一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的引物、试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于raa荧光法检测十二指肠钩虫的引物、试剂盒。

背景技术：

十二指肠钩口线虫(ancylostomaduodenale)，简称十二指肠钩虫，其成虫寄生在人体的小肠上段，以口囊内的钩齿咬附肠粘膜，以血液、淋巴液，脱落上皮细胞为食，虫体有不断更换咬咐部位的特点。由于机械性损伤，引起消化功能紊乱、患者出现腹部不适、腹痛、恶心、呕吐、腹胀、腹泻等症状，使患者长期慢性失血而导致贫血。钩虫病呈全球性分布，约7亿人感染，已成为非常严重的公共卫生问题。我国也是钩虫病流行较严重的国家，据2004年第二次全国人体重要寄生虫病现状调查显示，我国钩虫感染率为6.12％，感染人数高达3930万，并且这个数据没有减缓的迹象。

目前检测钩虫病的技术包括病原学检测技术、免疫学检测技术和分子生物学检测技术。钩虫病的病原学检测技术主要采用幼虫培养，虫卵检查和成虫检验等，最常用的方法是虫卵检查，tarafder等人利用虫卵检查方法检测5624份人粪便样本钩虫感染情况，该方法费时费力且需要专业经验，准确率也低，存在漏检问题(estimatingthesensitivityandspecificityofkato-katzstoolexaminationtechniquefordetectionofhookworms,ascarislumbricoides,andtrichuristrichiura,infectionsinhumansintheabsenceofa‘goldstandard’[j].internationaljournalforparasitology,2010,40(4):399-404)。酶联免疫沉淀技术是研究蛋白质间相互作用，其原理是将蛋白质视为抗原，并于抗体特异性结合，最终从成千上万种蛋白质中分离出指定蛋白质。quinnell等人利用该技术分析鉴定美洲钩虫，这种酶联免疫法存在灵敏度低的问题，检出率受到限制(theimmunoepidemiologyofhumanhookworminfection.[j].parasiteimmunology,2004,26(11‐12):443-454)。分子生物学检测技术主要是实时荧光定量pcr技术又称rt-pcr，其原理是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时检测。这种方法灵敏、特异、检出率高，但对人员要求及设备要求高，检测时间1.5～2小时。lamp技术是一种全新高效的基因诊断技术，其原理是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，运用一种具有链置换活性的dna聚合酶在65℃恒温条件下通过自动循环的链置换dna合成过程，反应约60min即可实现对靶dna的扩增，但存在假阳性高，引物探针设计复杂，不容易设计等问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的钩虫检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于raa荧光法检测十二指肠钩虫的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种基于raa荧光法检测十二指肠钩虫的试剂盒，包括raa基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品，还包括探针和上述方案所述的引物；

所述探针具有如序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列。

优选的，所述探针采用修饰基团进行修饰；所述修饰基团包括荧光报告基团和荧光淬灭基团；荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数32bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔3个碱基位置。

优选的，所述荧光报告基团包括fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5；

所述荧光淬灭基团包括tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl。

优选的，所述引物中上游引物和下游引物的浓度独立为0.05～0.1mmol/l。

优选的，所述探针的浓度为0.02～0.05mmol/l。

优选的，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为500mmol/l的tris-hcl缓冲液、浓度为250mmol/l的mgac和质量分数为20％的peg6000。

优选的，所述阳性质控品中含有十二指肠钩虫的基因组dna；所述十二指肠钩虫的基因组dna的浓度为1×10⁶iu/ml。

优选的，所述临界阳性质控品中含有十二指肠钩虫的基因组dna；所述十二指肠钩虫的基因组dna的浓度为1×10³iu/ml。

优选的，所述阴性质控品为为ddh2o或纯化水。

本发明提供了一种基于raa荧光法检测十二指肠钩虫的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。本发明提供的引物适用于raa荧光法检测，并且能够准确地检测出十二指肠钩虫，特异性达100％。

本发明还提供了一种基于raa荧光法检测十二指肠钩虫的试剂盒，所述试剂盒方便准确地鉴定十二指肠钩虫的存在，操作简便，检测时间短，仅需5～20min即可完成，无需通过高温使dna解旋，只需在30～42℃下进行等温扩增即可完成检测。所述检测方法快速、高通量，降低了鉴别时间和检测成本，研究表明本发明提供的基于raa荧光法检测十二指肠钩虫的试剂盒，具有特异性强的特点，特异性达100％，灵敏度为10²iu/ml。

同时，本发明提供的基于raa荧光法检测十二指肠钩虫的试剂盒，不需要大型仪器设备，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。

附图说明

图1为不同浓度标准dna的检测结果；

图2为十二指肠钩虫样本dna的检测结果；

图3为十二指肠钩虫的特异性检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种基于raa荧光法检测十二指肠钩虫的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。

本发明中，选择钩虫的特异性保守基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(ncbi)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得十二指肠钩虫5.8srrna基因序列，并进行多序列比对，从中选出一段保守序列，该序列如序列表中seqidno.4所示：

ccttactgcttgtgttggtggttgagcattaggctaacgcctgatgcggcacctgtctgtcaggaaaccttaatgatctgctaacgcggacgccagtacagcaataacttttwamgtttaatgtttgcagaatcgtgactttatgtcacaatcgactagcttcagcgatggatcggtcgattcgcgtatcgatgaaaaacgcagctagctgcgttatttaccacgaattgcagacgcttagagtggtgaaattttgaacgcatagcgccgttgggttttcccttcggcacgtctggttcaggkttgtttatatctactacagtgtagcttgtggca。

根据以上序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成dna质粒，质粒大小336bp；

采用raa技术引物及探针设计原则进行的设计，通过筛选和评价，确定上游引物：

5’-cttctgttggtggttgagcattaggctaacgc-3’(seqidno.1)；

下游引物：5’-tctaagcgtctgcaattcgtggtaaataacgc-3’(seqidno.2)。

本发明还提供了一种基于raa荧光法检测十二指肠钩虫的试剂盒，包括raa基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品、探针和上述方案所述的引物；

所述探针具有如序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列。

本发明提供的试剂盒包括引物。所述引物包括上游引物和下游引物。上游引物和下游引物的浓度独立优选为0.05～0.1mmol/l，更优选为0.08mmol/l。所述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

本发明提供的试剂盒包括探针。所述探针的浓度优选为0.02～0.05mmol/l，更优选为0.04mmol/l。所述探针具有如序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列。本发明中，所述探针优选采用修饰基团进行修饰。所述修饰基团优选包括荧光报告基团和荧光淬灭基团。所述探针的修饰方法优选包括：荧光报告基团修饰在探针中间；荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数32bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔3个碱基位置。

在本发明中，所述荧光报告基团优选包括fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5。所述荧光淬灭基团优选包括tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl。本发明中实施例中采用fam(6-carboxyfluorescein)为荧光报告基团，bhq(blackholequencher；phosphate:3’phosphatetoblockelongation)为荧光淬灭基团。修饰后的探针序列为：

5’-tgcagaatcgtgactttatgtcacaatcgac(fam－dt)a(thf)c(bhq-dt)tcagcgatggatcgg-3’，其中，fam为荧光报告基团，bhq为荧光淬灭基团，thf为四氢呋喃残基。所述探针由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

本发明提供的试剂盒包括raa基础荧光通用反应试剂。所述raa基础荧光通用反应试剂优选为经过低温冷冻干燥的冻干粉。本发明实施例中raa基础荧光通用反应试剂购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为f00001。

本发明提供的试剂盒包括反应缓冲液。所述反应缓冲液优选包括以下含量的组分：浓度为500mmol/l的tris-hcl缓冲液、浓度为250mmol/l的mgac和质量分数为20％的peg6000。本发明中，所述tris-hcl缓冲液、mgac和peg6000的浓度均为终浓度。本发明对所述tris-hcl缓冲液、mgac和peg6000的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明实施例中所述tris-hcl、和peg6000的购自sigma-aldrich，mgac购自国药沪试。

本发明提供的试剂盒包括阳性质控品。所述阳性质控品中优选含有十二指肠钩虫的基因组dna。所述十二指肠钩虫的基因组dna的浓度优选为1×10⁶iu/ml。本发明实施例中所述阳性质控品通过重组质粒转接大肠杆菌培养并提取。

本发明提供的试剂盒包括临界阳性质控品。所述临界阳性质控品中优选含有十二指肠钩虫的基因组dna。所述十二指肠钩虫的基因组dna的浓度优选为1×10³iu/ml。本发明实施例中所述临界阳性质控品通过重组质粒转接大肠杆菌培养并提取。

本发明提供的试剂盒包括阴性质控品。所述阴性质控品优选为ddh2o和纯化水，更优选为ddh2o。

在本发明中，上述方案所述的raa荧光法检测十二指肠钩虫的试剂盒的使用方法，优选包括如下步骤：

(1)提取待测样品的dna，得到dna提取液；

(2)将47μl反应缓冲液与1μl探针和1μl引物混合后添加到raa基础荧光通用反应试剂中混合；得到反应混合液；

(3)将1μl所述步骤(1)中得到的dna提取液与所述步骤(2)中得到的反应混合液混合，得到的反应体系进行恒温扩增，检测荧光信号；

所述恒温扩增的条件为：37～42℃反应5～20min；

(4)检测结果分析。

本发明中，提取待测样品的dna，得到dna提取液。本发明中对提取dna的方法没有特殊限定，采用常规方法提取即可，也可采用市售的提取试剂盒提取待测样品的dna或采用自动核酸提取仪进行dna提取。

本发明中，所述荧光检测优选采用检测fam荧光检测仪器进行实时raa荧光法反应，若在20min之内fam荧光检测仪器检测到信号增加，增加的荧光值达到本底值的30％以上为阳性；在20min之内fam荧光仪器信号无增加，判定为阴性。本发明对fam荧光检测仪的来源没有特殊限定。本发明实施例中采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的raa-f1620荧光检测仪。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

采用荧光报告基团(fam)和荧光淬灭基团(bhq)修饰探针；

修饰后的探针为：5’-tgcagaatcgtgactttatgtcacaatcgac(fam－dt)a(thf)c(bhq-dt)tcagcgatggatcgg-3’

试剂盒组成如表1所示：

表1试剂盒成分表

重组质粒转接大肠杆菌培养并提取出来的1.0×10¹⁰iu/ml十二指肠钩虫重组dna5μl稀释成不同梯度的工作标准品，分别为：

工作标准品1，含有1.0×10⁷iu/ml十二指肠钩虫的5.8srrna基因的非传染性dna片段。

工作标准品2，为阳性质控品。

工作标准品3，含有1.0×10⁵iu/ml十二指肠钩虫的5.8srrna基因的非传染性dna片段。

工作标准品4，含有1.0×10⁴iu/ml十二指肠钩虫的5.8srrna基因的非传染性dna片段。

工作标准品5，含有1.0×10³iu/ml十二指肠钩虫的5.8srrna基因的非传染性dna片段。

工作标准品6，含有1.0×10²iu/ml十二指肠钩虫的5.8srrna基因的非传染性dna片段。

反应缓冲液的配制：吸取376μl反应缓冲液，加入16μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.05mmol/，引物的浓度为1mmol/l)，充分混匀；得混匀后的缓冲液，每次吸取混匀后的缓冲液49μl分别加入到7个raa基础荧光通用反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均；

在7个配制好的raa基础荧光通用反应试剂试管中分别加入1μl阴性质控品、标准工作品6、标准工作品5、标准工作品4、标准工作品3、标准工作品2、标准工作品1为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl。将反应管放入荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应20分钟。检测结果如附图1所示。结果显示最快2分钟明显有扩增，10分钟内所有标准工作品均有扩增，重复以上方案3次，结果显示均能得到相同的扩增荧光信号，最低灵敏度可以达到1.0×10²iu/ml，表明本发明提供的检测方法重复性好；并将最终试剂盒的临界阳性质控品浓度确定为1.0×10³iu/ml。

实施例2

引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。

试剂盒组成如表2所示：

表2试剂盒成分表

样本来源及dna提取

样本由江苏省血吸虫病防治研究所提供，为十二指肠钩虫培养物，dna提取采用天根试剂盒，提取操作步骤按试剂盒说明书进行，提取好的dna在-80℃保存备用。

反应缓冲液配制：

取两个反应管，分别按如下操作，吸取47μl反应缓冲液，加入2μl探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μl试剂加入到raa基础荧光通用反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均；

在2个配制好的荧光反应试剂管中分别加入1μl阴性质控品、1μl提取好的样本dna为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl；

将反应管放入荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应20分钟。检测结果如附图2所示。结果显示6分钟明显有扩增，重复以上方法3次，均能得到相同的扩增荧光信号，结果表明本发明提供的检测方法重复性好。

实施例3

引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。

试剂盒组成如表3所示：

表3试剂盒成分表

样本来源及dna提取

样本由江苏省血吸虫病防治研究所提供，为十二指肠钩虫培养物，血吸虫样本为血吸虫虫卵，包虫样本为感染包虫的组织样本，肝吸虫样本为感染肝吸虫的鱼样本，dna提取采用qiagen试剂盒分别提取组织试剂盒和专用dna提取试剂盒，提取操作步骤按试剂盒说明书进行，提取好的dna在-80℃保存备用。

反应缓冲液配制：

取5个反应管，分别按如下操作，吸取47μl反应缓冲液，加入2μl探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μl试剂加入到raa基础荧光通用反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均；

在5个配制好的荧光反应试剂管中分别加入1μl阴性质控品、1μl提取好十二指肠钩虫样本dna、1μl血吸虫虫卵dna、1μl包虫样本dna、1μl肝吸虫样本dna为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl。

将反应管放入荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应20分钟。检测结果如附图3所示。结果显示只有十二指肠钩虫样本dna明显有扩增，其他样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性。重复以上方法3次，均能得到相同的扩增荧光信号，表明本发明提供的检测方法重复性好、特异性强。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>江苏省血吸虫病防治研究所

江苏奇天基因生物科技有限公司

<120>一种基于raa荧光法检测十二指肠钩虫的引物、试剂盒

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cttgtgttggtggttgagcattaggctaacgc32

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tctaagcgtctgcaattcgtggtaaataacgc32

<210>3

<211>51

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(51)

<223>n(34)=thf

<400>3

tgcagaatcgtgactttatgtcacaatcgactancttcagcgatggatcgg51

<210>4

<211>336

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccttactgcttgtgttggtggttgagcattaggctaacgcctgatgcggcacctgtctgt60

caggaaaccttaatgatctgctaacgcggacgccagtacagcaataacttttwamgttta120

atgtttgcagaatcgtgactttatgtcacaatcgactagcttcagcgatggatcggtcga180

ttcgcgtatcgatgaaaaacgcagctagctgcgttatttaccacgaattgcagacgctta240

gagtggtgaaattttgaacgcatagcgccgttgggttttcccttcggcacgtctggttca300

ggkttgtttatatctactacagtgtagcttgtggca336