一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的方法与流程

本发明属于环境科学领域，具体涉及一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的方法。

背景技术：

在过去的一个世纪里，塑料已成为现代社会必不可少的一部分。它广泛应用于家具、汽车零部件、包装、人体植入物、航空和航天领域，已成为日常生活中最常用的商品之一。其中由于聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)具有耐折性好、耐油、耐脂肪、耐烯酸、稀碱，耐大多数溶剂、透明度高、光泽性好、无毒、无味、卫生安全性好可直接用于食品包装等众多优良的性能并具有量身定制的能力而被充当消费品而大量生产。因而大量的pet通过生产的方式被引入到环境中，导致pet在全球生态体系中积累。仅2013年全球范围类就有大约5600万吨的pet被生产出来，但只有不到50％的pet被回收，也仅有不到5％的pet被重新生产成塑料水瓶。聚酯纤维作为pet的另外一个大宗产品，仅在欧洲2008年就产生了大约1400万吨聚酯纤维的废弃物，但仅回收了500万吨，其中也仅有大约75％回收的织物重新用于工业应用，其余收集的废旧纺织纤维被送到垃圾处理厂填埋或焚烧。这种处理方式及造成了能源的浪费又对环境产生极其严重的影响。同时由于缺乏较为科学的pet回收的手段，在回收利用传统方法处理pet的过程中由于缺乏较为温和的处理方法会产生大量的乙酸、乙醛、二噁英以及碳氢和碳氧化合物，这些化合物很容易泄露，而对环境造成二次污染。尽管pet的理化性质不会对环境造成特定的威胁，但塑料制品和包装材料(如水瓶)的一次性消费加重了化石燃料的消耗，同时大量的pet废弃物遗留在自然界使得土地营养成分流失土壤板结，并且大量漂流在海洋上的塑料会对海洋生态系统造成毁灭性地打击。因此，关于pet的生态安全回收方法仍然是一个重要的科学目标和社会目标。

虽然化学降解法在pet降解过程中表现出强大的优势，但是由于该方法会消耗大量化学品，同时该方法需要高温和高压的设备，大大增加了pet回收的成本，同时，化学降解pet的过程中会产生大量有毒有害的物质会对生态环境产生较为严重的影响。因此，生物降解被认为是控制塑料污染最有效的方法。2016年，shosukeyoshida等人在垃圾处理站分离出一种新型细菌ideonellasakaiensis201-f6，它可以利用pet作为能量和碳源。i.sakaiensis粘附于pet表面并分泌独特的角质酶petase来降解pet。该酶能将pet降解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸(mhet)和乙二醇(eg)。但降解产物乙二醇(eg)对环境和动物具有毒害作用，因此需要寻求一种绿色、环保的聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)的生物降解方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种绿色、环保的降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种表达petase酶和mhtease酶的宿主菌。

本领域技术人员可以理解，本发明对宿主菌的种类没有限制，只有能够表达petase酶和mhtease酶即可。

在一些实施方案中，所述的宿主菌其为枯草芽孢杆菌。

在一些实施例中，所述的宿主菌其为枯草芽孢杆菌168。

本发明还提供了所述宿主细胞的构建方法，将petase酶基因和mhetase酶与表达载体连接后转化宿主细胞。

本领域技术人员可以理解，本发明对表达载体的类型没有限制，可以采用本领域公知的任意一项表达载体。

在一些实施方案中，所述表达载体为php13-43表达载体。

本发明还提供了一种复合菌种由上述的宿主菌、恶臭假单胞菌和红球菌组成。

本发明所述由表达petase酶和mhtease酶的宿主菌、恶臭假单胞菌和红球菌构成的混菌体系，能够解决pet降解产物tpa的抑制作用以及降解产物tpa和乙二醇(eg)对环境的毒害作用，实现pet的绿色降解。

作为优选，本发明所述的复合菌种中所述表达petase酶和mhtease酶的宿主菌、恶臭假单胞菌和红球菌的接种量比为(1～100):(10^-6～1):(1～100)。

进一步，更优选的，本发明所述的复合菌种中所述表达petase酶和mhtease酶的宿主菌、恶臭假单胞菌和红球菌的接种量比为1:10^-5:10。

本发明还提供了一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)的方法，将上述的复合菌种培养后，加入聚对苯二甲酸乙二醇酯进行降解。

作为优选，所述培养的培养基为无机盐培养基。

作为优选，所述降解温度为37℃，降解时间为7天。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种表达petase酶和mhtease酶的宿主菌，构建方法，由该宿主菌、恶臭假单胞菌和红球菌组成的复合菌株以及采用所述复合菌株降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的方法。本发明所述表达petase酶和mhtease酶的宿主菌与恶臭假单胞菌和红球菌混合构成复合菌种，采用所述复合菌株降解聚对苯二甲酸乙二醇酯能够解决pet降解产物tpa的抑制作用以及降解产物tpa和乙二醇(eg)对环境的毒害作用，实现pet的绿色降解。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例2利用混菌体系降解pet后的质量变化图，其中bs168：枯草芽孢杆菌168；rj:红球菌；pp：恶臭假单胞菌；brp:枯草芽孢杆菌、红球菌和恶臭假单胞菌复合菌种；

图2示实施例2利用混菌体系降解pet后的tpa含量变化图；

图3示实施例3恶臭假单胞菌的不同接种量对pet降解的影响；

图4示实施例4红球菌的不同接种量对pet降解的影响。

具体实施方式

本发明公开了一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中gm1培养基、gm2培养基、w培养基购自sigma。

实施例1：一种宿主菌

petase和mhetase质粒构建：公司合成的petase(gap38373.1)和mhetase(a0a0k8p8e7.1)基因与php13-43表达载体利用bamhi和ecori酶切消化，经琼脂糖凝胶电泳进行纯化，得到线性化的php13-43表达载体和内切酶消化后的petase和mhetase。酶切之后的片段和载体利用t4dna连接酶进行连接，转化入大肠杆菌体内，经菌落pcr、酶切和测序验证成功后，提取质粒作为枯草芽孢杆菌表达的载体质粒。

枯草芽孢杆菌转化方法：

1)取甘油冻存枯草芽孢杆菌，lb平板划线，37℃培养。次日取新鲜单菌接至4mlgm1培养基试管中，37℃200rpm培养过夜。

2)取400μl菌液转接入gm1培养基中，37℃200rpm培养4.5-5h(对数期末期)。

3)取1.2ml菌液转接到装有4mlgm2培养基的试管中，37℃、200rpm培养1.5h，制得感受态细胞。

4)将待转化质粒与1ml感受态细胞混匀后在37℃静置1h。

5)37℃，200rpm振荡培养1h，取适量菌悬液涂布选择培养基(lb+红霉素)，37℃培养24h后，通过菌落pcr挑选验证转化子，获得一株表达petase酶和mhtease酶枯草芽孢杆菌。

实施例2、混菌体系降解pet

接种前，枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌和红球菌先在lb培养基中过夜培养，取5毫升培养基4000rmp离心收集菌体，菌体用w培养基进行洗涤，然后利用w培养基将菌体的od600稀释到1。单菌接种量100微升，混菌(枯草芽孢杆菌(bb)、恶臭假单胞菌和红球菌接种量比为1:10^-5:10)接种总体积100微升接种到w培养基。从图1可以看出野生型的枯草芽孢杆菌(bs168)、红球菌(rj)和恶臭假单胞菌(pp)都不能降解pet。只有携带了petase和mhetase质粒的枯草芽孢杆菌(bb)能够水解pet，反应七天后pet膜的质量降低了1.3mg。然而相比单菌体系而言，混菌体系(brp)的降解速率显著高于单菌，七天可以使pet膜的重量降低2.8mg，是单菌的2倍。

发酵完成之后，取1毫升培养液离心取上清，利用高效液相色谱仪测量tpa含量，检测波长241nm。通过检测培养基中tpa的浓度，并且从图2可以看出混菌体系中的tpa的含量明显低于单菌，减少了对环境的危害作用。

实施例3、改变恶臭假单胞菌的接种量对pet降解的影响：

接种前，枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌和红球菌先在lb培养基中过夜培养，取5毫升培养基4000rmp离心收集菌体，菌体用w培养基进行洗涤，然后利用w培养基将菌体的od600稀释到1。恶臭假单胞菌分别稀释1、10、100、1000、100000、10000000倍之后接100μl，红球菌直接种100μl为初始接种量，枯草芽孢杆菌接种量为100μl，接种到20mlw培养基中。加入pet薄膜37℃降解7天之后分别用10％sds、无水乙醇和水清洗pet薄膜，烘干后称量pet薄膜的质量变化，结果如图3。

由图3结果可知当枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌和红球菌的接种量为1：1：1时(brp(pp*1，pp不稀释))，pet的降解速率也有了明显的提升，但是由于恶臭假单胞菌的大量存在严重抑制了红球菌和枯草芽孢杆菌的生长。随着恶臭假单胞菌的接种量的降低，pet的降解速率也明显提升，当恶臭假单胞菌的初始接种量的为原接种量的10^-5时，pet的质量损失最为明显达到了4.7mg。pet的降解效率也达到最大值，降解效果单菌的3倍。但是当恶臭假单胞菌的接种量进一步降低时，pet的降解速率显著下降。

实施例4、改变红球菌的接种量对pet降解的影响：

在优化恶臭假单胞菌接种量的基础上对红球菌的接种量做进一步优化，分别将红球菌的接种量增加10和100倍后，加入pet薄膜37℃降解7天之后分别用10％sds、无水乙醇和水清洗pet薄膜，烘干后称量pet薄膜的质量变化，结果如图4。

由图4结果可知，当红球菌的接种量较低时，培养基中tpa的量在降解的前三天中存在了明显的积累过程，随着红球菌的初始接种量的提升，tpa的积累量变少而导致tpa的petase的抑制作用减弱，从而pet的降解速率提升。当红球菌的接种量提高十倍时pet的降解速率达到最大值，七天内使得pet膜的质量减少7.9mg，pet的降解速率提高了1.5倍，相比单菌而言提高了4倍。