l-异亮氨酸生产菌,在该菌株中克隆、表达btido基因后,可以将其自身积累的l-异亮氨酸转化成4-hil,从而实现4-hil的一步从头合成,无需添加l-异亮氨酸等前体物质,具有明显的技术优势(shif,niutf,fanghm(2015)4-hydroxyisoleucineproductionofrecombinantcorynebacteriumglutamicumssp.lactofermentumunderoptimalcornsteepliquorlimitation.applmicrobiolbiotechnol,99(9):3851-3863)。但是相对来说4-hil产量还是比较低。因此,如何提高4-hil的产量仍然是一个重要的技术问题。
技术实现要素:
本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌,表达苏云金芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因、韦氏芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因和谷氨酸棒杆菌来源的苹果酸脱氢酶基因。
在本发明的一种实施方式中,所述苏云金芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因btido含有seqidno.1所示的序列。
在本发明的一种实施方式中,所述韦氏芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因bwido含有seqidno.2所示的序列。
在本发明的一种实施方式中,所述苹果酸脱氢酶基因mqo含有seqidno.3所示的序列。
在本发明的一种实施方式中,所述基因工程菌敲除了异柠檬酸裂解酶的编码基因acea,所述基因acea含有seqidno.4所示的序列。
在本发明的一种实施方式中,所述基因通过大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体表达。
在本发明的一种实施方式中,所述大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体为pjyw-5,其构建方法公开于公开号为cn103834679b的专利中。
在本发明的一种实施方式中,所述基因工程菌以谷氨酸棒杆菌为宿主。
在本发明的一种实施方式中,所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种(c.glutamicumssp.lactofermentum)sn01,保藏编号为:cctccno:m2014410,已公布于applmicrobiolbiotechnol,2015,99(9):3851-3863的论文中。
本发明的第二个目的是提供构建所述基因工程菌的方法,所述方法是将苏云金芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因、谷氨酸棒杆菌来源的苹果酸脱氢酶和韦氏芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因依次连接在大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体上,转化至宿主细胞中。
在本发明的一种实施方式中,所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种sn01细胞。
本发明的第三个目的是提供一种生产4-羟基异亮氨酸的方法,所述方法以上述基因工程菌为发酵微生物,一步发酵法制备4-羟基异亮氨酸。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中,于29-31℃发酵120-144h。
在本发明的一种实施方式中,所述培养基中含有fe2+、mg2+和nh4+。
在本发明的一种实施方式中,所述培养基中fe2+的浓度为5.5~7.2mm,所述mg2+的浓度为6.2~8.3mm,所述nh4+的浓度为151~227mm。
本发明还要求保护所述基因工程菌在制备4-羟基异亮氨酸或其衍生物方面的应用。
有益效果:本发明提供了bwido(seqidno.2所示)基因的新用途,将其与不同物种来源的异亮氨酸双加氧酶编码基因btido(seqidno.1所示)在l-异亮氨酸生产菌中共表达,提高异亮氨酸双加氧酶的酶活,促进菌体自身积累的l-异亮氨酸更快地发生4-羟化反应,生成更多的4-羟基异亮氨酸。并通过过表达mqo基因并敲除acea基因,使4-hil的产量提高至91.56mm(13.46g/l),l-异亮氨酸向4-hil的转化率为86%。本发明还通过发酵培养基优化,在摇瓶水平上使基因工程菌的4-hil产量提高至111.11mm(16.33g/l),比优化前提高了21.3%,l-异亮氨酸仅剩余2.17mm,l-异亮氨酸向4-hil的转化率达到98%。
具体实施方式
4-hil与l-异亮氨酸的检测方法:氨基酸产量用hplc衍生化法测定:样品经过5%的三氯乙酸稀释50倍后放置沉淀4h,12000r/min离心20min,上清用滤膜过滤后用hplc测样。测定试剂为流动相水相buffera(1l):醋酸钠3.01g,三乙胺200μl,四氢呋喃5ml,用10%醋酸调ph至7.2;有机相bufferb(1l):醋酸钠3.01g溶解后用10%醋酸调ph至7.2,加入400ml乙腈和400ml甲醇。梯度洗脱条件为:0min8%bufferb,20min60%bufferb,25min100%bufferb,28.5min8%bufferb,色谱柱温为40℃,流速为0.8ml/min。异亮氨酸双加氧酶的酶活检测方法:取5ml发酵液,4℃、4000rpm离心10min,弃上清收集菌体。加入20mlph6.0的pbs,悬浮菌体,4℃、4000rpm离心10min,弃上清收集菌体,重复上述步骤一遍。用20mlpbs重悬细胞,加入50mg/l溶菌酶1ml,颠倒混匀,37℃静置1h。用超声破碎仪破碎细胞30min,悬浊液加入直接用于酶活测定,在30℃反应1h。酶促反应体系:30mmol/lile、30mmol/lα-kg、5mmol/l抗坏血酸、1mmol/l七水合硫酸亚铁、100mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ph6.0)。
实施例1构建表达苏云金芽孢杆菌来源btido的菌株
采用化学全合成法合成seqidno.1所示的异亮氨酸双加氧酶编码基因btido。构建包含btido并由强启动子ptacm控制其表达的重组表达载体pjyw-5-btido,其中,表达载体pjyw-5已公开于公开号为cn103834679b的专利中。将重组质粒转化到l-异亮氨酸生产菌sn01(已公布于applmicrobiolbiotechnol,2015,99(9):3851-3863的论文中)中,获得重组工程菌株sn02。
将菌株sn02按终od562为1.8的接种量接种至发酵培养基中,其中,发酵培养基成分为:葡萄糖140g/l,(nh4)2so420g/l,玉米浆10g/l,kh2po41g/l,mgso40.5g/l,feso40.5g/l,caco320g/l,ph7.2。,于30℃发酵144h,对发酵产物进行检测,结果显示,发酵获得4-hil的产量为58.43mm(8.59g/l),4-hil和l-异亮氨酸的总量为67.82mm。
将sn01菌株在相同条件下培养,结果显示,l-异亮氨酸的产量为90mm。
实施例2构建表达韦氏芽孢杆菌来源bwido的菌株
采用化学全合成法合成seqidno.2所示的异亮氨酸双加氧酶编码基因bwido。构建包含bwido并由强启动子ptacm控制其表达的重组表达载体pjyw-5-bwido,将重组质粒转化到谷氨酸棒杆菌sn01中,获得重组工程菌株sz01。
按实施例1相同的发酵条件进行发酵,结果显示,相同发酵时间下,sz01发酵合成4-hil的产量为38.42mm(5.65g/l),4-hil和l-异亮氨酸的总量为78.45mm。
实施例3构建共表达btido与mqo并敲除acea的菌株
将seqidno.1所示的btido与seqidno.3所示的mqo与质粒pjyw-5连接,得到重组质粒pjyw-5-btido-mqo。将acea的上游同源臂片段、带loxp位点的卡那霉素抗性基因、acea的下游同源臂片段依次与载体pbluescript连接,构建敲除质粒pbs-acea。将敲除质粒pbs-acea转化到谷氨酸棒状杆菌sn01中,完成acea基因敲除。再将质粒pdtw109转入敲除acea的谷氨酸棒状杆菌sn01,去除遗留在基因组上的卡那霉素抗性基因片段。基因敲除方法与pdtw109质粒序列已公开于公开号为cn103409446a的专利中。将重组质粒pjyw-5-btido-mqo转化到敲除acea的谷氨酸棒杆菌sn01中,获得菌株sz03。
将菌株sz03按照实施例1的方法进行发酵,结果显示,在相同的发酵时间下,4-hil产量为38.16mm(5.61g/l),4-hil和l-异亮氨酸的总量为110.30mm,总量比sn01和sz01分别提高了62.6%和40.6%。
实施例4双ido表达菌株的构建
在实施例3构建的重组质粒pjyw-5-btido-mqo上共表达bwido,并在bwido序列前添加强启动子ptacm,构建双ido表达质粒pjyw-5-btido-mqo-bwido,其核苷酸序列如seqidno.5所示。由于韦氏芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶基因bwido与苏云金芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶基因btido的一致性为70%左右,二者连接在一起表达易发生同源重组而导致基因丢失,因此,需按照btido-mqo-bwido的顺序依次连接;将重组质粒转化到敲除acea的谷氨酸棒杆菌sn01中,构建重组工程菌株sz04。
将菌株sz04按照实施例1的方法进行发酵,结果显示,在相同的发酵时间下,菌株sz04发酵后合成出91.56mm4-hil(13.46g/l),与sz03相比,产量提高了139.9%,异亮氨酸双加氧酶的酶活则由0.05-0.10u/gdcw提高至0.18-0.26u/gdcw;sz04剩余14.72mml-异亮氨酸,l-异亮氨酸向4-hil的转化率为86%。
实施例5发酵培养基的优化
发酵培养基的组成为:
(1)在实施例1的培养基基础上,分别向培养基中分别添加浓度为1.5~2.5g/l七水合硫酸亚铁、0.5~1.0g/l硫酸镁和20~30g/l硫酸铵,正交实验结果如表1所示;
表1不同发酵培养基下的4-hil产量
(2)根据步骤(1)所得结果,通过正交设计助手分析,得出最优解。向发酵培养基中加入1.5g/l七水合硫酸亚铁、0.75g/l硫酸镁和30g/l硫酸铵,按照实施例4相同的条件接种sz04进行发酵,结果显示,发酵相同时间下,4-hil产量提高至111.11mm(16.33g/l),比优化前提高了21.3%,l-异亮氨酸仅剩余2.17mm,l-异亮氨酸向4-hil的转化率达到98%。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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