辅助鉴定猪传染性胸膜肺炎ApxI毒素的引物组合物及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，特别是指一种辅助鉴定猪传染性胸膜肺炎apxi毒素的引物组合物及其应用。
背景技术：
：猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌(app)引起的一种猪的高度接触性传染病，也是当代国际公认危害现代养猪业五大重要传染病之一，也是当今大型养猪场的三大呼吸道传染病之一。在临床剖检上主要以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变，急性病例病死率高。本病发病季节明显，在气温较低的冬季、早春晚秋等气候恶劣的时节多发。任何年龄的猪对本病均易感，其中3月龄最易感。感染了胸膜肺炎放线杆菌的猪，在临床上常易继发其他细菌性疾病如副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌等，还有支原体、猪繁殖于呼吸障碍综合征病毒(prrsv)、猪圆环病毒(pcv)及伪狂犬病病毒(prv)等，引起复杂的呼吸道综合症，加重对感染猪只的危害。猪胸膜肺炎放线杆菌引起猪传染性胸膜肺炎主要与较多的毒力因子有关，包括脂多糖(lps)、外膜蛋白(omp)、转铁结合蛋白(tbp)、荚膜(cp)、溶血外毒素(apx)等这些毒力因子都能引起胸膜肺炎的发生。其中的apx是一种对肺泡巨噬细胞起毒性作用的物质，可抑制肺泡巨噬细胞的吞噬活性，同时，apx对外周单核细胞及淋巴细胞也有细胞毒性作用，被认为是引起感染并使肺组织严重损伤的主要原因。apx分为apxi、apxⅱ、apxⅲ、apxiv四种不同型的毒素，apxi、apxⅱ、apxⅲ是引起疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变必需物质，被公认为引起猪传染性胸膜肺炎的主要毒力因子，对临床疾病诊断有重要意义。apxi是引起猪传染性胸膜肺炎疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变主要毒力因子，但在诊断方法特异性差，很难检测完app所有血清型，因与其他放线杆菌如猪放线杆菌、罗斯放线杆菌、猪扁桃体放线杆菌等存在交叉反应。而app所有血清型都分泌apxiv，apxiv的种间特异性很强，在其它种属的放线杆菌和其它能分泌apxi毒素的革兰氏阴性杆菌中则均检测不到apxiv。专利(cn1017247209a)公开了一种猪传染性胸膜肺炎pcr诊断试剂盒，它包括400μl浓度为20mg/ml的蛋白酶k，1000μl裂解液，1500μlte缓冲液，250μlpcr酶，170μl超纯水，50μl的markerdl2000，40μl等体积混合的引物p1、p2，引物p1、p2的浓度均为20μm，20μl阴性对照以及20μl阳性对照。由于该专利仅检测了apxiva毒素，在临床上仍然无法鉴定该主要治病毒力因子到底属于apxi、apxⅱ、apxⅲ中的哪一类型，存在无法提供精准诊断的缺陷。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种准确鉴定apxia毒素，并且快捷、灵敏，检测方式简单，使用效果好的辅助鉴定猪传染性胸膜肺炎apxi毒素的引物组合物及其应用。为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：一方面，提供一种辅助鉴定猪传染性胸膜肺炎apxi毒素的引物组合物，包含如下4条引物：1-f5’-tcggtcgtagcattagcg-3’1-r5’-gacatcccaacgctgttg-3’2-f5’-cttttttgttgtagaagcatcc-3’2-r5’-tcgtcaataggcgtaacagtt-3’。另一方面，本发明还提供上述辅助鉴定猪传染性胸膜肺炎毒素的引物组合物在制备试剂盒的应用，应用于鉴定猪传染性胸膜肺炎apxi毒素和辅助鉴定待测样本中是否为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素。再一方面，本发明还提供一种试剂盒，包括权利要求1所述的引物组合物。优选的，该试剂盒基于双重pcr方法，对待测样本提取基因dna后，采用权利要求1所述的引物组合物进行双重pcr检测待测样本中的胸膜肺炎毒素。优选的，试剂盒中上下游引物的浓度均为1.0ng/ml。优选的，试剂盒的检测体系为30-50μl。优选的，试剂盒中待测样本dna浓度为15μg/ml-60μg/ml。优选的，试剂盒的工作条件为95℃预变性10min，95℃变性50s，50-60℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环，最后再72℃延伸10min。优选的，退火温度为56℃-60℃。上述试剂盒应用于鉴定猪传染性胸膜肺炎apxi毒素和辅助鉴定待测样本中是否为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素。本发明具有以下有益效果：上述方案中，本发明提供的引物组合物结合双重pcr同时鉴定apxⅰa和apxⅳa毒素，可以准确、快速的检测出临床样本的主要毒力因子是否为apxⅰa，具有灵敏度高、特异性强、时间短、成本低等特点，可以对于临床样本进行检测，操作简单、容易推广，便于基层操作和应用。附图说明图1为本发明apxia毒素的部分基因序列及引物所在的位点；图2为本发明apxⅳa毒素的部分基因序列及引物所在的位点；图3为采用pcr检测apxia毒素引物灵敏度，m为dnamaker2000，1-10代表的引物浓度分别为0.2ng/ml、0.4ng/ml、0.6ng/ml、0.8ng/ml、1.0ng/ml、1.2ng/ml、1.4ng/ml、1.6ng/ml、1.8ng/ml、2.0ng/ml；图4为采用pcr检测apxⅳa毒素引物灵敏度，m为dnamaker2000，1-10代表的引物浓度分别为0.2ng/ml、0.4ng/ml、0.6ng/ml、0.8ng/ml、1.0ng/ml、1.2ng/ml、1.4ng/ml、1.6ng/ml、1.8ng/ml、2.0ng/ml；图5为退火温度对pcr检测apxia的影响，m为dnamaker2000，1-6分别代表退火温度50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃；图6为退火温度对pcr检测apxⅳa的影响，m为dnamaker2000，1-6分别代表退火温度50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃；图7为apxia毒素引物浓度对双重pcr检测结果的影响，m为dnamaker2000，1-10分别代表apxⅰa基因不同引物浓度0.2ng/ml、0.4ng/ml、0.6ng/ml、0.8ng/ml、1.0ng/ml、1.2ng/ml、1.4ng/ml、1.6ng/ml、1.8ng/ml、2.0ng/ml；图8为apxⅳa毒素引物浓度对双重pcr检测对结果的影响，m为dnamaker2000，1-10分别代表apxⅳa基因不同引物浓度0.2ng/ml、0.4ng/ml、0.6ng/ml、0.8ng/ml、1.0ng/ml、1.2ng/ml、1.4ng/ml、1.6ng/ml、1.8ng/ml、2.0ng/ml；图9为检测退火温度对双重pcr结果的影响，m为dnamaker2000，1-6分别代表退火温度50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃；图10为体系大小对双重pcr结果的影响，m为dnamaker2000，1-9分别代表双重pcr体系大小10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、45μl、50μl；图11为引物的特异性检测结果，m为dnamaker2000，1-6分别为金黄色葡萄球菌dna、牛大肠杆菌dna、粪肠球菌dna、猪大肠杆菌dna、链球菌dna、apxⅰa和apxⅳa标准菌株混合dna；图12为引物的稳定性检测结果，m为dnamaker2000，1-7分别代表10、20、30、60、120、240、360天提取的apxia和apxⅳa标准菌株的dna模板；图13为dna模板浓度检测结果，m为dnamaker2000，1-5分别代表不同浓度的dna模板15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml、240μg/ml，6为阴性对照(用ddh2o代替dna模板)。具体实施方式为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。本发明针对现有技术中apxⅰa在诸多放线杆菌中存在交叉反应，检测该毒力因子的特异性差的问题，提供一种辅助鉴定猪传染性胸膜肺炎毒素的引物组合物及其应用。本发明中使用的试剂及菌株信息如下：1.1供试菌株apxⅰa和apxⅳa标准菌株购买于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。粪肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及链球菌均为市售菌株。1.2培养基、酶、试剂盒及其它试剂(1)培养基tsb培养基(购买与青岛高科园海博生物技术有限公司)：将3gtsb干粉溶100ml双蒸水中，120℃高压30min。lb培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10/l。(2)酶及试剂盒2×tagmastermix(包含taqdnapolymerase，dntp以及优化缓冲体系)为诺唯赞生物公司产品。dnamaker为taraka公司产品dna回收试剂盒为taraka公司产品(3)其它试剂烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)购自郑州博研生物科技有限公司琼脂粉购于solarbio公司tae(50×)缓冲液：称取121g的tris碱和18.6g的na2edta.2h2o于烧杯中，加入400ml的去离子水，充分搅拌溶解，再加入30ml的冰乙酸，充分混匀，用冰乙酸调整ph值至8.5，定容至500ml，室温保存。tae(1×)缓冲液：量取10mltae(50×)缓冲液和490mlddh2o于烧杯中，充分混合均匀。1.0％的琼脂糖凝胶：称取0.2g的琼脂糖粉剂于锥形瓶中，加入20ml的1×tae溶液，搅拌摇匀后，加热煮沸1-2min，待稍微冷却后加入3μl的eb储存液，摇匀备用。实施例1引物组合物的制备合成表1所示的各条引物，其中1-f、1-r、2-f、2-r的核苷酸序列见表1。表1引物名称核苷酸序列1-f5’-tcggtcgtagcattagcg-3’1-r5’-gacatcccaacgctgttg-3’2-f5’-cttttttgttgtagaagcatcc-3’2-r5’-tcgtcaataggcgtaacagtt-3apxia部分基因序列(genebank：af240779.1)如序列表的序列5所示(序列长度513bp)，引物所在位点见图1，apxⅳa部分基因序列(genbank：fj848574.1)如序列表的序列6所示(序列长度1092bp)，引物所在位点见图2。实施例2引物灵敏度检测细菌的培养及dna的提取(1)1.5mlapxⅰa标准菌和apxⅳa标准菌培养及dna提取取4支试管，分别加入7mltsb，加入5μlnad，300μl牛血清，其中两只加入50μlapxⅰa标准菌液，两只加入50μlapxⅳa标准充分混合均匀。四支试管同时置于摇床上，以200r/min，37℃培养12h。分别取1.5mlapxⅰa标准菌液及apxⅳa标准菌液于2支ep管内，12000r/min离心2min，弃上清液。重复操作两次。按照dna提取试剂盒说明书提取两种菌的dna。测得apxⅳa菌dna浓度为150μg/ml；apxⅰa菌dna浓度为240μg/ml。(2)其它细菌的培养及dna的提取取4支试管，分别加入7mllb，分别加入100μl大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌，混合均匀。四支试管同时置于摇床上，以200r/min，37℃培养12h，dna提取步骤同上。单重pcr体系的建立(1)apxⅰa或apxⅳa基因pcr体系apxⅰa或apxⅳa基因pcr反应总体系为20μl，详情见表2。表2apxⅰa或apxⅳa基因pcr体系将2ng/ml引物稀释成0.2ng/ml，0.4ng/ml，0.6ng/ml，0.8ng/ml，1.0ng/ml，1.2ng/ml，1.4ng/ml，1.6ng/ml，1.8ng/ml，2.0ng/ml10种不同浓度，采用表2中反应体系、反应程序对引物灵敏性进行检测。由图3-4可知，apxⅰa和apxⅳa引物浓度在0.2ng/ml-2.0ng/ml范围内都能检测到目的片段。apxⅰa基因随着引物浓度增大，目的条带越明亮，检测结果越明显。引物浓度为2.0ng/ml目的条带最为明显。apxⅳa基因引物浓度在0.2ng/ml-2.0ng/ml范围内，除0.2ng/ml条带较弱，其它条带无明显变化，且经过测序比对验证，本发明提供的特异性引物扩增出的目标片段为apxⅰa和apxⅳa基因序列。实施例3退火温度对pcr结果的影响在pcr反应条件中，设计6个不同退火温度，分别50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃。利用表2中的反应体系，测定不同退火温度对apxⅰa和apxⅳa基因pcr结果的影响。从不同退火温度下的结果来看，退火温度对毒素apxⅰa和apxⅳa的pcr反应的影响是不同的。由图5可知，退火温度对apxⅰa的影响较大，虽然退火温度在50℃-60℃之间的所有温度都能得到目的基因片段，但是50℃和60℃的条带亮度明显不如中间温度下的条带明亮。由图6可知，退火温度在50℃-60℃之间变化对apxⅳa片段影响不大。实施例4引物浓度变化对双重pcr的影响双重pcr反应体系的建立，总体系为50μl，详情见表3。表3双重pcr体系由实施例2可知，apxⅰa或apxⅳa引物浓度在0.2ng/ml-2.0ng/ml范围内都能检测到目的片段。在双重pcr反应中，将引物稀释成0.2ng/ml，0.4ng/ml，0.6ng/ml，0.8ng/ml，1.0ng/ml，1.2ng/ml，1.4ng/ml，1.6ng/ml，1.8ng/ml，2.0ng/ml10种不同浓度，利用表3中的反应体系、反应程序对双重pcr中apxⅰa和apxⅳa基因的引物灵敏性进行检测。在双重pcr中，发明人首先设定apxⅳa的上下游引物(2-f和2-r)均为1.0ng/ml浓度，将apxⅰa的上下游引物稀释，由图7可知，能扩增apxⅰa基因的引物的浓度为0.6ng/ml，随引物浓度增加，目的片段的条带越明显。如将apxⅰa的上下游引物(1-f或1-r)均设为1.0ng/ml浓度，将apxⅳa的上下游引物稀释，由图8可知，能检测到apxⅳa基因的引物最低浓度为0.4ng/ml。apxⅳa引物浓度增大目的条带变得明亮，但apxⅰa目的片段的条带却逐渐减弱直至消失，此时，apxⅰa的上下游引物的浓度优选为0.4ng/ml-1.0ng/ml。说明在双重pcr中，单个目的片段的扩增数量与引物的浓度并非简单的线性关系，还与另一引物的浓度有关。发明人采用上述体系，还摸索了在不同dna模板浓度(apxⅳa和apxⅰa的dna量分别为0.1-1μl，10个不同体积)条件下，进行pcr反应，apxⅰa和apxⅳa的上下游引物浓度均为1.0ng/ml时，均可检测出目标条带。由于篇幅所限，不一一列举，本发明提供的试剂盒，apxⅰa和apxⅳa的上下游引物浓度优选为1.0ng/ml。实施例5体系大小对结果的影响设计10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、45μl、50μl9个不同大小的反应体系，利用表3中的反应体系、反应程序，探究体系大小对实验结果的影响，详情见表4-12。表410μlpcr体系表515μlpcr体系表620μl反应体系表725μl反应体系表830μl反应体系表935μl反应体系表1040μl反应体系表1145μl，反应体系表1250μl反应体系上述pcr体系中，引物浓度均为1.0ng/ml，由图9可知，当双重pcr反应体系在10μl时，两个目的片段均无亮带；当总体系为15μl时，只有apxⅰa由目的片段，20μl-50μl体系之间两种基因均得到两个目的片段，且30μl体系时两个目的片段条带最亮。体系在30μl-50μl时，apxⅳa片段逐渐变亮，apxⅰa逐渐变暗，所以本发明提供的试剂盒的检测体系优选为30-50μl。实施例6退火温度对双重pcr的影响采用实施例5中30μlpcr反应体系，设计6个不同退火温度，分别为50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃。为测定不同退火温度对双重pcr结果的影响。由图10可知，当退火温度为50℃时apxⅳa目的片段扩增较好，虽然有apxⅰa片段但亮度较小，52℃、54℃时，apxⅰa基因表达增强，apxⅳa基因表达减弱。56℃、58℃、60℃两种基因pcr产物表达都较好。实验结果表明，双重pcr中，两个片段相互影响，最适退火温度与单重pcr并不相同，所以本发明提供的试剂盒的双重pcr程序中，最适退火温度为56℃-60℃。实施例7引物特异性检测用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、链球菌以及猪胸膜性肺炎放线杆菌，对引物的特异性进行检测，反应体系为50μl，详情见表13。表13引物特异性检测表中，dna模板分别为金黄色葡萄球菌dna、牛大肠杆菌dna、粪肠球菌dna、猪大肠杆菌dna、链球菌dna、apxⅰa和apxⅳa标准菌株混合dna(各1μl)。由图11可知，对金黄色葡萄球菌、牛大肠杆菌、粪肠球菌、猪大肠杆菌以及链球菌的dna进行扩增均未能得到目的基因片段，只有apxⅰa和apxⅳa标准菌株才能扩增出与目的片段大小一致的条带，说明本实验设计的引物特异性好。实施例8双重pcr的稳定性测定将10、20、30、60、120、240、360天提取的apxⅰa和apxⅳa标准菌株dna用表8的反应条件(其中的引物的浓度为均为1.0ng/ml)、反应体系进行扩增，检测双重pcr的稳定性。由图12可知，对不同时间提取的dna同时进行双重pcr扩增，都能得到两条目的片段。说明本实验引物稳定性良好，稳定性可以达到100％。实施例9双重pcrdna模板浓度检测采用表8的反应条件及反应程序(其中的引物的浓度为均为1.0ng/ml)，将反应体系中apxⅰa和apxⅳadna模板替换为患猪传染性胸膜肺炎病apxi型的猪的dna(1μl)。采用北京索莱宝公司购买的动物组织dna提取试剂盒，提取待测样本的dna，将样本的dna浓度稀释成15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml、240μg/ml5个不同浓度，进行双重pcr检测，检测结果如图13所示，随着待测dna版本浓度的增加，apxⅰa的条带逐渐变暗。在双重pcr中，待测样本的浓度优选为15μg/ml-60μg/ml。发明人测试了多个患猪传染性胸膜肺炎病apxi型的猪的dna模板浓度，测试结果与实施例9所得结果一致，由于篇幅所限，不一一赘述。综上，本发明经过多次试验优化，试剂盒的dna模板浓度优选为15-60μg/ml，试剂盒中引物的浓度优选为1.0ng/ml，试剂盒的检测体系优选为30-50μl，进一步优选30μl；试剂盒的工作条件为95℃预变性10min，95℃变性50s，50-60℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环，最后再72℃延伸10min，其中，退火温度优选为56℃-60℃。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。sequencelisting<110>江西农业大学<120>辅助鉴定猪传染性胸膜肺炎毒素的引物组合物及其应用<130>2017<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工合成序列<400>1tcggtcgtagcattagcg18<210>2<211>18<212>dna<213>人工合成序列<400>2gacatcccaacgctgttg18<210>3<211>22<212>dna<213>人工合成序列<400>3cttttttgttgtagaagcatcc22<210>4<211>21<212>dna<213>人工合成序列<400>4tcgtcaataggcgtaacagtt21<210>5<211>513<212>dna<213>pig<400>5tcggtcgtagcattagcgattagcccgctttcgttcttaaatgttgcggataagtttgaa60cgtgcgaaacagcttgaacaatattcggagcgctttaaaaagttcggttatgaaggtgat120agtttattagcttcattctaccgtgaaaccggtgcgattgaagcggcattaaccacgatt180aacagtgtgttaagtgcggcttccgcaggtgttggggctgctgcaaccggctcattagtc240ggtgcgccggtagcagctttagttagtgcaatcaccggtattatttcaggtattttagat300gcttctaaacaggcaatcttcgaacgagttgcaacgaaattagcgaataagattgacgaa360tgggagaaaaaacacggtaaaaactattttgaaaacggttatgacgcccgccattccgca420ttcttagaagatacctttgaattgttatcacaatacaataaagagtattcggtagagcgt480gtcgttgctattacgcaacagcgttgggatgtc513<210>6<211>1092<212>dna<213>pig<400>6cttttttgttgtagaagcatccggcaaacgctatattgaaaactttggtattgaacctct60tggtaagcaagaagattttgattttgtcggcggcttttggtctaacttagtgaatcgtgg120tttggaaagtattatcgacccatccggtatcggtggaacggtaaaccttaactttaccgg180cgaggtggaaacctacacgttagacgaaacaaggtttaaagcggaagcggcgaagaaaag240ccattggagtttagtgaatgcggcgaaagtatacggcggtttagaccaaattattaaaaa300actatgggacagcggctcaattaagcatttatatcaagataaagatacgggcaaattaaa360accgattatttacggcacggccggcaacgacagtaagattgaaggcactaaaatcacccg420taggattgcgggtaaagaagttacgcttgatattgccaatcagaaaattgaaaaaggcgt480gtcagagaaattggggctgtctgttagtggttcggatatcattaaattgttgtttggagc540attgactccaactttaaatagaatgttgctatcacaactcatccagtctttttccgatag600cttggctaaacttgataatcccttagccccttacactaaaaatggcgtggtttatgtcac660cggcaaagggaatgatgtgcttaaaggaactgaacatgaggatttgtttctcggtggtga720ggggaatgatacttattatgcgagagtaggcgatacaattgaagacgccgacggcaaagg780taaagtctattttgtgagagaaaaaggggtacctaaggcggatcctaagcgggtagagtt840tagcgagtacataacgaaagaagaaataaaagaggttgaaaaggggttattaacctacgc900agttttagaaaattataattgggaagagaaaacggcgactttcgctcatgcgactatgct960taatgagctttttactgattatactaattatcgttatgaagttaaaggactaaaattgcc1020cgccgttaaaaagttaaaaagtccgttggtggagtttacagctgatttattaactgttac1080gcctattgacga1092当前第1页12