化合物及包含所述化合物的试剂盒的制作方法

本发明涉及一种化合物及包含所述化合物的试剂盒。

背景技术：

定量检测血液中的癌症标记物对于癌症早期诊断，提高患者存活率具有重要意义。溶血磷脂酸(LPA)是卵巢癌及其他妇科肿瘤早期诊断的理想标志物，但其在血液中的含量很低。目前，文献报道的用于检测LPA的方法主要是串联质谱法、毛细管电泳法、免疫化学法，但这些方法的实现需要精密的仪器和复杂的操作过程。光谱法(包括紫外可见光谱法和荧光光谱法)由于其成本低、操作简单、灵敏度高等优势引起了化学家广泛的关注。目前有文献报道用合成小分子化合物和MOF材料通过紫外可见光谱法和荧光光谱法实现了对LPA的检测，但是缺乏灵敏度和选择性，所以很难在血清中仅通过简单的处理实现定量检测。

技术实现要素：

发明目的

本发明的一个目的是提供一种化合物，可以通过简单的荧光检测的方法，在血清中实现超灵敏选择性的定量检测LPA。

本发明的另一个目的是提供包含所述化合物的试剂盒，所述试剂盒用于检测LPA。

发明概述

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种化合物，结构式如(I)所示：

其中，M＝C1、Br或I；n＝1或2；R₁＝CH₃或C₂H₅；R₂＝CH₃或C₂H₅。

上述化合物的名称为：5，11，17，23，29-五胍基-31，32，33，34，35-五烷氧基杯[5]芳烃。

优选的，n＝1，R₁＝R₂＝CH₃；进一步优选的，M＝Cl，此时所述化合物结构式如(II)所示：

上述具体化合物名称为：5，11，17，23，29-五胍基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃(以下简称GC5A)，其制备方法为：以5，11，17，23，29-五叔丁基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃为原料，经过硝化、还原、叔丁氧羰基保护胍基修饰，脱保护得到目标化合物。具体合成路线如下：

上述具体制备方法中每一步骤的具体反应条件及产物分离方法均为现有技术，在此不再赘述。本发明所述化合物的制备方法均采用上述合成路线。

根据本发明的第二方面，本发明提供了包含上述化合物的试剂盒，所述试剂盒用于检测LPA。

优选的，所述试剂盒包括染料四磺酸基酞菁氯化铝，所述试剂盒采用荧光竞争滴定方法检测LPA，所述化合物与染料四磺酸基酞菁氯化铝(以下简称AlPcS4)作为检测LPA的传感对。

进一步具体的，所述试剂盒还包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和二甲基亚砜(DMSO)。

本发明所述化合物用于检测LPA的试剂盒时，可以通过简单的荧光检测的方法，在血清中实现超灵敏选择性的定量检测LPA，当所述试剂盒以GC5A和AlPcS4作为检测LPA的传感对，运用荧光竞争滴定的方法检测血清中LPA时，LPA检出下限可达到1.7μmol/L。

附图说明

图1：5，11，17，23，29-五硝基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃的核磁共振氢谱；

图2：5，11，17，23，29-五氨基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃的核磁共振氢谱；

图3：5，11，17，23，29-五[(N，N-叔丁氧羰基)胍基]-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃的核磁共振氢谱；

图4：5，11，17，23，29-五胍基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃(GC5A)的核磁共振氢谱；

图5：5，11，17，23，29-五胍基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃(GC5A)的核磁共振碳谱；

图6：5，11，17，23，29-五胍基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃(GC5A)的高分辨质谱图；

图7：相对荧光强度随LPA浓度变化的标准曲线。

具体实施方式

下面用实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于本发明而不是限制本发明。

以下实施例中所涉及制剂来源如下：

二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚为色谱纯级别，来源于天津市康科德科技有限公司；

醋酸、硝酸、三乙胺为分析纯级别，来源于天津市化学试剂供销公司；

氘代氯仿、氘代二甲基亚砜来源于北京百灵威科技有限公司；

碳酸钠、氯化钠、硫酸钠、二水合二氯亚锡、氢氧化钠、硝酸银、四氯化锡、1，3-二(叔-丁氧羰基)-2-甲基-2-异硫脲，、4-羟乙基哌嗪乙磺酸为分析纯级别，来源于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

溶血磷脂酸纯度为98％，来源于美国Avanti Polar Lipids公司；

四磺酸基酞菁氯化铝纯度为97％，来源于美国Frontier Scientific公司；

小鼠血清(空白样)取自KM小鼠，来源于重庆曼纽艾克科技有限公司。

以下实施例中所涉及设备如下：

Bruker AV400核磁共振波谱仪；

Varian 7.0T FTMS傅立叶变换高分辨质谱仪；

Cary Eclipse荧光分光光度计。

制备实施例

1、5，11，17，23，29-五硝基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃的合成过程：

将3.96g的5，11，17，23，29-五叔丁基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃溶解于119mL干燥的二氯甲烷和34.28mL的醋酸溶液中，后逐渐滴加10.28mL硝酸，室温搅拌1至4小时。溶液的颜色从深紫色变为橙色。然后向反应溶液中加入250mL水搅拌30分钟，将混合溶液用饱和碳酸钠溶液，饱和食盐水溶液，水萃取分液，收集有机相，浓缩，无水硫酸钠干燥，用二氯甲烷和甲醇重结晶，得到1.74g 5，11，17，23，29-五硝基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃淡黄色固体，其核磁共振氢谱(图1)结果如下：

¹H NMR(400MHz，氘代氯仿(CDCl₃)，δ)：7.83(s，10H，ArH)，4.59(d，J＝14.78Hz，5H，Ar-CH₂-Ar)，3.84(t，J＝7.60Hz，10H，CH₂-O-Ar)，3.56(d，J＝14.81Hz，5H，Ar-CH₂-Ar)，1.84(dt，J＝15.57Hz，J＝7.76Hz，10H，-CH₂-CH₂-CH-)，1.60(m，5H，-CH-)，1.26(m，10H，-CH₂-CH₂-CH-)，0.95(d，J＝6.59Hz，30H，-(CH₃)₂).

2、5，11，17，23，29-五氨基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃的合成过程：

将0.28g的5，11，17，23，29-五硝基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃溶解于50mL乙醇和乙酸乙酯溶液中(体积比1∶1)，加入0.15g二水合二氯亚锡，反应回流48小时。将反应产物倒入冰水中，冰融化后，加入氢氧化钠调pH值为8.0。将二氯甲烷加入反应溶液中，在室温下搅拌过夜。有机相水洗，干燥，旋干，得到0.13g 5，11，17，23，29-五氨基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃白色固体，其核磁共振氢谱(图2)结果如下：

¹H NMR(400MHz，氘代氯仿(CDCl₃)，δ)：6.17(s，10H，ArH)，4.40(d，J＝14.42Hz，5H，Ar-CH₂-Ar)，3.60(t，J＝7.28Hz，10H，CH₂-O-Ar)，3.11(d，J＝14.25Hz，5H，Ar-CH₂-Ar)，1.74(q，J＝7.57Hz，10H，-CH₂-CH₂-CH-)，1.56(s，5H，-CH-)，1.27(m，10H，-CH₂-CH₂-CH-)，0.91(d，J＝6.56Hz，30H，-(CH₃)₂).

3、5，11，17，23，29-五[(N，N-叔丁氧羰基)胍基]-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃的合成过程：

将0.2g 5，11，17，23，29-五氨基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃，0.33g 1，3-二(叔-丁氧羰基)-2-甲基-2-异硫脲，0.2g硝酸银和0.17mL三乙胺加入到25mL二氯甲烷中，室温搅拌48小时，反应液旋干，柱色谱分离得到0.17g 5，11，17，23，29-五[(N，N-叔丁氧羰基)胍基]-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃白色固体，其核磁共振氢谱(图3)结果如下：

¹H NMR(400MHz，氘代氯仿(CDCl₃)，δ)：11.63(s，5H，NH)，9.87(s，5H，NH)，7.14(s，10H，ArH)，4.54(d，J＝13.58Hz，5H，Ar-CH₂-Ar)，3.75(t，J＝7.76Hz，10H，CH₂-O-Ar)，3.30(d，J＝13.81Hz，5H，Ar-CH₂-Ar)，1.91(m，10H，-CH₂-CH₂-CH-)，1.60(m，5H，-CH-)，1.46(d，90H，J＝13.81Hz，But)，1.15(m，10H，-CH₂-CH₂-CH-)，0.95(d，J＝6.58，30H，-(CH₃)₂).

4、5，11，17，23，29-五胍基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃(GC5A)的合成过程：

将0.08g 5，11，17，23，29-五[双-N]-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃加入到0.2mL四氯化锡和20mL乙酸乙酯中。反应液在室温搅拌3小时。然后将反应液旋干，溶于甲醇，后加入大量乙醚，沉淀出0.03g 5，11，17，23，29-五胍基-31，32，33，34，35-五(4-甲基戊氧基)杯[5]芳烃(GC5A)白色固体，其核磁共振氢谱(图4)和碳谱(图5)结果如下：

¹H NMR(400MHz，氘代二甲基亚砜(DMSO)，δ)：9.62(s，5H，NH)，7.35(s，20H，NH)，6.95(s，10H，ArH)，4.46(d，J＝13.61Hz，5H，Ar-CH₂-Ar)，3.80(t，J＝7.74Hz，10H，CH₂-O-Ar)，3.46(d，J＝18.32Hz，5H；Ar-CH₂-Ar)，1.91(p，J＝7.54Hz，10H，-CH₂-CH₂-CH-)，1.61(p，J＝13.18Hz，J＝6.58Hz，5H，-CH-)，1.32(q，J＝7.31Hz 10H，-CH₂-CH₂-CH-)，0.94(d，J＝6.61，30H，-(CH₃)₂).

¹³C NMR(100MHz，氘代二甲基亚砜(DMSO)，δ)：155.82，153.41，134.62，129.67，125.57，74.22，64.54，34.64，27.65，22.56，15.19.ESI-FTMS m/z：[M+H-5HCl]⁺calcd.for C₇₀H₁₀₆N₁₅O₅⁺1236.8496，found 1236.8472.

应用实施例

运用荧光竞争滴定的方法，将制备的GC5A应用于在血清中超灵敏选择性定量检测LPA浓度：以GC5A和AlPcS4作为检测LPA的传感对，建立了定量检测血清LPA浓度的体系。具体实施步骤如下：

称取2.383g HEPES，用超纯水配制成1L 10mmol/L pH 7.4的缓冲溶液(以下简称HEPES缓冲溶液)。称取0.35mg LPA，用DMSO配制成3mL 250μmol/L的LPA储备液。在25℃温度下，用10mmol/L pH7.4的HEPES缓冲溶液将小鼠血清(空白样)稀释，加入用HEPES缓冲溶液配制的100μmol/L的AlPcS4浓溶液，可以看到明显的荧光信号，再加入用HEPES缓冲溶液配制的100μmol/LGC5A的浓溶液，得到待滴定的标准溶液，所述待滴定的标准溶液的体积为被稀释的小鼠血清(空白样)体积的10倍，所述待滴定标准溶液中AlPcS4和GC5A的浓度分别为5μmol/L、10μmol/L，待滴定的标准溶液的荧光信号相对于加入AlPcS4浓溶液后的荧光信号明显变弱，测试此时的荧光强度作为基准荧光强度；然后向待滴定的标准溶液中逐渐滴加LPA储备液，可以看到荧光信号的恢复。通过这种荧光竞争滴定的方法，可以测得相对荧光强度(荧光强度测试值与基准荧光强度的比值)随LPA浓度变化的标准曲线(图7)，并得到LPA的检出限为1.7μmol/L，其中标准曲线中的LPA浓度为滴入的LPA的摩尔量相对于小鼠血清体积的折算浓度。该图证明，在稀释的小鼠血清溶液中，LPA浓度和相对荧光强度有良好的线性关系，证实了体系应用在超灵敏定量检测LPA浓度的可行性。

检测血清中LPA浓度的具体操作可以如下：

1、按照上述方法用血清空白样得出相对荧光强度随LPA浓度变化的标准曲线；

2、在25℃温度下，用10mmol/L pH 7.4的HEPES缓冲溶液将待测血清稀释，并加入用HEPES缓冲溶液配制的AlPcS4浓溶液和GC5A浓溶液，得到待滴定的待测溶液，所述待滴定的待测溶液的体积为被稀释的待测血清体积的10倍，所述待滴定的检测溶液中AlPcS4和GC5A的浓度分别为5μmol/L、10μmol/L，检测待滴定的待测溶液的荧光强度，计算相对荧光强度与1中得到的标准曲线进行对照，得到待测血清中的LPA浓度。