发酵法生产酪氨酸的大肠杆菌及其构建方法与应用与流程

文档序号：18008770发布日期：2019-06-25 23:43阅读：1990来源：国知局

本发明属于生物技术领域，具体涉及到生产酪氨酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

芳香族氨基酸(aromaticaminoacids)作为芳香族化学品的重要前体物质，拥有着可观的工业价值，通过对不同芳香族氨基酸的衍生转化，可以合成很多不同应用前景的芳香族化学品。酪氨酸作为一种芳香族氨基酸，有着广泛的应用。

酪氨酸(l-tyrosine)一方面自身能被用作食品添加剂，文献报道指出酪氨酸能够提高大脑活性从而改善记忆力，同时能够控制食欲来控制焦躁和抑郁等。除此之外，对于患有苯丙酮尿症的患者，由于这类病人缺少将苯丙氨酸转化为酪氨酸的酶，因此酪氨酸是他们必须的饮食补充成分。另一方面，酪氨酸也是一些高附加值化合物的重要前体物质。例如，酪氨酸是合成左旋多巴(l-dopa)的前体，左旋多巴如今是治疗帕金森疾病的最有效的药物。同时，酪氨酸也是一系列工业相关的化合物的前体。酪氨酸通过单个酶的反应就可以转化为黑色素(melanin)，黑色素的物理化学性质使其能够作为紫外线吸收剂，阳离子交换器，药物载体以及非晶半导体。除此之外，酪氨酸还能转化为对羟基肉桂酸(p-hydroxycinnamicacid)和对羟基苯乙烯(p-hydroxystyrene)，这两种物质都是一系列新奇的复合体，涂层，粘合剂，药物分子，化妆品的重要组成成分。

目前酪氨酸的制备方法主要有化学法生产、生物酶催化以及生物发酵。在微生物发酵生产大宗化学品兴起之前，传统的氨基酸的生产主要是酸碱水解来降解一些富含蛋白类的物质，例如酪蛋白，小麦和玉米麸质等。对于酪氨酸的生产，一般是通过水解小麦和玉米麸质，酪氨酸和亮氨酸以及小部分胱氨酸的粗提物被分离出来。但是由于这三种氨基酸在水中，酸溶液和碱溶液中都有着相似的溶解度性质，因此，将这三种氨基酸分离开是比较困难的。同时，化学过程繁杂，产物的转化率较低，存在成本高、环境污染严重等问题。所以开发新的合成方法和思路是今后研究的重点和方向。

生物酶催化法主要是使用酪氨酸酚解酶(tyrosinephenollyase，tpl)(ec4.1.99.2)，该酶是需要磷酸吡哆醛的酶。由于其能够转化苯酚，丙酮酸，氨等底物合成酪氨酸，引起了较大的关注。酶催化体系必须提供过量的底物来促进反应的进行。但丙酮酸浓度过高会对酪氨酸酚解酶的酶活有抑制作用，因此在生产过程中必须添加多种底物来维持较低的丙酮酸浓度。除此之外，由于苯酚会破坏细胞壁，使蛋白变性。为了防止酶催化剂被抑制和破坏，苯酚也要保持在一个最低浓度。近些年来，为了改善酶催化效率，也对酪氨酸酚解酶进行了新的研究。例如使用固定化酶和细胞进行催化，开发底物谱更为广泛的新酶等。但生物酶法由于需要相对昂贵的原料，反应条件及工艺较为复杂，生产成本还是偏高，难以适应工业化生产应用。

生物发酵法就以低成本的葡萄糖等为原料，通过微生物菌种发酵生产酪氨酸。seong等在大肠杆菌中以葡萄糖为原料，可以使酪氨酸的产量达到3.0g/l。他们首先通过在转录水平和翻译水平上对相关基因进行调控，从而优化酪氨酸合成途径；之后对磷酸烯醇式丙酮酸合酶的表达水平进行控制，从而重新平衡碳代谢流；最后优化培养条件使酪氨酸高产。(kimsc,minbe,hwanghg,etal.pathwayoptimizationbyre-designofuntranslatedregionsforl-tyrosineproductioninescherichiacoli[j].scirep,2015,5(1):13853.)。dokyun等利用合成srna的策略对大肠杆菌进行代谢工程改造进而提高酪氨酸产量，利用2l发酵罐进行高密度发酵，酪氨酸的产量可以到达21.9g/l。(na,dokyun,etal."metabolicengineeringofescherichiacoliusingsyntheticsmallregulatoryrnas."naturebiotechnology31.2(2013):170-174.)。ranjan等以一株高产苯丙氨酸的菌株为出发菌株进行改造，通过优化发酵条件，利用200l的发酵罐，发酵48h酪氨酸的产量可以达到55g/l，是目前报道的最高产量(patnaik,ranjan,etal."l‐tyrosineproductionbyrecombinantescherichiacoli:fermentationoptimizationandrecovery."biotechnologyandbioengineering99.4(2008):741-752.)。上述研究构建的大肠杆菌工程菌株虽然可以生产高浓度的酪氨酸，但是相关的工程菌株或者含有重组质粒造成遗传不稳定，或者需要在培养基中添加有机氮源或芳香族氨基酸及其衍生物以促进细胞生长，从而影响产业应用。目前要实现有竞争力的生物发酵法生产酪氨酸，关键是构建出高效生产酪氨酸的菌种。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的是提供一株生产酪氨酸的大肠杆菌、菌株的构建方法及其应用。

第一，本发明提供了一株生产酪氨酸的大肠杆菌重组菌株tyr002，其通过上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroe)的表达而增强3-脱氢莽草酸脱氢酶酶活。

优选地，其通过调控元件p2或p3或p4替换调控元件p1(p1位于aroe起始密码子上游，其序列如seqidno:1所示)和/或将aroe起始密码子ttg替换为密码子atg而上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroe)的表达。

优选地，所述调控元件为p4。

优选地，其通过上调产3-脱氢莽草酸菌株或可改造为产3-脱氢莽草酸的菌株中3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroe)的表达而增强3-脱氢莽草酸脱氢酶酶活；

优选地，所述产3-脱氢莽草酸菌株为wj004、wj006、wj012、wj038、wj048、wj060；优选地，所述产3-脱氢莽草酸菌株为wj060。

第二，本发明提供了一种重组菌株tyr002的构建方法，包括如下步骤：

在产3-脱氢莽草酸菌株或可改造为产3-脱氢莽草酸的菌株中，采用同源重组方法，通过调控元件p2或p3或p4替换调控元件p1(p1位于aroe起始密码子上游，其序列如seqidno:1所示)和/或将aroe起始密码子ttg替换为密码子atg；

优选地，所述调控元件为p4；

优选地，所述产3-脱氢莽草酸菌株为wj004、wj006、wj012、wj038、wj048、wj060；优选地，所述产3-脱氢莽草酸菌株为wj060，所述wj060重组菌株的保藏编号为cgmccno.14602。

第三，本发明提供了一种生产酪氨酸的大肠杆菌重组菌株tyr012，其通过降低或解除tyr002重组菌中预苯酸脱氢酶的代谢产物反馈抑制并提高该酶的活性而得到。

优选地，其通过将预苯酸脱氢酶编码基因序列替换为如seqidno:8所示序列以降低或解除预苯酸脱氢酶的代谢产物反馈抑制，通过在预苯酸脱氢酶编码基因起始密码子atg上游插入合成调控元件p4以提高该酶活性。

第四，本发明提供了一种重组菌株tyr012的构建方法，包括如下步骤：

以重组菌株tyr002为出发菌株，采用同源重组方法，将预苯酸脱氢酶编码基因序列替换为如seqidno:8所示序列和/或在预苯酸脱氢酶编码基因起始密码子atg上游插入合成调控元件p4。

第五，本发明提供了一种生产酪氨酸的大肠杆菌重组菌株tyr024，其通过抑制tyr012重组菌中邻氨基苯甲酸合酶和/或抑制预苯酸脱水酶的活性而得到。

优选地，其通过在邻氨基苯甲酸合酶编码基因的起始密码子atg上游插入合成调控元件p5和/或将邻氨基苯甲酸合酶编码基因的起始密码子atg替换为密码子ttg或gtg以抑制邻氨基苯甲酸合酶的活性；通过将预苯酸脱水酶基因进行敲除以抑制预苯酸脱水酶的活性。

第六，本发明提供了一种重组菌株tyr024的构建方法，包括如下步骤：

以重组菌株tyr012为出发菌株，采用同源重组方法，在邻氨基苯甲酸合酶编码基因的起始密码子atg上游插入合成调控元件p5和/或将邻氨基苯甲酸合酶编码基因的起始密码子atg替换为密码子ttg或gtg和将预苯酸脱水酶编码基因敲除。

第七，本发明提供了一种生产酪氨酸的大肠杆菌重组菌株tyr042，其通过同时提高tyr024重组菌中莽草酸激酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、分支酸合酶、酪氨酸转氨酶的活性而得到。

优选地，其通过在莽草酸激酶编码基因的起始密码子atg上游插入合成调控元件p4以提高莽草酸激酶的活性；通过在5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶编码基因的起始密码子atg上游插入合成调控元件p4以提高5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶活性；通过在分支酸合酶编码基因的起始密码子atg上游插入合成调控元件p4以提高分支酸合酶的活性；通过在酪氨酸转氨酶编码基因的起始密码子atg上游插入合成调控元件p4以提高酪氨酸转氨酶的活性。

第八，本发明提供了一种重组菌株tyr042的构建方法，包括如下步骤：

以重组菌株tyr024为出发菌株，采用同源重组方法，在莽草酸激酶编码基因的起始密码子atg上游插入合成调控元件p4和在5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶编码基因的起始密码子atg上游插入合成调控元件p4和在分支酸合酶编码基因的起始密码子atg上游插入合成调控元件p4和在酪氨酸转氨酶编码基因的起始密码子atg上游插入合成调控元件p4。

第九，本发明提供了上述重组菌株tyr002、tyr012、tyr024、tyr042在生产酪氨酸中的应用。

第十，本发明提供了利用上述重组菌株tyr002、tyr012、tyr024、tyr042发酵生产酪氨酸的方法。

发酵的温度为25℃-42℃或25℃或30℃或37℃或40℃或42℃；

发酵的体系的ph值为6.0-8.0或6.0或7.0或8.0；

发酵的时间为24小时-96小时或24小时或36小时或48小时或60小时或72小时或84小时或96小时；

发酵的接种量的体积百分比0.05％-15％或0.05％或2％或5％或10％或15％；

发酵的培养基有一些成分组成：

大量元素：葡萄糖、酵母提取物、柠檬酸、kh2po4、(nh4)2so4、mgso4·7h2o、l-phenylalanine；

微量元素：feso4·7h2o、mnso4·h2o、na2so4、znso4、cocl2·6h2o

cuso4·5h2o；

以上成分在所述发酵培养基中的浓度分别为：

大量元素：起始葡萄糖20g/l-50g/l或20g/l或30g/l或40g/l或50g/l(发酵开始后，待发酵罐中葡萄糖浓度降低到1g/l以下时，开始用浓度为500g/l-600g/l的葡萄糖溶液开始补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度小于1g/l)、酵母提取物0-2g/l或0g/l或0.5g/l或1g/l或2g/l、柠檬酸1g/l-5g/l或g/l或2g/l或3g/l或5g/l、kh2po42.5g/l-10g/l或2.5g/l或5g/l或7.5g/l或10g/l、(nh4)2so40.8g/l-2.4g/l或0.8g/l或1.2g/l或1.6g/l或2.0g/l或2.4g/l、mgso4·7h2o1g/l-4g/l或1g/l或2g/l或3g/l或4g/l、l-phenylalanine0.7-2.8g/l或0.7g/l或1.4g/l或2.8g/l；

微量元素：feso4·7h2o50mg/l-100mg/l或50mg/l或75mg/l或100mg/l、mnso4·h2o2.5mg/l-7.5mg/l或2.5mg/l或5mg/l或7.5mg/l、na2so410mg/l-50mg/l或10mg/l或20mg/l或30mg/l或40mg/l或50mg/l、znso42mg/l-10mg/l或2mg/l或4mg/l或6mg/l或8mg/l或10mg/l、cocl2·6h2o1mg/l-6mg/l或1mg/l或2mg/l或4mg/l或6mg/l、cuso4·5h2o0.2mg/l-1mg/l或0.2mg/l或0.4mg/l或0.6mg/l或0.8mg/l或1mg/l；

本发明所构建的大肠杆菌tyr042在好氧条件下，利用无机盐培养基，37℃发酵不超过40小时，得到的发酵液中酪氨酸的含量可达45g/l，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1大肠杆菌中酪氨酸的生物合成途径(glucose：葡萄糖；e4p:赤藓糖-4-磷酸；pep:磷酸烯醇式丙酮酸；pyr：丙酮酸；dahp:3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸；dhs:3-脱氢莽草酸；shk：莽草酸；s3p：莽草酸-3-磷酸；epsp：5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸；cha：分支酸；hpp：羟基苯丙酮酸；l-trp：色氨酸；l-phe：苯丙氨酸；l-tyrosine：酪氨酸；pykaf:丙酮酸激酶；tkta:转酮醇酶；galp：半乳糖mfs转运蛋白；glk：葡萄糖激酶；ptsi：磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶i；pgi：葡萄糖-6-磷酸异构酶；arof:3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶；aroe:3-脱氢莽草酸脱氢酶；arokl:莽草酸激酶；aroa:5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶；aroc:分支酸合酶；trpe:邻氨基苯甲酸合酶；phea:预苯酸脱水酶；tyra:预苯酸脱氢酶；tyrb:酪氨酸转氨酶)

图2含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb的质粒peasy-cat-sacb

图3含3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因arof的质粒peasy-arof(或peasy-arof*，其中arof基因第443位的碱基c被改为t)

图4野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj004、wj006、wj012、wj038、wj048和wj060摇瓶生产酪氨酸上游代谢产物3-脱氢莽草酸的比较

图5野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj060、tyr002、tyr012、tyr024和tyr042摇瓶生产酪氨酸的比较

图6基因工程大肠杆菌tyr042的5l发酵罐补料发酵生产酪氨酸

具体实施方式

以下为列举的实施例，以便于更好地理解本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、大肠杆菌基因工程菌wj004的构建

大肠杆菌基因工程菌wj004是通过对3-脱氢酶莽草酸脱氢酶基因(aroe)进行弱化表达调控构建获得，是通过两次同源重组的方法，在aroe起始密码子上游插入合成调控元件p1(见序列表中序列1)，并且用稀有起始密码子ttg替换原始起始密码子atg。具体的构建步骤如下：

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物aroe1-up/aroe1-down扩增第一步同源重组的片段aroe1。引物序列为：

aroe1-up：gatgccctgacgggtgaactgtttcgacaggggtaacatagtgacggaagatcacttc

aroe1-down：ctgtgggctatcggattaccaaaaacagcataggtttccaatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系：5×transstart^tmfastpfubuffer10μl、dntps(2.5mmol/l每个dntp)4μl、dna模板1μl(20-50ng)、正向引物(10μmol/l)2μl、反向引物(10μmol/l)2μl、100％dmso1μl、transstart^tmfastpfudnapolymerase(2.5u/μl)1μl、去离子水29μl，总体积50μl。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aroe1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是aroe起始密码子上游40个碱基和aroe起始密码子开始的40个碱基。获得的aroe1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌dsm1576后进行同源重组，实现在aroe起始密码子前插入cat-sacb盒(公众可以从中国科学院天津工业生物技术研究所获得大肠杆菌dsm1576和pkd46，记载过大肠杆菌dsm1576的非专利文献是gunsalusic,handdb.theuseofbacteriainthechemicaldeterminationoftotalvitaminc.jbiolchem1941,141:853-858；记载过pkd46质粒的非专利文献是datsenkoka,wannerbl.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.procnatlacadsciusa.2000,97(12):6640-6645)。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌dsm1576，然后将aroe1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌dsm1576。电转条件为：首先准备含有pkd46的大肠杆菌dsm1576的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50-100ngaroe1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的bio-rad电转杯。使用micropulser(bio-rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mllb液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15ml试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μl孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的lb固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取5-10个单菌落进行菌落pcr扩增及dna测序验证。pcr扩增及dna测序引物为：

2-aroe-1-up：ttcagaaatccgcgatgccctga

2-aroe-t-down：cagttgcataccattcacgagag

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌aroe1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p1(见序列表序列1)dna为模板，使用引物aroe-p1-s/aroe-p1t-a扩增第二步同源重组的片段aroe2。引物序列为：

aroe-p1-s：gatgccctgacgggtgaactgtttcgacaggggtaacatattatctctggcggtgttg

aroe-p1t-a：ctgtgggctatcggattaccaaaaacagcataggtttccatagctgtttcctggtttaaac

扩增体系及条件与上述一致。扩增后的aroe2产物包含合成调控元件p1以及两端分别是aroe起始密码子上游40个碱基和aroe起始密码子开始的40个碱基。获得的aroe2这个扩增产物导入大肠杆菌aroe1后进行第二步同源重组，实现在aroe起始密码子前合成调控元件p1并且，并且起始密码子的a被替换成t。

第二步同源重组是将aroe2片段电转至大肠杆菌aroe1。电转条件为：首先准备大肠杆菌aroe1的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50-100ngaroe2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的bio-rad电转杯。使用micropulser(bio-rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mllb液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15ml试管中，放置在37℃、200rpm转速的摇床中孵育2小时，去掉pkd46质粒。取300μl孵育后的菌液转接到30ml含10％蔗糖、没有氯化钠的lb液体培养基中37℃，250rpm过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的lb平板，37℃培养长出菌落。挑取10-20个左右单菌落进行菌落pcr扩增及dna测序验证。pcr扩增及dna测序引物为：

w-promoter-s：ttatctctggcggtgttg

2-aroe-t-down：cagttgcataccattcacgagag

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌wj004，用于酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例2、大肠杆菌基因工程菌wj006的构建

大肠杆菌基因工程菌wj006是在大肠杆菌wj004基础上，通过对3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因(arof)突变与表达调控构建获得，是通过两次同源重组的方法，在以第443位的碱基c改为t的突变基因arof*(见序列表中序列5)替换原始的arof基因(见序列表中序列6)，以解除该基因编码的3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的酪氨酸反馈抑制，并且在起始密码子上游插入合成调控元件p2(见序列表中序列2)。具体的构建步骤如下：

以大肠杆菌dsm1576基因组dna为模板，使用引物arof-f/arof-r扩增arof基因。引物序列为：

arof-f：atgcaaaaagacgcgctgaa

arof-r：ttaagccacgcgagccgtcag

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的arof基因片段克隆peasy-blunt克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)上，得到重组质粒peasy-arof(图3)。然后以peasy-arof为模板，使用引物arof-fm/arof-rm反向扩增，引物序列为：

arof-fm：ggcgacggaagcgttagatctgaatagcccgcaatacctggg

arof-rm：agtggcagtcccatattcaccagctcaagc

扩增体系及条件如实施例1中所述。反向扩增获得dna片段自连后形成重组质粒peasy-arof*。该质粒上arof基因的利用overlapextensionpcr得到的含有点突变序列的aroffbr基因替换原始的arof基因第443位的碱基c被改为t。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物arof1-up/arof1-down扩增第一步同源重组的片段arof1。引物序列为：

arof1-up：ggatcaactatcgcaaacgagcataaacaggatcgccatcgtgacggaagatcacttc

arof1-down：atcgcgtaatgcggtcaattcagcaaccataataaacctcatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的arof1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是arof起始密码子上游40个碱基和arof终止密码子下游40个碱基。获得的arof1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌wj004后进行同源重组，实现在arof基因片段被cat-sacb盒替换。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌wj004，然后将arof1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌wj004。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

arof-1-up：tatcgttacgtcatcctcgctg

arof-t-down：cataaataggcagtccaaagcggc

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌arof1(含pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以上述构建的peasy-arof*质粒dna为模板，使用引物arof2-up/arof2-down扩增第二步同源重组的片段arof2。引物序列为：

arof2-up：ggatcaactatcgcaaacgagcataaacaggatcgccatcgatgcaaaaagacgcgctgaataac

arof2-down：atcgcgtaatgcggtcaattcagcaaccataataaacctcttaagccacgcgagccgtcagc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的arof2产物包含合arof*(见序列表中序列5)以及两端分别是arof起始密码子上游40个碱基和arof终止密码子下游40个碱基。获得的arof2这个扩增产物导入大肠杆菌arof1后进行第二步同源重组，实现在arof*替换原始的arof。

第二步同源重组是将arof2片段电转至大肠杆菌arof1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

arof-1-up：tatcgttacgtcatcctcgctg

arof-t-down：cataaataggcagtccaaagcggc

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌arof2(含pkd46)，作为下一步在arof*起始密码子前插入合成调控元件p2的出发菌。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物arof1-up/arof3-down扩增第一步同源重组的片段arof1。引物序列为：

arof1-up：ggatcaactatcgcaaacgagcataaacaggatcgccatcgtgacggaagatcacttc

arof3-down：cgtcggtaatatgtacgttattcagcgcgtctttttgcatatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的arof3产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是arof起始密码子上游40个碱基和arof起始密码子开始的40个碱基。获得的arof3这个扩增产物导入大肠杆菌arof2后进行同源重组，实现在arof*起始密码子前插入cat-sacb盒。将arof3片段电转至大肠杆菌arof2。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

arof-1-up：tatcgttacgtcatcctcgctg

arof-t-down：cataaataggcagtccaaagcggc

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌arof3(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p2(见序列表序列2)dna为模板，使用引物aroe-p1-s/aroe-p1t-a扩增第二步同源重组的片段aroe2。引物序列为：

arof-p2-up：ggatcaactatcgcaaacgagcataaacaggatcgccatcttatctctggcggtgttgac

arof-p2-down：cgtcggtaatatgtacgttattcagcgcgtctttttgcatagctgtttcctggtttaaac

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的arof4产物包含合成调控元件p2以及两端分别是arof起始密码子上游40个碱基和arof起始密码子开始的40个碱基。获得的arof4这个扩增产物导入大肠杆菌arof3后进行第二步同源重组，实现在arof起始密码子前合成调控元件p2。

第二步同源重组是将arof4片段电转至大肠杆菌arof3。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

w-promoter-s：ttatctctggcggtgttg

arof-t-down：cataaataggcagtccaaagcggc

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌wj006，用于酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例3、大肠杆菌基因工程菌wj012的构建

大肠杆菌基因工程菌wj012是在大肠杆菌wj006基础上，通过对转酮醇酶基因(tkta)进行表达调控构建获得，是通过两次同源重组的方法，在tkta起始密码子上游插入合成调控元件p4(见序列表中序列4)。具体的构建步骤如下：

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物tkta1-up/tkta1-down扩增第一步同源重组的片段tkta1。引物序列为：

tkta1-up：gcccaaaacgcgctgtcgtcaagtcgttaagggcgtgcccttcatcatgtgacggaagatcacttc

tkta1-down：catgctcagcgcacgaatagcattggcaagctctttacgtgaggacatatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的tkta1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是tkta起始密码子上游40个碱基和tkta起始密码子开始的40个碱基。获得的tkta1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌wj006后进行同源重组，实现在tkta起始密码子前插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌wj006，然后将tkta1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌wj006。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

tkta-1-up：acatgcgagcatgatccag

tkta-t-down：cgcaaacggacatatcaag

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌tkta1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p4(见序列表序列4)dna为模板，使用引物tkta-p4-up/tkta-p4-down扩增第二步同源重组的片段tkta2。引物序列为：

tkta-p4-up：gcccaaaac-gcgctgtcgtcaagtcgttaagggcgtgcccttcatcatttatctctggcggtgttg

tkta-p4-down：catgctcagcgcacgaatagcattggcaagctctttacgtgag-gacatagctgtttcctggtttaa

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的tkta2产物包含合成调控元件p4以及两端分别是tkta起始密码子上游40个碱基和tkta起始密码子开始的40个碱基。获得的tkta2这个扩增产物导入大肠杆菌aroe1后进行第二步同源重组，实现在tkta起始密码子前合成调控元件p4。

第二步同源重组是将tkta2片段电转至大肠杆菌aroe1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

w-promoter-s：ttatctctggcggtgttg

tkta-t-down：cgcaaacggacatatcaag

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌wj012，用于酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例4、大肠杆菌基因工程菌wj038的构建

大肠杆菌基因工程菌wj038是在大肠杆菌wj012基础上，通过对葡萄糖转移相关的半乳糖mfs转运蛋白基因(galp)和葡萄糖激酶基因(glk)进行组合表达调控，并且无痕敲除磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶(phosphoenolpyruvatesugarphosphotransferasesystem,ptssystem)的酶i基因(ptsi)所构建获得，是通过同源重组的方法，在galp起始密码子上游插入合成调控元件p1(见序列表中序列1)、在glk起始密码子上游插入合成调控元件p4(见序列表中序列4)以及无痕敲除ptsi。具体的构建步骤如下：

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物galp1-up/galp1-down扩增第一步同源重组的片段tkta1。引物序列为：

galp1-up：gtactcacctatcttaattcacaataaaaaataaccatatgtgacggaagatcacttc

galp1-down：ttgccttgtttgaccgcccctgttttttagcgtcaggcatatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的galp1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是galp起始密码子上游40个碱基和galp起始密码子开始的40个碱基。获得的galp1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌wj012后进行同源重组，实现在galp起始密码子前插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌wj012，然后将galp1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌wj012。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

galp-1-up：cgtcgtactcacctatct

galp-t-down：ccccacatttgctcggta

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌galp1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p1(见序列表序列1)dna为模板，使用引物galp-p1-up/galp-p1-down扩增第二步同源重组的片段galp2。引物序列为：

galp-p1-up：gtactcacctatcttaattcacaataaaaaataaccatatttatctctggcggtgttg

galp-p1-down：ttgccttgtttgaccgcccctgttttttagcgtcaggcatagctgtttcctggtttaa

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的galp2产物包含合成调控元件p1以及两端分别是galp起始密码子上游40个碱基和galp起始密码子开始的40个碱基。获得的galp2这个扩增产物导入大肠杆菌galp1后进行第二步同源重组，实现在galp起始密码子前合成调控元件p1。

第二步同源重组是将galp2片段电转至大肠杆菌galp1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

w-promoter-s：ttatctctggcggtgttg

galp-t-down：ccccacatttgctcggta

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌galp2(含有pkd46)，作为下一步glk改造的出发菌。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物glk1-up/glk1-down扩增第一步同源重组的片段tkta1。引物序列为：

glk1-up：cccaggtatttacagtgtgagaaagaattattttgactttgtgacggaagatcacttc

glk1-down：tggtgccgcccacatcaccgactaatgcatactttgtcatatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的glk1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是glk起始密码子上游40个碱基和glk起始密码子开始的40个碱基。获得的glk1这个扩增产物导入大肠杆菌galp2后进行同源重组，实现在glk起始密码子前插入cat-sacb盒。将glk1片段电转至大肠杆菌galp2。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

glk-1-up：atttacagggagcctgcc

glk-t-down：agattgagcgccagattg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌glk1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p4(见序列表序列4)dna为模板，使用引物glk-p4-up/glk-p4-down扩增第二步同源重组的片段glk2。引物序列为：

glk-p4-up：cccaggtatttacagtgtgagaaagaattattttgactttttatctctggcggtgttg

glk-p4-down：tggtgccgcccacatcaccgactaatgcatactttgtcatagctgtttcctggtttaa

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的glk2产物包含合成调控元件p4以及两端分别是glk起始密码子上游40个碱基和glk起始密码子开始的40个碱基。获得的glk2这个扩增产物导入大肠杆菌glk1后进行第二步同源重组，实现在glk起始密码子前合成调控元件p4。

第二步同源重组是将glk2片段电转至大肠杆菌glk1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

w-promoter-s：ttatctctggcggtgttg

glk-t-down：agattgagcgccagattg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌glk2(含有pkd46)，作为下一步无痕敲除ptsi的出发菌。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物ptsi1-up/ptsi1-down扩增第一步同源重组的片段tkta1。引物序列为：

ptsi1-up：ccgggttcttttaaaaatcagtcacaagtaaggtagggttgtgacggaagatcacttc

ptsi1-down：gatcttctcctaagcagtaaattgggccgcatctcgtggaatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的ptsi1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是ptsi起始密码子上游40个碱基和ptsi终止密码子下游的40个碱基。获得的ptsi1这个扩增产物导入大肠杆菌glk2后进行同源重组，实现用cat-sacb盒替换ptsi基因。将ptsi1片段电转至大肠杆菌glk2。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

ptsi-1-up：agcggttgaacatctggt

ptsi-t-down：cttgtcgtcggaaaccag

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌ptsi1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

用人工合成的dna片段ptsi2(见序列表序列8)作为第二步同源重组的片段。第二步同源重组是将ptsi2片段电转至大肠杆菌ptsi1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

ptsi-f：tggcattgattcagcctg

ptsi-r：tcactgcggcaagaatta

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌wj038，用于酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例5、大肠杆菌基因工程菌wj048的构建

大肠杆菌基因工程菌wj048是在大肠杆菌wj038基础上，通过对丙酮酸激酶基因(pyka)进行弱化表达调控构建获得，是通过两次同源重组的方法，在pyka起始密码子上游插入合成调控元件p1(见序列表中序列1)，并且用稀有起始密码子ttg替换原始起始密码子atg。具体的构建步骤如下：

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物pyka1-up/pyka1-down扩增第一步同源重组的片段pyka1。引物序列为：

pyka1-up：cattcggatttcatgttcaagcaacacctggttgtttcaggtgacggaagatcacttc

pyka1-down：aacgtggtaacgatttttgttctgcgaagccttctggacaatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的pyka1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是pyka起始密码子上游40个碱基和pyka起始密码子开始的40个碱基。获得的pyka1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌wj038后进行同源重组，实现在pyka起始密码子前插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌wj038，然后将aroe1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌wj038。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

pyka-1-up：accaggtgttgcttgaacatg

pyka-t-down：atgtggcgttttcgccgcatc

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌pyka1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p1(见序列表序列1)dna为模板，使用引物pyka-p1-s/pyka-p1t-a扩增第二步同源重组的片段aroe2。引物序列为：

pyka-p1-s：cattcggatttcatgttcaagcaacacctggttgtttcagttatctctggcggtgttg

pyka-p1t-a：aacgtggtaacgatttttgttctgcgaagccttctggacatagctgtttcctggtttaaac

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的pyka2产物包含合成调控元件p1以及两端分别是pyka起始密码子上游40个碱基和pyka起始密码子开始的40个碱基。获得的pyka2这个扩增产物导入大肠杆菌pyka1后进行第二步同源重组，实现在pyka起始密码子前合成调控元件p1并且，并且起始密码子的a被替换成t。

第二步同源重组是将pyka2片段电转至大肠杆菌pyka1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

w-promoter-s：ttatctctggcggtgttg

pyka-t-down：atgtggcgttttcgccgcatc

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌wj048，用于酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例6、大肠杆菌基因工程菌wj060的构建

大肠杆菌基因工程菌wj060是在大肠杆菌wj048基础上，通过对磷酸葡萄糖异构酶基因(pgi)进行弱化表达调控构建获得，是通过两次同源重组的方法，在pgi起始密码子上游插入合成调控元件p1(见序列表中序列1)，并且用稀有起始密码子ttg替换原始起始密码子atg。具体的构建步骤如下：

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物pgi1-up/pgi1-down扩增第一步同源重组的片段pgi1。引物序列为：

pgi1-up：actggcgctacaatcttccaaagtcacaattctcaaaatcgtgacggaagatcacttc

pgi1-down：gcctgccaggcagcggtctgcgttggattgatgtttttcaatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的pgi1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是pgi起始密码子上游40个碱基和pgi起始密码子开始的40个碱基。获得的pgi1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌wj048后进行同源重组，实现在pgi起始密码子前插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌wj048，然后将pgi1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌wj048。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

pgi-1-up：cgctacaatcttccaaagtcac

pgi-t-down：cggcatcaggcatgaacgatg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌pgi1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p1(见序列表序列1)dna为模板，使用引物pgi-p1-s/pgi-p1t-a扩增第二步同源重组的片段pgi2。引物序列为：

pgi-p1-s：actggcgc-tac-aatcttccaaagtcacaattctcaaaatcttatctctggcggtgttg

pgi-p1t-a：gcctgccaggcagcggtctgcgtt-ggattgatgtttttcatagctgtttcctggtttaaac

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的pgi2产物包含合成调控元件p1以及两端分别是pgi起始密码子上游40个碱基和pgi起始密码子开始的40个碱基。获得的pgi2这个扩增产物导入大肠杆菌pgi1后进行第二步同源重组，实现在pgi起始密码子前合成调控元件p1并且，并且起始密码子的a被替换成t。

第二步同源重组是将pgi2片段电转至大肠杆菌pgi1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

w-promoter-s：ttatctctggcggtgttg

pgi-t-down：cggcatcaggcatgaacgatg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌wj060，用于酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸生产测试。

该基因工程大肠杆菌wj060已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为cgmccno.14602,保藏日期为2017年9月11日，分类命名为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)。

实施例7、大肠杆菌基因工程菌tyr002的构建

大肠杆菌基因工程菌tyr002是通过对3-脱氢酶莽草酸脱氢酶基因(aroe)进行表达调控构建获得，是通过两次同源重组的方法，是aroe起始密码子上游插入的合成调控元件p1(见序列表中序列1)替换为合成调控元件p4(见序列表中序列4)，并且把稀有起始密码子ttg替换为原始起始密码子atg。具体的构建步骤如下：

aroe1-up：gatgccctgacgggtgaactgtttcgacaggggtaacatagtgacggaagatcacttc

aroe1-down：ctgtgggctatcggattaccaaaaacagcataggtttccaatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的aroe1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是aroe起始密码子上游40个碱基和aroe起始密码子开始的40个碱基。获得的aroe1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌wj060后进行同源重组，实现在aroe起始密码子前插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌wj060，然后将aroe1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌wj060。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

2-aroe-1-up：ttcagaaatccgcgatgccctga

2-aroe-t-down：cagttgcataccattcacgagag

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌aroe11(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p4(见序列表序列1)dna为模板，使用引物aroe-p4-s/aroe-p4a-a扩增第二步同源重组的片段aroe22。引物序列为：

aroe-p4-s：gatgccctgacgggtgaactgtttcgacaggggtaacatatatctctggcggtgttg

aroe-p4a-a：ctgtgggctatcggattaccaaaaacagcataggtttccatagctgtttcctggtttaaac

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的aroe22产物包含合成调控元件p4以及两端分别是aroe起始密码子上游40个碱基和aroe起始密码子开始的40个碱基。获得的aroe22这个扩增产物导入大肠杆菌aroe11后进行第二步同源重组，实现在aroe起始密码子前插入合成调控元件p4并且，并且起始密码子的t被替换成a。

第二步同源重组是将aroe22片段电转至大肠杆菌aroe11。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

w-promoter-s：ttatctctggcggtgttg

2-aroe-t-down：cagttgcataccattcacgagag

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌tyr002，用于酪氨酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例8、大肠杆菌基因工程菌tyr012的构建

大肠杆菌基因工程菌tyr012是在大肠杆菌tyr002基础上，通过对预苯酸脱氢酶基因(tyra)突变与表达调控构建获得，是通过两次同源重组的方法，在以第159位的碱基g改为a，第1061位的碱基c改为t的突变基因tyra*(见序列表中序列8)替换原始的tyra基因(见序列表中序列9)，以解除该基因编码的预苯酸脱氢酶的酪氨酸反馈抑制，并且在起始密码子上游插入合成调控元件p4(见序列表中序列4)。具体的构建步骤如下：

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物tyra-cat-sacb-f/tyra-cat-down-r扩增第一步同源重组的片段tyra1。引物序列为：

tyra-cat-sacb-f：tcaggatctgaacgggcagctgacggctcgcgtggcttaagtgacggaagatcacttc

tyra-cat-down-r：cattcgcctgacgcaataacacgcggctttcactctgaaaatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的tyra1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是tyra起始密码子上游40个碱基和tyra基因第1068位下游40个碱基。获得的tyra1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌tyr002后进行同源重组，实现在tyra基因部分片段被cat-sacb盒替换。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌tyr002，然后将tyra1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌tyr002。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-tyra-f：aaagagatggaacaggcggg

e-tyra-r：cccgttcaatgaaggtattg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌tyra1(含pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以大肠杆菌dsm1576基因组dna为模板，使用引物tyra-fbr-f/tyra-fbr-r扩增tyra基因。引物序列为：

tyra-fbr-f：gagcgcgaggcatctatattggcctcgcggcgcgcaga

tyra-fbr-r：cattcgcctgacgcaataacacgcggctttcactctgaaaacgctgtacgtaatcgccg

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的tyra2产物是含有点突变序列的tyra^fbr基因替换原始的tyra基因，第159位的碱基g改为a，第1061位的碱基c改为t。

以人工合成的调控元件p4(见序列表序列4)dna为模板，使用引物tyra-p4-f/tyra-p4-r扩增片段tyra3。引物序列为：

tyra-p4-f：tcaggatctgaacgggcagctgacggctcgcgtggcttaattatctctggcggtgttg

tyra-p4-r：gcggtcaattcagcaaccatagctgtttcctggtttaa

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的tyra3产物包含人工合成元件p4,同时前端是tyra起始密码子上游40个碱基。

以大肠杆菌dsm1576基因组dna为模板，使用引物tyra-93-down-f/tyra-fbr-up-r扩增片段tyra4。引物序列为：

tyra-93-down-f：ttaaaccaggaaacagctatggttgctgaattgaccgc

tyra-fbr-up-r：tctgcgcgccgcgaggccaatatagatgcctcgcgctc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的tyra4产物的两端分别是和能与tyra2，tyra3进行overlapextensionpcr,可以将含有人工合成元件p4的产物tyr3和含有突变基因tyra^fbr的产物tyra2通过overlapextensionpcr连接起来。

以pcr产物tyra2,tyra3,tyra4为模板，使用引物tyra-m1-93-f/tyra-fbr-r进行overlapextensionpcr扩增第二步同源重组的片段tyra5。引物序列为：

tyra-p4-f：tcaggatctgaacgggcagctgacggctcgcgtggcttaattatctctggcggtgttg

tyra-fbr-r：cattcgcctgacgcaataacacgcggctttcactctgaaaacgctgtacgtaatcgccg

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的tyra5产物包含人工合成元件p4，突变基因tyra^fbr,以及两端分别是tyra起始密码子上游40个碱基和tyra基因第1068位下游40个碱基。获得的tyra5这个扩增产物导入大肠杆菌tyra1后进行第二步同源重组，实现在tyra起始密码子前插入合成调控元件p4，同时用含有点突变序列的tyra^fbr基因替换原始的tyra基因，第159位的碱基g改为a，第1061位的碱基c改为t。

第二步同源重组是将tyra5片段电转至大肠杆菌tyra1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-tyra-f：aaagagatggaacaggcggg

e-tyra-r：cccgttcaatgaaggtattg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌tyr012，用于酪氨酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例9、大肠杆菌基因工程菌tyr024的构建

大肠杆菌基因工程菌tyr024是在大肠杆菌tyr012基础上，通过对邻氨基苯甲酸合酶基因trpe进行弱化表达调控，并且无痕敲除预苯酸脱水酶的基因phea所构建获得，是通过两次同源重组的方法，在trpe起始密码子上游插入合成调控元件p5(见序列表中序列5)，并且用稀有起始密码子ttg替换原始起始密码子atg以及无痕敲除ptsi。具体的构建步骤如下：

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物trpe-cat-sacb-f/trpe-cat-sacb-r扩增第一步同源重组的片段trpe1。引物序列为：

trpe-cat-sacb-f：cagcccgcctaatgagcgggcttttttttgaacaaattagtgacggaagatcacttc

trpe-cat-sacb-r：tcgcaggttagcagttcgagagtcggtttttgtgtttgcaatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的trpe1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是trpe起始密码子上游40个碱基和trpe起始密码子开始的40个碱基。获得的trpe1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌tyr012后进行同源重组，实现在trpe起始密码子前插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌tyr012，然后将trpe1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌tyr012。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-trpe-f：cagcccgacaatatgaattt

e-trpe-r：tcacctaaagctgtaatgcg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌trp1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p5(见序列表序列5)dna为模板，使用引物trpe-p5-f/trpe-p5-r扩增第二步同源重组的片段trpe2。引物序列为：

trpe-p5-f：cagcccgcctaatgagcgggcttttttttgaacaaaattactgatagctagctcagtc

trpe-p5-r：cgcaggttagcagttcgagagtcggtttttgtgtttgcaactagtaactcatgtctttg

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的trpe2产物包含合成调控元件p5以及两端分别是trpe起始密码子上游40个碱基和trpe起始密码子开始的40个碱基。获得的trpe2这个扩增产物导入大肠杆菌trpe1后进行第二步同源重组，实现在trpe起始密码子前合成调控元件p5,并且起始密码子的a被替换成t。

第二步同源重组是将trpe2片段电转至大肠杆菌trpe1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-trpe-f：cagcccgacaatatgaattt

e-trpe-r：tcacctaaagctgtaatgcg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌trpe2(含有pkd46)，作为下一步无痕敲除phea的出发菌。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物phea-cat-sacb-f/phea-cat-sacb-r扩增第一步同源重组的片段phea1。引物序列为：

phea-cat-sacb-f：aatcgggggccttttttattgataacaaaaaggcaacactgtgacggaagatcacttc

phea-cat-sacb-r：atccagtgccggatgattcacatcatccggcaccttttcaatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的phea1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是phea起始密码子上游40个碱基和phea终止密码子下游的40个碱基。获得的phea1这个扩增产物导入大肠杆菌trpe2后进行同源重组，实现用cat-sacb盒替换phea基因。将phea1片段电转至大肠杆菌trpe2。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-phea-f：tgatggacgtaagccggaag

e-phea-r：acatgtcgcagaccgtctc

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌phea1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

用人工合成的dna片段phea2(见序列表序列12)作为第二步同源重组的片段。第二步同源重组是将phea2片段电转至大肠杆菌phea1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-phea-f：tgatggacgtaagccggaag

e-phea-r：acatgtcgcagaccgtctc

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌tyr024，用于酪氨酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例10、大肠杆菌基因工程菌tyr042的构建

大肠杆菌基因工程菌tyr042是在大肠杆菌tyr024基础上，通过对莽草酸激酶基因arok,arol；5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因aroa；分支酸合酶基因aroc；酪氨酸转氨酶基因tyrb进行组合表达调控构建获得，是通过两次同源重组的方法，在aroa起始密码子上游插入合成调控元件p4(见序列表中序列4)；aroc起始密码子上游插入合成调控元件p4(见序列表中序列4)；arol起始密码子上游插入合成调控元件p4(见序列表中序列4)；arok起始密码子上游插入合成调控元件p4(见序列表中序列4)；tyrb起始密码子上游插入合成调控元件p4(见序列表中序列4)。具体的构建步骤如下：

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物aroa-cat-sacb-f/aroa-cat-sacb-r扩增第一步同源重组的片段aroa1。引物序列为：

aroa-cat-sacb-f：cccacagccagcctgtggggtttttatttctgttgtagaggtgacggaagatcacttc

aroa-cat-sacb-r：catcgacacgagcgatgggttgtaacgtcagggattccatatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的aroa1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是aroa起始密码子上游40个碱基和aroa起始密码子开始的40个碱基。获得的aroa1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌tyr024后进行同源重组，实现在aroa起始密码子前插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌tyr024，然后将aroa1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌tyr024。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-aroa-f：atgaacgtgccgttccag

e-aroa-r：ttctgcgtgtaatggacc

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌aroa1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p4(见序列表序列4)dna为模板，使用引物aroa-p4-f/aroa-p4-r扩增第二步同源重组的片段aroa2。引物序列为：

aroa-p4-f：cccacagccagcctgtggggtttttatttctgttgtagagttatctctggcggtgttg

aroa-p4-r：catcgacacgagcgatgggttgtaacgtcagggattccatagctgtttcctggtttaa

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的aroa2产物包含合成调控元件p4以及两端分别是aroa起始密码子上游40个碱基和aroa起始密码子开始的40个碱基。获得的aroa2这个扩增产物导入大肠杆菌aroa1后进行第二步同源重组，实现在aroa起始密码子前合成调控元件p4。

第二步同源重组是将aroa2片段电转至大肠杆菌aroa1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-aroa-f：atgaacgtgccgttccag

e-aroa-r：ttctgcgtgtaatggacc

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌aroa2(含有pkd46)，作为下一步aroc改造的出发菌。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物aroc-cat-sacb-f/aroc-cat-sacb-r扩增第一步同源重组的片段aroc1。引物序列为：

aroc-cat-sacb-f：gatttataaagattaagtaaacacgcaaacacaacaataagtgacggaagatcacttc

aroc-cat-sacb-r：tggttacgcgaaagagttgtccaattgtgtttccagccatatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的aroc1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是aroc起始密码子上游40个碱基和aroc起始密码子开始的40个碱基。获得的aroc1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌aroa2后进行同源重组，实现在aroc起始密码子前插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌aroa2，然后将aroc1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌aroa2。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-aroc-f：ccttgctgatgatggcgtg

e-aroc-r：taatcctgagaacgctgg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌aroc1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p4(见序列表序列4)dna为模板，使用引物aroc-p4-f/aroc-p4-r扩增第二步同源重组的片段aroc2。引物序列为：

aroc-p4-f：gatttataaagattaagtaaacacgcaaacacaacaataattatctctggcggtgttg

aroc-p4-r：tggttacgcgaaagagttgtccaattgtgtttccagccatagctgtttcctggtttaa

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的aroc2产物包含合成调控元件p4以及两端分别是aroc起始密码子上游40个碱基和aroc起始密码子开始的40个碱基。获得的aroc2这个扩增产物导入大肠杆菌aroc1后进行第二步同源重组，实现在aroc起始密码子前合成调控元件p4。

第二步同源重组是将aroc2片段电转至大肠杆菌aroc1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。挑取10-20个左右单菌落进行菌落pcr扩增及dna测序验证。pcr扩增及dna测序引物为：

e-aroc-f：ccttgctgatgatggcgtg

e-aroc-r：taatcctgagaacgctgg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌aroc2(含有pkd46)，作为下一步arol改造的出发菌。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物arol-cat-sacb-f/arol-cat-sacb-r扩增第一步同源重组的片段arol1。引物序列为：

arol-cat-sacb-f：ctcatgacaccggctttcgccgcattgcgacctattgggggtgacggaagatcacttc

arol-cat-sacb-r：cacagccccgaggcccgatcagaaaaagaggtgtgtcatatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的arol1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是arol起始密码子上游40个碱基和arol起始密码子开始的40个碱基。获得的arol1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌aroc2后进行同源重组，实现在arol起始密码子前插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌aroc2，然后将arol1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌aroc2。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-arol-f：cgcgatttattcgtacgc

e-arol-r：tagcgataacggtggatg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌arol1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p4(见序列表序列4)dna为模板，使用引物arol-p4-f/arol-p4-r扩增第二步同源重组的片段arol2。引物序列为：

arol-p4-f：ctcatgacaccggctttcgccgcattgcgacctattggggttatctctggcggtgttg

arol-p4-r：cacagccccgaggcccgatcagaaaaagaggttgtgtcatagctgtttcctggtttaa

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的arol2产物包含合成调控元件p4以及两端分别是arol起始密码子上游40个碱基和arol起始密码子开始的40个碱基。获得的arol2这个扩增产物导入大肠杆菌arol1后进行第二步同源重组，实现在arol起始密码子前合成调控元件p4。

第二步同源重组是将arol2片段电转至大肠杆菌arol1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-arol-f：cgcgatttattcgtacgc

e-arol-r：tagcgataacggtggatg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌arol2(含有pkd46)，作为下一步arok改造的出发菌。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物arok-cat-sacb-f/arok-cat-sacb-r扩增第一步同源重组的片段arok1。引物序列为：

arok-cat-sacb-f：tgagcgaagcgggtttatcattaacgaatagtcttagtaggtgacggaagatcacttc

arok-cat-sacb-r：ccataggcccaaccagaaagatattgcgtttctctgccatatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的arok1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是arok起始密码子上游40个碱基和arok起始密码子开始的40个碱基。获得的arok1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌arol2后进行同源重组，实现在arok起始密码子前插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌arol2，然后将arok1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌arol2。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-arok-f：tgagagttggtgctcttc

e-arok-r：agctccggttcgtttctc

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌arok1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p4(见序列表序列4)dna为模板，使用引物arok-p4-f/arok-p4-r扩增第二步同源重组的片段arok2。引物序列为：

arok-p4-f：tgagcgaagcgggtttatcattaacgaatagtcttagtagttatctctggcggtgttg

arok-p4-r：ccataggcccaaccagaaagatattgcgtttctctgccatagctgtttcctggtttaa

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的arok2产物包含合成调控元件p4以及两端分别是arok起始密码子上游40个碱基和arok起始密码子开始的40个碱基。获得的arok2这个扩增产物导入大肠杆菌arok1后进行第二步同源重组，实现在arok起始密码子前合成调控元件p4。

第二步同源重组是将arok2片段电转至大肠杆菌arok1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-arok-f：tgagagttggtgctcttc

e-arok-r：agctccggttcgtttctc

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌arok2(含有pkd46)，作为下一步tyrb改造的出发菌。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，见序列表中序列7)的质粒peasy-cat-sacb(图2)为模板，使用引物tyrb-cat-sacb-f/tyrb-cat-sacb-r扩增第一步同源重组的片段tyrb1。引物序列为：

tyrb-cat-sacb-f：ccggtttattgtgttttaaccacctgcccgtaaacctggagtgacggaagatcacttc

tyrb-cat-sacb-r：gaatcgggtcgccagcgtaggcgtcaactttttgaaacacatcaaagggaaaactgtcc

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的tyrb1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是tyrb起始密码子上游40个碱基和tyrb起始密码子开始的40个碱基。获得的tyrb1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌arok2后进行同源重组，实现在tyrb起始密码子前插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌arok2，然后将tyrb1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌arok2。电转条件及孵育和培养如实施例1中第一步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-tyrb-f：cggcgtgaatgccttatc

e-tyrb-r：gttaagcccttccatcgg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌tyrb1(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件p4(见序列表序列4)dna为模板，使用引物tyrb-p4-f/tyrb-p4-r扩增第二步同源重组的片段tyrb2。引物序列为：

tyrb-p4-f：ccggtttattgtgttttaaccacctgcccgtaaacctggattatctctggcggtgttg

tyrb-p4-r：gaatcgggtcgccagcgtaggcgtcaactttttgaaacacagctgtttcctggtttaa

扩增体系及条件如实施例1中所述。扩增后的tyrb2产物包含合成调控元件p4以及两端分别是tyrb起始密码子上游40个碱基和tyrb起始密码子开始的40个碱基。获得的tyrb2这个扩增产物导入大肠杆菌tyrb1后进行第二步同源重组，实现在tyrb起始密码子前合成调控元件p4。

第二步同源重组是将tyrb2片段电转至大肠杆菌tyrb1。电转条件及孵育和培养如实施例1中第二步同源重组所述。pcr扩增及dna测序引物为：

e-tyrb-f：cggcgtgaatgccttatc

e-tyrb-r：gttaagcccttccatcgg

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌tyr042，用于酪氨酸生产测试。

该菌株tyr042已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为cgmccno.14833，保藏日期为2017年10月25日，分类命名为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)。

实施例11、用野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj004、wj006、wj012、wj038、wj048和wj060摇瓶生产酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸

方法i

种子培养基为含0.5％葡萄糖的lb培养基，由以下成分组成：

葡萄糖5g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠(nacl)10g/l。

摇瓶发酵培养基为nbs培养基，由以下成分组成：

葡萄糖20g/l，kh2po43.5g/l，k2hpo4·3h2o6.5g/l，(nh4)2hpo43.5g/l，mgso40.120g/l，cacl211mg/l，thiaminehcl5mg/l，fecl3·6h2o0.16mg/l，cocl2·6h2o0.2mg/l，cuso4·5h2o0.015mg/l，na2moo4·2h2o0.02mg/l，zncl20.02mg/l，h3bo30.005mg/l。

野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj004、wj006、wj012、wj038、wj048和wj060摇瓶生产酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸，包括如下步骤：

(1)种子培养：15ml试管中种子培养基为3ml，121℃灭菌15分钟。冷却后分别将野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj004、wj006、wj012、wj038、wj048和wj060单菌落接种到3ml种子培养基，在30℃，250rpm摇床过夜培养16小时，用于摇瓶发酵培养基接种。

(2)摇瓶发酵培养：取200μl上述种子菌液，接种于含有10ml摇瓶发酵培养基的100ml灭菌锥形瓶中，起始葡萄糖浓度为20g/l，37℃，250rpm摇床培养24小时，得到发酵液。

分析方法：使用安捷伦(agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行分析测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(bio-rad)公司的aminexhpx-87h有机酸分析柱(300mm×7.8mm，9μm)；流动相为5mm硫酸，流速0.6ml/min，柱温63℃，检测波长210nm。3-脱氢莽草酸标准品购自sigma-aldrich公司，产品目录号为05616-100mg。

结果：野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj004、wj006、wj012、wj038、wj048和wj060摇瓶发酵24小时后，发酵液中的酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸浓度如图4所示。根据图4结果表明，随着菌种的改造进行，大肠杆菌基本上从不产酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸(野生型大肠杆菌dsm1576，wt)逐步提高了生产能力。最后基因工程大肠杆菌wj060可以生产3.35g/l的酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸，糖酸摩尔转化率达到34.7％。

方法ii

种子培养基为含0.5％葡萄糖的lb培养基，由以下成分组成：

葡萄糖5g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠(nacl)10g/l。

摇瓶发酵培养基为nbs培养基，由以下成分组成：

葡萄糖50g/l，kh2po43.5g/l，k2hpo4·3h2o6.5g/l，(nh4)2hpo43.5g/l，mgso40.120g/l，cacl211mg/l，thiaminehcl5mg/l，fecl3·6h2o0.16mg/l，cocl2·6h2o0.2mg/l，cuso4·5h2o0.015mg/l，na2moo4·2h2o0.02mg/l，zncl20.02mg/l，h3bo30.005mg/l。

野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj004、wj006、wj012、wj038、wj048和wj060摇瓶生产酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸，包括如下步骤：

(1)种子培养：与方法i相同。

(2)摇瓶发酵培养：取500μl上述种子菌液，接种于含有25ml摇瓶发酵培养基的250ml灭菌锥形瓶中，起始葡萄糖浓度为50g/l，37℃，250rpm摇床培养24小时，得到发酵液。

分析方法：与方法i相同

结果：与方法i无显著差异。

方法iii

种子培养基为含0.5％葡萄糖的lb培养基，由以下成分组成：

葡萄糖5g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠(nacl)10g/l。

摇瓶发酵培养基为nbs培养基，由以下成分组成：

葡萄糖100g/l，kh2po43.5g/l，k2hpo4·3h2o6.5g/l，(nh4)2hpo43.5g/l，mgso40.120g/l，cacl211mg/l，thiaminehcl5mg/l，fecl3·6h2o0.16mg/l，cocl2·6h2o0.2mg/l，cuso4·5h2o0.015mg/l，na2moo4·2h2o0.02mg/l，zncl20.02mg/l，h3bo30.005mg/l。

野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj004、wj006、wj012、wj038、wj048和wj060摇瓶生产酪氨酸上游代谢中间产物3-脱氢莽草酸，包括如下步骤：

(1)种子培养：与方法i相同。

(2)摇瓶发酵培养：取1000μl上述种子菌液，接种于含有50ml摇瓶发酵培养基的500ml灭菌锥形瓶中，起始葡萄糖浓度为100g/l，37℃，250rpm摇床培养24小时，得到发酵液。

分析方法：与方法i相同

结果：与方法i无显著差异。

实施例12、用野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj060、tyr002、tyr012、tyr024和tyr042摇瓶生产酪氨酸

方法i

种子培养基为含0.5％葡萄糖的lb培养基，由以下成分组成：

葡萄糖5g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠(nacl)10g/l。

摇瓶发酵培养基为nbs培养基，由以下成分组成：

葡萄糖20g/l，kh2po43.5g/l，k2hpo4·3h2o6.5g/l，(nh4)2hpo43.5g/l，l-phenylalanine40mg/l,mgso40.120g/l，cacl211mg/l，thiaminehcl5mg/l，fecl3·6h2o0.16mg/l，cocl2·6h2o0.2mg/l，cuso4·5h2o0.015mg/l，na2moo4·2h2o0.02mg/l，zncl20.02mg/l，h3bo30.005mg/l。

野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj060、tyr002、tyr012、tyr024和tyr042摇瓶生产酪氨酸，包括如下步骤：

(1)种子培养：15ml试管中种子培养基为3ml，121℃灭菌15分钟。冷却后分别将野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj060、tyr002、tyr012、tyr024和tyr042单菌落接种到3ml种子培养基，在30℃，250rpm摇床过夜培养16小时，用于摇瓶发酵培养基接种。

分析方法：使用安捷伦(agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行分析测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(bio-rad)公司的aminexhpx-87h有机酸分析柱(300mm×7.8mm，9μm)；流动相为5mm硫酸，流速0.6ml/min，柱温63℃，检测波长210nm。酪氨酸标准品购自sigma-aldrich公司，产品目录号为phr1097-1g。

结果：野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj060、tyr002、tyr012、tyr024和tyr042摇瓶发酵24小时后，发酵液中的酪氨酸浓度如图5所示。根据图5结果表明，随着菌种的改造进行，大肠杆菌基本上从不产酪氨酸(野生型大肠杆菌dsm1576，wt、wj060)逐步提高了生产能力。最后基因工程大肠杆菌t042可以生产3.3g/l的酪氨酸。

方法ii

种子培养基为含0.5％葡萄糖的lb培养基，由以下成分组成：

葡萄糖5g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠(nacl)10g/l。

摇瓶发酵培养基为nbs培养基，由以下成分组成：

葡萄糖50g/l，kh2po43.5g/l，k2hpo4·3h2o6.5g/l，(nh4)2hpo43.5g/l，mgso40.120g/l，cacl211mg/l，l-phenylalanine40mg/l,thiaminehcl5mg/l，fecl3·6h2o

0.16mg/l，cocl2·6h2o0.2mg/l，cuso4·5h2o0.015mg/l，na2moo4·2h2o0.02mg/l，zncl20.02mg/l，h3bo30.005mg/l。

野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj060、tyr002、tyr012、tyr024和tyr042摇瓶生产酪氨酸，包括如下步骤：

(1)种子培养：与方法i相同。

分析方法：与方法i相同

结果：与方法i无显著差异。

方法iii

种子培养基为含0.5％葡萄糖的lb培养基，由以下成分组成：

葡萄糖5g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠(nacl)10g/l。

摇瓶发酵培养基为nbs培养基，由以下成分组成：

葡萄糖100g/l，kh2po43.5g/l，k2hpo4·3h2o6.5g/l，(nh4)2hpo43.5g/l，mgso40.120g/l，cacl211mg/l，l-phenylalanine40mg/l,thiaminehcl5mg/l，fecl3·6h2o

0.16mg/l，cocl2·6h2o0.2mg/l，cuso4·5h2o0.015mg/l，na2moo4·2h2o0.02mg/l，zncl20.02mg/l，h3bo30.005mg/l。

野生型大肠杆菌dsm1576(wt)和基因工程大肠杆菌wj060、tyr002、tyr012、tyr024和tyr042摇瓶生产酪氨酸，包括如下步骤：

(1)种子培养：与方法i相同。

分析方法：与方法i相同

结果：与方法i无显著差异。

实施例13、基因工程大肠杆菌tyr042的5l发酵罐补料发酵生产酪氨酸

一级种子培养基为含0.5％葡萄糖的lb培养基，由以下成分组成：

葡萄糖5g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠(nacl)10g/l。

二级种子培养基为含2％葡萄糖的lb培养基，由以下成分组成：

葡萄糖20g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠(nacl)10g/l。

初始发酵罐培养基由以下成分组成：

大量元素：起始葡萄糖20g/l、柠檬酸2g/l、kh2po47.5g/l、(nh4)2so41.6g/l、mgso4·7h2o2g/l、l-phenylalanine0.7g/l；

微量元素：feso4·7h2o75mg/l、mnso4·h2o4.5mg/l、na2so420mg/l、znso46mg/l、cocl2·6h2o4mg/l、cuso4·5h2o0.6mg/l。

以基因工程大肠杆菌tyr042发酵罐补料发酵生产酪氨酸，包括如下步骤：

(1)一级种子培养：15ml试管中一级种子培养基为3ml，121℃灭菌15分钟。冷却后将基因工程大肠杆菌tyr042单菌落接种到3ml种子培养基，在30℃，250rpm摇床过夜培养16小时，用于二级种子培养基接种。

(2)二级种子培养：1l摇瓶中二级种子培养基为200ml，121℃灭菌15分钟。冷却后将2ml一级种子培养液接种到200ml二级种子培养基，在37℃，250rpm摇床培养24小时，用于发酵罐培养基接种。

(3)发酵罐补料发酵生产：取200ml上述二级种子菌液，接种于装有2l初始发酵罐培养基的5lbiotech-5bg发酵罐中(上海保兴生物设备工程有限公司)，在37℃，ph6.5(通过浓氨水调控ph)，溶氧20％的条件下发酵。发酵开始后，待发酵罐中葡萄糖浓度降低到1g/l以下时，开始用浓度为500g/l的葡萄糖溶液开始补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度小于1g/l。定时取样分析发酵生产情况。

分析方法：与实施例10中方法i相同。

结果：基因工程大肠杆菌tyr042发酵罐补料发酵结果如图6。根据图6结果表明，补料发酵条件下发酵40h后，发酵液中积累的酪氨酸达到最高浓度，为45g/l，糖酸摩尔转化率为22％，葡萄糖及乙酸等其他发酵副产物没有积累。

序列表

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>发酵法生产酪氨酸的大肠杆菌及其构建方法与应用

<130>2017.12.08

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>88

<212>dna

<213>人工合成p1(unknown)

<400>1

ttatctctggcggtgttgacaagagataacaacgttgatataattgagcccttttggtgc60

gtcagtcagtttaaaccaggaaacagct88

<210>2

<211>88

<212>dna

<213>人工合成p2(unknown)

<400>2

ttatctctggcggtgttgacaagagataacaacgttgatataattgagcctgaggtggct60

tattattcgtttaaaccaggaaacagct88

<210>3

<211>88

<212>dna

<213>人工合成p3(unknown)

<400>3

ttatctctggcggtgttgacaagagataacaacgttgatataattgagccactggctcgt60

aatttattgtttaaaccaggaaacagct88

<210>4

<211>88

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<213>人工合成p4(unknown)

<400>4

ttatctctggcggtgttgacaagagataacaacgttgatataattgagcccgtattgtta60

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<210>5

<211>53

<212>dna

<213>人工合成p5(unknown)

<400>5

ctgatagctagctcagtcctagggattatgctagcaaagacatgagttactag53

<210>6

<211>1071

<212>dna

<213>人工合成arof*(artificialsequence)

<400>6

atgcaaaaagacgcgctgaataacgtacatattaccgacgaacaggttttaatgactccg60

gaacaactgaaggccgcttttccattgagcctgcaacaagaagcccagattgctgactcg120

cgtaaaagcatttcagatattatcgccgggcgcgatcctcgtctgctggtagtatgtggt180

ccttgttccattcatgatccggaaactgctctggaatatgctcgtcgatttaaagccctt240

gccgcagaggtcagcgatagcctctatctggtaatgcgcgtctattttgaaaaaccccgt300

accactgtcggctggaaagggttaattaacgatccccatatggatggctcttttgatgta360

gaagccgggctgcagatcgcgcgtaaattgctgcttgagctggtgaatatgggactgcca420

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tcagcaattggtgctcgtacaacggaatcgcaaactcaccgtgaaatggcctccgggctt540

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<210>7

<211>1071

<212>dna

<213>人工合成arof(artificialsequence)

<400>7

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